专利名称：通过发酵的酸产生的制作方法
技术领域：
本发明涉及通过将含CO的底物进行微生物发酵产生乳酸。
背景技术：
乳酸是一种具有多种应用的平台化合物。在过去的十年中，乳酸已在洗涤行业中获得了重要性。乳酸具有除垢以及抗细菌性质，因此已被用作有益环境的清洁产品。此外，乳酸是用于一些生物可降解的聚合物(如聚乙酸)的前体。由于低二氧化碳排放，这些类型的塑料可提供替代由石油生产的常规塑料的良好选择。其他应用包括乳酸酯的前体，其可替代石油化学衍生的溶剂。乳酸通常通过发酵碳水化合物(如葡萄糖、果糖和蔗糖)来产生。虽然也使用其他细菌甚至酵母，但是最重要的市售乳酸发酵菌属是乳杆菌属(Lactobacillus)。在这类发酵 中，通过糖酵解作用产生丙酮酸，丙酮酸再经还原形成乳酸。这些碳水化合物原料的成本受其作为人类食物或动物饲料的价值影响。例如，用于乳酸生产的产淀粉或蔗糖的作物的栽培不是在所有地理条件下均为在经济上可持续的。因此，人们对于开发将低成本的和/或更丰富的碳源转化成乳酸的技术有兴趣。一氧化碳(CO)是有机材料(如煤或石油和石油衍生产物)不完全燃烧的主要副产物。虽然含碳前体的完全燃烧得到CO2和水作为仅有的最终产物，但是一些工业过程需要高温，相对于CO2更有利于一氧化碳的积累。一个实例是钢铁行业，其需要高温以生成所需的钢铁质量。例如，据报道，澳大利亚钢铁行业每年生成并向大气释放超过500，000吨CO。而且，CO还是合成气的主要成分，其中通过含碳燃料的气化作用生成不同含量的一氧化碳和氢气。例如，合成气可通过裂解废弃树木和木材的有机生物质产生，以生成用于生成燃料和更复杂化学物的前体。一氧化碳被释放到大气中可具有明显的环境影响。此外，可能需要支付排放税，增加工厂的成本。因为一氧化碳是富含反应能的分子，它可以被用作用于产生多种化学物的前体化合物。但是，这一有价值的原料目前还没有被用于生产乳酸。本发明的目的是提供一种至少部分克服以上缺点的方法，或至少为公众提供有用的选择。
发明内容
在一个方面，本发明提供了一种通过将含一氧化碳的底物进行微生物发酵而产生乳酸的方法。在具体实施方案中，本发明提供了一种通过微生物发酵产生乳酸的方法，该方法包括a.提供含CO的底物；b.在含有一种或多种微生物的培养物的生物反应器中，厌氧发酵所述底物以产生乳酸。在具体实施方案中，产生了每升发酵液至少O. 05克乳酸/天。在具体实施方案中，产生了至少O. I克乳酸/升/天；或至少O. 2克乳酸/升/天；或至少O. 3克乳酸/升/天；或至少O. 5克乳酸/升/天；或至少I. O克乳酸/升/天。在另一方面，本发明提供了一种通过发酵提高乳酸产生效率的方法，该方法包括 a.提供含CO的底物；b.在含有一种或多种微生物的培养物的生物反应器中，厌氧发酵所述底物以产生乳酸。在本发明的另一方面，提供了一种通过微生物发酵产生乳酸的方法，该方法包括a.提供底物b.在含有一种或多种微生物的培养物的生物反应器中，厌氧发酵所述底物，其中一种或多种微生物包含一个或多个乳酸脱氢酶基因；c.上调所述一个或多个乳酸脱氢酶基因，使得所述微生物产生乳酸。在具体实施方案中，所述底物包括一氧化碳。在多个方面的具体实施方案中，所述含一氧化碳的底物是含一氧化碳的气态底物。所述含一氧化碳的气态底物可作为工业过程的副产物获得。在一些实施方案中，所述工业过程选自铁金属产品制造、非铁金属产品制造、石油精炼过程、生物质气化、煤气化、电力生产、炭黑生产、氨生产、甲醇生产和焦炭制造。在一个实施方案中，所述气态底物包括从钢厂获得的气体。在另一个实施方案中，所述气态底物包括汽车尾气。 在具体实施方案中，所述含CO的底物通常包含大比例的CO，例如至少约20体积％至约100体积％的CO，40体积％至95体积％的CO，40体积％至60体积％的CO，以及45体积％至55体积％的CO。在具体实施方案中，所述底物包含约25体积％、或约30体积％、或约35体积％、或约40体积％、或约45体积％、或约50体积％、或约55体积％或约60体积％的CO。含更低浓度的CO，例如6%，的底物也可能是合适的，特别当还存在H2和CO2时。在多个方面的具体实施方案中，提供了足够水平的所述含一氧化碳的底物，使得可产生乳酸。在具体实施方案中，提供CO使得维持至少O. 4mmol/g/min、或至少O. 5mmol/g/min、或至少 O. Bmmol /g/min、或至少 O. 7mmo1 /g/min、或至少 O. 8mmo1 /g/min、或至少0. 9mmol/g/min、或至少 I. Ommol/g/min、或至少 I. 2mmol/g/min、或至少 I. 5mmol/g/min 的比摄入速率。在多个方面的一些实施方案中，所述方法包括使用一种或多种一氧化碳营养微生物经Wood-Ljungdahl途径进行微生物发酵。在具体实施方案中，所述微生物是梭菌,例如自产乙醇梭菌(Clostridium autoethanogenum)。在另一方面，本发明提供了一种通过微生物发酵产生乳酸的方法，该方法包括a.提供底物b.在包括自产乙醇梭菌培养物的生物反应器中，厌氧发酵所述底物以产生乳酸。在具体实施方案中，所述底物是一种或多种碳水化合物，例如果糖。或者，所述底物是含一氧化碳的底物，更优选为如上文所述的含一氧化碳的气态底物。在本发明的另一方面，提供了一种前述方面任一项的方法，其中所述方法还包括捕获或回收所述乳酸的步骤。
在另一方面，提供了通过前述方面任一项的方法产生的乳酸。本发明从广义上说还可以单独或综合地包括在本申请说明书中提及或指出的部分、要素或特征，其以两个或多个所述部分、要素或特征的任意或所有组合，并且当本文提及在本发明涉及领域中具有已知等同物的具体整体时，所述已知等同物被认为如同被单独提出一样被纳入本文。
图I的曲线图显示了根据实施例I所描述的本发明方法的乳酸产生。图2的曲线图显示了根据实施例2所描述的本发明方法的乳酸产生。图3的曲线图显示了根据实施例3所描述的本发明方法的乳酸产生。图4的曲线图显示了根据实施例4所描述的本发明方法的乳酸产生。 图5a、图5b和图5c的曲线图示出了实施例5中所描述的不同乳酸盐浓度对细胞生长和代谢物产生的影响。图5c中的图例也适用于图5a和图5b。
具体实施例方式下面是以总括的形式给出的对本发明的描述，包括本发明的优选实施方案。在下文中的标题“实施例”下所给出的公开内容中对本发明进一步举例说明，所述实施例提供了支持本发明的实验数据、本发明各方面的具体实例和实施本发明的方式。术语“乳酸(lactic acid)”和“乳酸盐(lactate)”在本文中可互换使用，二者包括2-羟基丙酸的所有立体异构体，包括(R)式、(S)式和消旋式。术语“生物反应器(bioreactor)”包括由一个或多个容器和/或塔或管道布置组成的发酵装置，所述发酵装置包括连续搅拌釜反应器(CSTR)、固定化细胞反应器(ICR)、滴流床反应器(TBR)、鼓泡塔、气升发酵罐、静态混合器、或其他适于气-液接触的其他容器或装置。如下文所述，在一些实施方案中，所述生物反应器可包括第一生长反应器和第二发酵反应器。因此，当提到加入底物，例如含一氧化碳的底物，到所述生物反应器或发酵反应中时，如果合适，应该理解为包括加入到这些反应器之一或两个中。术语“含一氧化碳的底物”及类似术语应理解为包括其中一氧化碳可被一株或多株细菌利用进行例如生长和/或发酵的任何底物。“含一氧化碳的气态底物”包括包含某一水平一氧化碳的任何气体。所述气态底物通常包含大比例的CO，优选地至少约15体积％至约95体积％的一氧化碳。除非上下文另外要求，本文所使用的短语“发酵”、“发酵过程”或“发酵反应”等意在包括所述过程的生长阶段和产物生物合成阶段。本发明人惊奇地表明，乳酸可以通过对含一氧化碳的底物进行微生物发酵来产生。令人吃惊地表明，乳酸可以由一氧化碳营养细菌通过发酵含CO的底物来产生。发明人已发现，发酵可产生数种产物，因此乙醇和乳酸是重要取代物。以前乳酸并没有被鉴定为是含CO的底物发酵的产物。根据本发明的方法，还令人惊奇地证明，乳酸可以由自产乙醇梭菌从含CO的底物尤其是含CO的气态底物产生。以前在发酵过程中使用气态碳源尤其是含CO的气态碳源没有导致乳酸产生。在本发明的具体实施方案中，乳酸产生的效率可以通过以使得乳酸可产生的足够水平提供底物来提高。已经认识到，增加提供至微生物培养物的底物量可增加所述培养物产生的乳酸的量。在本发明的具体实施方案中，以足够水平提供含CO的底物，使得乳酸可产生。已经表明，含自产乙醇梭菌的微生物培养物可以最高达约I. O至2mmol/g微生物细胞干重/min的速率摄入一氧化碳(比CO摄入)。在本发明的具体实施方案中，向含自产乙醇梭菌的微生物培养物提供含CO的底物，使得比摄入基本维持在或至少O. 4mmol/g/min、或至少O. 5mmol/g/min、或至少 O. 6mmol/g/min、或至少 O. 7mmol/g/min、或至少 O. 8mmol/g/min、或至少 O. Qmmol!g/min、或至少 I. Ommol!g/min、或至少 I. 2mmol/g/min、或至少 I. Smmol!g/min。在这些实施方案中，乳酸是至少O. 05g/L、或至少O. lg/L、或至少O. 2g/L、或至少O. 3g/L、或至少O. 4g/L、或至少O. 5g/L的重要发酵产物。在具体实施方案中，乳酸以至少O. 5g/L/天或至少lg/L/天的速率产生。在本发明的具体实施方案中，用于执行本发明方法的装置能够测量和/或控制参数，如CO供应、CO摄入、生物质水平、pH、乳酸产生。例如，可从生物反应器中取样以测定一 个或多个上述参数并任选地调节所述生物反应器状态以促进乳酸产生。例如，在生物反应器中，其中所述微生物培养物没有产生乳酸或产生少量乳酸，可以提高CO供应，使得乳酸产生。如Phillipsetal, 1994, Apped Biochemistry and Biotechnology, 45/46:145中所述，已经公认的是，产物例如乙酸和乙醇可经Wood-Ljungdahl途径由一氧化碳经乙酰辅酶A循环和THF循环的组合产生。但是，根据本发明的方法，令人吃惊地表明可产生乳酸，尤其在提供CO使得维持至少O. 4mmol/g/min、或至少O. 5mmol/g/min、或至少O. 6mmol/g/min、或至少 O. 7mmo1 /g/min、或至少 O. 8mmo1 /g/min、或至少 O. Qmmol /g/min、或至少 I. Ommol /g/min、或至少I. 2mmol/g/min、或至少I. 5mmol/g/min的比CO摄入速率的情况下。不希望囿于理论，发明人认为，通过提供足够的或增加的一氧化碳水平，在发酵过程中可以生成更高能量产物，例如乳酸。发明人认为，产物前体例如乳酸可作为电子受体，从而以NAD(P)H的形式减轻微生物细胞的过量还原能力，因此恢复有利的NAD (P) :NAD (P)H平衡。发明人还认为，所述培养物发酵的碳水化合物也可以以相似方式转化成乳酸。推定的具有981个碱基长度的NAD依赖型D-(-)-乳酸脱氢酶基因可在自产乙醇梭菌LZ1560 (在DSMZ以登录号为19630保藏的菌株)基因组序列中被鉴定到。所述单顺反子基因与梭菌属菌株IBUN 13A (登录号Nr.GQ_180219. I)和IBUN 158B (登录号Nr.GQ_180219. I)的部分D-(-)_乳酸脱氢酶基因IdhA显示了高同源性(74%同一性(486/656)，E-值为 2e_55)。核苷酸序列ATGAAAGTTTTGGCATATAGTCATAGACAAGATGAAACTGAATATTTCAAAAAATTCAGTAAAAAATACGACGTGGAGGTTGTATTGTGTGATGATCCACCAACTATGGAAAATGCAGACTTGGCCAAGGGATTTGACTGCATCAGCATTATCACAACTAAAATTTCAGATAAATTAGTAGAAAAATTTCATGAAATTGGAGTAAAATTTATATCTACAAGAACAATAGGATATGACCATATAGACATAAAAAAGGCAAAAGAGCTAGGTGTCCATATAGGCAATGTAAACTATTCACCAAATAGTGTAGCCGATTATACAATTATGATGATTCTTATG GCTATAAGAAAAACGAAAGCTATTATAGAACGAAGTAATGTACAGGATTATTCTTTAAAAGGTGTTCAAGGTAAAGAGCTTCACAATTTAACTGTAGGTGTTAT
TGGTACAGGAAGAATTGGCCGTGCAGTTATAAGTCGCTTAAGTGGATTTGGCTGCAAAATATTAGCTTATGATTTATATGAGAATGAAGAAATAAAGAAGTATGTTACATATGTTACACTAGAAGATCTCTTTAAAAACAGTGACATTATTACAATGCATGCACCTGCAACAGATGACAATTATCACATGATAAATAAGGATTCCATAGCACTTATGAAAGATGGTACATTTATTATCAATATAGCCCGAGGCTCACTTATCAATACTGAAGATCTTATAGATGCCATTGAAAATAAAAAAATTGGTGGTGCAGCTA
TAGACGTTATTGAAAATGAATTCGGACTTTGCTATAACGATTTAAAATGTGAGATACTAGATAAAAGGGAAATGGCAATTTTAAAATCTTTTCCAAATGTAATTGTAACACCTCACACAGCTTTTTATACAGATCAAGCTGTAAGTGATATGGTAGAACATTCTATTTTAAGTTGTGTTTTATTCATGGAAGGCAAAGAAAATCCATGGCAAATTGAATAA所述基因编码具321氨基酸的蛋白质，其与其他梭菌菌种(见表I)的α -酮酸脱氢酶(例如具有完全相同长度的丙酮丁醇梭菌(C. acetobutylicum)的乳酸脱氢酶)具有高度的同源性。COG (蛋白质的直系同源组聚类(Clusters of Orthologous Groups ofproteins))分析将该蛋白分配至“乳酸脱氢酶及相关脱氢酶”功能组(C0G1052)。蛋白质序列MKVLAYSHRQDETEYFKKFSKKYDVEVVLCDDPPTMENADLAKGFDCISIITTKISDKLVEKFHEIGVKFISTRTIGYDHIDIKKAKELGVHIGNVNYSPNSVADYTIMMILMAIRKTKAIIERSNVQDYSLKGVQGKELHNLTVGVIGTGRIGRAVISRLSGFGCKILAYDLYENEEIKKYVTYVTLEDLFKNSDIITMHAPATDDNYHMINKDSIALMKDGTFIINIARGS LINTED LIDAIENKKIGGAAIDVIENEFGLCYNDLKCEILDKREMAIL KSFPNVIVTPHTAFYTDQAVSDMVEHSILSCVLFMEGKENPWQIE*进一步的证据来自于对PR0SITE 数据库(Hulo N, et al, (2008) ‘The20years ofPR0SITE，Nucleic Acids Res 36:D245_249)和 Pfam 数据库(Finn et al (2010) ‘ThePfam protein families database’Nucleic Acids Res38:D211_222)进行的结构域搜索。PR0SITE搜索得到对“D-异构体特异性2-羟酸脱氢酶MD-结合标志”的两项强搜索结果(PS00065和PS00671 )，而从Pfam搜索鉴定了 “D-异构体特异性2-羟酸脱氢酶，催化结构域”和“D-异构体特异性2-羟酸脱氢酶，NAD结合结构域”，分别具有8. le-72和2. le-30的高E-值。根据其他NAD依赖型D-(-)_乳酸脱氢酶(EC1. I. I. 28)，所述蛋白质被提出可催化丙酮酸+NADH得到D-㈠-乳酸+NAD*的反应。
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wmmWMM-酮酸乳酸表I.自产乙醇梭菌LZ1560乳酸脱氢酶的最优蛋白质BLAST(Altschul etal. , (1990) “Basic local alignment search tool，，J Mol Biol 215:403-410)比对结果
权利要求
1.一种通过微生物发酵产生乳酸的方法，所述方法包括 a.提供含CO的底物； b.在含有一种或多种微生物的培养物的生物反应器中，厌氧发酵所述底物以产生乳酸。
2.一种通过发酵提高乳酸产生效率的方法，所述方法包括 a.提供含CO的底物； b.在含有一种或多种微生物的培养物的生物反应器中，厌氧发酵所述底物以产生乳酸。
3.权利要求I或2的方法，其中以足以使得乳酸产生的水平提供所述含CO的底物。
4.权利要求1-3任一项的方法，其中提供所述含CO的底物，使得维持所述培养物的至少O. 4mmol CO/克细菌干细胞重/min的CO摄入比速率。
5.权利要求4的方法,其中提供所述底物,使得维持至少O.6mmolC0/g/min的比摄入速率。
6.权利要求4或5的方法,其中提供所述底物,使得维持至少O.8mmol CO/g/min的比摄入速率。
7.权利要求4-6任一项的方法,其中提供所述底物,使得维持至少I.9mmol CO/g/min的比摄入速率。
8.权利要求4-7任一项的方法,其中提供所述底物,使得维持至少I.Ommol CO/g/min的比摄入速率。
9.一种通过微生物发酵产生乳酸的方法，所述方法包括 a.提供含CO的底物； b.在含有一种或多种微生物的培养物的生物反应器中，厌氧发酵所述底物，其中所述一种或多种微生物包括一个或乳酸脱氢酶基因； c.上调所述乳酸脱氢酶基因，使得所述微生物产生乳酸。
10.权利要求9的方法，其中所述底物包含CO。
11.权利要求9的方法，其中以足以使得乳酸产生的水平提供所述含CO的底物。
12.权利要求9-11任一项的方法，其中提供所述含CO的底物，使得维持所述培养物的至少O. 4mmol CO/克细菌干细胞重/min的CO摄入比速率。
13.上述权利要求任一项的方法，其中所述一种或多种微生物是自产乙醇梭菌(Clostridium autoethanogenum)。
14.权利要求1-12任一项的方法，其中所述含CO的底物是气态的。
15.权利要求14的方法，其中所述含CO的底物包含至少约15体积％至约100体积％的CO。
16.权利要求14或15的方法，其中所述含CO的底物包含从工业过程作为副产物获得的气体。
17.—种通过微生物发酵产生乳酸的方法，所述方法包括 a.提供底物 b.在包含自产乙醇梭菌培养物的生物反应器中，厌氧发酵所述底物以产生乳酸。
18.权利要求17的方法，其中所述底物包含一种或多种碳水化合物。
19.权利要求18的方法，其中所述方法包括在提供包含一种或多种碳水化合物的底物的步骤之前、同时或之后提供含CO的底物的另一步骤。
20.权利要求19的方法，其中所述方法包括将所述提供含CO的底物的步骤和所述提供含一种或多种碳水化合物的底物的步骤互换。
21.通过权利要求1-20任一项的方法产生的乳酸。
全文摘要
本发明提供了通过厌氧发酵产生乳酸的方法。根据本发明的具体方法，通过厌氧发酵包括氢和一氧化碳的底物而产生乳酸。
文档编号C12P7/56GK102791869SQ201180013225
公开日2012年11月21日 申请日期2011年3月10日 优先权日2010年3月10日
发明者S·D·辛普森 申请人:新西兰郎泽科技公司