干扰素α5的制备方法

专利名称：干扰素α5的制备方法
技术领域：
本发明涉及在生产IFNa5的大肠杆菌宿主细胞中通过表达来生产干扰素α 5(IFNa5)蛋白质的方法，其中该多肽链的N-末端的额外的甲硫氨酸残基的掺入以及其氧化类型的产生均为最小化的。IFNa5蛋白质可以使用有效的方法来纯化从而产生生物学上有活性的IFNa5。
背景技术：
干扰素(IFN)是ー组天然产生的多效糖蛋白，被称为细胞因子，不同种类的细胞(上皮细胞、成纤维细胞、淋巴细胞、巨噬细胞)在受到一系列的刺激(病毒、细菌、细胞、肿瘤和大分子)诱导之后会分泌产生，并且具有抗病毒、抗增殖和免疫调节特性以及镇痛作用。在内源产生或给药之后，干扰素与细胞表面的特异性受体相互作用，并开始信号从细胞质到达细胞核的转导，诱导编码具有抗病毒和免疫刺激活性的特定蛋白质的基因的表达。人们已经认识到了 IFN的医用潜力，如许可在人体上施用的ー些不同种类的IFN，例如作为药物来治疗多发性硬化的IFNla (Rebif，Avonex)、IFNlb (Betaseron)，以及作为药物来治疗恶性病(癌症)和病毒病的重组人IFNa2a (Roferon A)和IFNa2b (Intron A)。基于IFN通过其来传递信号的受体的种类，人IFN分为三个主要的类型，S卩，(i)IFN I型[所有的I型IFN结合到被称为IFN-α受体(IFNAR)的特异性的细胞表面受体复合体上(人类体中的 I 型 IFN 为 IFNa (IFN_a)、IFN^ (IFN-β)和 IFN ω (IFN-ω)]，(ii)IFN II 型[II 型 IFN 结合到 IFN-Y 受体(IFNGR)(人体中的 II 型 IFN 为 IFNy (IFN- Y )],以及IFN III型[III型IFN通过由IL10R2和IFNLRl组成的受体复合体传递信号]。被称为I型IFN的IFNa和β在结构上相关，在酸性pH中稳定，并且竞争相同的细胞受体(IFNAR)。目前，IFNa、β和Y可以通过重组的形式来制备，这具有双重优势，可以获得比通过从天然来源(白细胞、成纤维细胞、淋巴细胞)分离的高出很多数量的产物，并且降低了纯化和检测产物安全性的方法的复杂程度。事实上，大部分市售药用级重组体IFN是由大肠杆菌产生并纯化获得的。大肠杆菌重组蛋白质表达系统已经是，并且仍然是，生产IFN所选择的系统。实际上，IFN基因没有内含子，并且蛋白质产物一般是非糖基化的。而且，大肠杆菌可以迅速地生长到高细胞密度，并且被用来生产重组蛋白质的菌株已经进行了遗传修饰，从而一般认为其对于大規模的发酵是安全的。IFN cDNA的表达是在其最初被克隆之后不久在大肠杆菌中直接完成的[Goedell等 Nature. , 287, 411-416，1980 ；Pestka, S. Arch. Biochem. Biophys. , 221 (I), 1-37, 1983 ；Mizoguchi 等 DNA.，4，221-32，1985 ；Pestka 等 Ann. Rev. Biochem.，56，727-777，1987 ；Baron 和 Narula. Critical reviews in Biotechnology, 10 (3)，179-190，1990]。事实上，IFNa (IFNa)是最先通过大肠杆菌用DNA重组技术的方法产生的蛋白质之ー [Derynck等，Nature, 287, 193-197，1980 ；Nagata 等，Nature, 284, 316-320，1980]。
然而，IFN在大肠杆菌中的表达显示出了ー些问题。在大肠杆菌中大量表达的IFN经常沉淀形成不溶的被称为包涵体(IB)的聚集体[Swaminathan等，Prot Express.Purif. 15, 236-242, 1999 ；Bedarrain 等，Biotechnol. Appl. Biochem. , 33, 173-182，2001 ；Srivasta 等 Prot. Express. Purif 41, 313-322，2005]简言之，一般情况下，形成错误折叠的蛋白质，因此在生物学上不具有活性[Villaverde和Carrio, Biotechnol.Lett. , 25, 1385-1395, 2003] 0为了得到天然形式的蛋白质，需要将所述的IB进行变性处理，随后进行复性、氧化，如果那样的话，需要形成如在天然蛋白中的ニ硫键。而且，靶蛋白序列(例如，IFN) N-末端的另外的甲硫氨酸残基的掺入是在大肠杆菌中表达蛋白质的ー个特征。众所周知，分布在蛋白质序列中的甲硫氨酸残基易于氧化。这些步骤可能发生在生产蛋白质或包含所述蛋白质的药物组合物(如果其能被用作药物，例如IFN)的过程中，并且更多发生在高温下长期保存的时期内。虽然已经开发了多种在细菌中生产和纯化IB形式的IFN的方法[例如，Thatcher 和 Panayotatos, Methods Enzymol. 119,166-177, 1986 ；US4511502;US 4765903 ；US4845032 ；EP 1310559 ;或EP 1990349]，但是还存在阻碍成功生产和IFN，即治疗水平的IFN的其他因素，例如必须清除在目标IFN的N-末端掺入的额外甲硫氨酸残基以及产生的其氧化类型(如果该产物用作药)，因此降低了 IFN生产的总得率，増加了纯化过程的复杂性，并且使得生产和纯化治疗水平的a IFN的方法很费力。因此，仍需要能够在大肠杆菌宿主细胞中以高得率和经济有效的方式来生产治疗水平的IFNa，特别是IFNa5的方法。发明概述发明人出人意外地发现，发酵培养基中的微量元素(痕量元素)的浓度在IFNa5的翻译后修饰中起了重要的作用。因此，控制发酵培养基中的微量元素的浓度，可能使产生IFNa5的大肠杆菌宿主细胞中IFNa5的N-末端的额外的甲硫氨酸残基的掺入最小化，并且使其氧化类型的产生最小化，提高产品得率并简化纯化过程，因此使得在产生IFNa5的大肠杆菌宿主细胞中以经济有效复杂度低的方法来生产和纯化IFNa5，即治疗水平的IFNa5。实施例4示出了氧化甲硫氨酸化的人IFNa -5(hIFNa5)形式的形成被有效清除，并且こ酰化的hIFNa5形式的量降低了两倍(即成为原来的一半)，其中I升(L)的碳料液包含大约3. OmL至大约3. 7mL的微量元素原液，并且，优选地，在诱导之后的平均特定培养物生长率(μ)等于或大于O. 17。因此，一方面，本发明涉及在产生IFNa5的大肠杆菌宿主细胞中表达干扰素α 5 (IFNa5)蛋白质的方法，其包括a)提供一种产生IFNa5的大肠杆菌宿主细胞；b)在通过所述产生IFNa5的重组大肠杆菌宿主细胞中有效表达所述IFNa5蛋白的条件下，在发酵培养基中培养该产生IFNa5的大肠杆菌宿主细胞，所述发酵培养基添加碳料液，其中-所述发酵培养基不含动物来源或酵母来源的组分，并且-所述碳料液包括碳源以及每升添加的碳料液中大约3.O至大约3. 7mL的微量元素溶液；并且c)分离和任选地纯化表达的IFNa5蛋白质。
在ー个特定的具体实施方式
中，所述大肠杆菌宿主细胞是大肠杆菌蛋白酶缺陷型菌株，如大肠杆菌Ion_/ompT_蛋白酶缺陷型宿主菌株,优选为大肠杆菌BL21菌株,最优选大肠杆菌BL21(DE3)菌株。在另ー个特定的具体实施方式
中，当大肠杆菌菌株是大肠杆菌BL21(DE3)菌株时，步骤b)的条件包括用IPTG诱导。在另ー个特定的具体实施方式
中，步骤c)分离和纯化表达的IFNa5蛋白质包括依次地，在裂解大肠杆菌宿主细胞之后，通过将所述IB进行增溶来分离所述的包涵体形式的IFNa5蛋白质(IB)，并将获得的混合物进行氧化复性，以及进行连续的一系列色谱法，以获得纯化的IFNa5，所述色谱法包括I)将包括复性的IFNa5的混合物进行疏水作用层析；2)将步骤I)获得的溶液进行阴离子交换色谱； 3)将步骤2)获得的溶液进行第一阳离子交换色谱；并且4)将步骤3)获得的溶液进行第二阳离子交换色谱，任选地，其中所述溶液用包括甲硫氨酸的缓冲液进行稀释，在ー个特定的具体实施方式
中，所述IFNa5是，优选是，人IFNa5 (hIFNa5)。


图I示出了构建IFNa5产生菌株的流程图。图2示出了初始质粒DNA pET28_IFN α -5的限制性内切酶酶切分析結果。泳道1-3和5-7 pET28-IFN α -5的限制性内切酶酶切分析；泳道I和5 pET28-IFN α -5/BamHI ;泳道 2 和 6 pET28-IFN a -5/NdeI ;泳道 3 和 7 :pET28_IFN a -5/NdeI+BamHI ；泳道 4 和 8 pET28-IFN α-5，未切害I]。DNA 分子标记(Gene Ruler DNA LadderMix, Fermentas, Lithuania)条带的大小以千碱基对(kbp)来表示。图3示出了中间物质粒IFN α-5的限制性内切酶酶切分析结果。该质粒源于单克隆。DNA 分子标记(Gene Ruler DNA Ladder Mix, Fermentas, Lithuania)条带的大小以kbp表示。预期的片段大小(以bp计)在括号内给出。泳道I :pUC57-IFN α-5/PstI (28 ；3197);泳道 2 :pUC57_IFN a -5/PvuII (455 ；406 ；2364);泳道 3 :pUC57_IFN α -5/NdeI(250 ；2975)。图4示出了为了在大肠杆菌中优化表达，通过用在大肠杆菌中使用频率最少的密码子替换掉ー些密码子之后的人IFN a-5(hIFNa5)编码片段的完整核苷酸序列。核苷酸置换处加了下划线。图5示出了质粒pET21-IFN α-5.的限制性内切酶酶切分析结果。该质粒源于单克隆。DNA 分子量标准(Gene Ruler DNA Ladder Mix, Fermentas, Lithuania)的条带大小以kbp指示。预期的预计的片段大小(以bps计)在括号中给出。泳道I :pET21-IFNa -5/PagI (673 ；;817 ；; 1008 ；; 3423);泳道 2 :pET21_IFN a -5/PstI (1352 ；4569);泳道 3 PET21-IFN a -5/NdeI+BamHI(516 ；5405)。图6示出了重组IFNa5蛋白质的表达。从9个克隆中(1_9)挑选出的大肠杆菌BL21(DE3)pET21-IFN α-5的细胞培养物在750mL烧瓶中37° C下培养(LB培养基，体积250mL)，直到0D600大约I. 2。靶蛋白的表达用ImM IPTG诱导2. 5小时。总的细胞蛋白质样品与BioRad蛋白质标记(在左侧以kDa为单位表示)一起进行15%SDS_PAGE，之后用考马斯蓝染色。图7示出了重组hIFNa5的生物合成的流程图。图8示出了在hIFNa5蛋白质的还原(图8A)和非还原(图8B)条件下，通过SDS-PAGE (14%)测得的根据本发明的步骤和配方来制备的重组hIFNa5的纯度(该图示出了3个大規模的纯化批次的hIFNa5蛋白质的結果)。图9示出了通过“反相-高效液相色谱(RP-HPLC)分析测得的根据本发明的步骤和配方来制备的重组hIFNa5的纯度(该图示出了 3个大规模批次的重组hIFNa5的結果)。图10示出了通过“分子筛-HPLC” (SE-HPLC)分析测得的根据本发明的步骤和配方制备的重组hIFNa5的纯度(该图示出了 3个大规模批次的重组hIFNa5的結果)。图11示出了通过等电点聚焦电泳测得的根据本发明的步骤和配方制备的重组hIFNa5的纯度(该图示出了 3个大规模批次的重组hIFNa5的結果)。泳道1，11 pl标准品(Amersham Pharmacia);泳道 2,3,4 :重组 hIFNa5,15 μ g ;泳道 5,6,7 :重组 hIFNa5, 5 μ g ；泳道 8，9，10 :重组 hIFNa5，ly g。图12示出了 3个大規模生产批次的根据本发明纯化和配制的重组hIFNa5制剂的肽段图色谱。
发明详述 为了更好地理解本发明，在此提供了本发明中使用的一些术语和表述的含义。此处使用的术语“干扰素α 5” (或“IFNα 5”或“IFNa”)指的是ー种由白细胞产生的蛋白质，白细胞主要涉及抗病毒感染的先天的免疫应答，能够结合到称为IFNa受体(IFNAR)的特异性细胞表面受体复合体上。IFNa5蛋白质，在例如TO 83/02459 (hIFNa5)中进行了描述。术语“IFNa5”包括这样的蛋白质,该蛋白质具有⑴至少实质上与天然IFNa5蛋白质的氨基酸序列相同的氨基酸序列以及(ii)具有与天然IFNa5共同的生物活性。实质相同的氨基酸序列的意思是序列相同或有一或多个氨基酸改变而不同(即，缺失、添加、替换)，这些改变没有使得该人工合成蛋白质和天然IFNa5之间产生不利的功能差异，例如，IFNa5蛋白质与引用的IFNa5蛋白质具有至少70%的同一性。IFNa5蛋白质(P)和參考的IFNa5蛋白质(R)之间的X%的同一性，意思是当两个序列比对时，P的X%的氨基酸与R的对应的氨基酸序列相同，或由相同基团的氨基酸取代，例如非极性R基团的氨基酸丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、甲硫氨酸；不带电荷的极性R基团氨基酸甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天门冬酰胺、谷氨酰胺；带电荷的极性R基团氨基酸(在pH 6. O时带负电荷)天冬氨酸，谷氨酸；碱性氨基酸(在pH 6. O时带正电荷)赖氨酸、精氨酸、组氨酸(在pH 6. O)；具有苯基的氨基酸苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸。特别优选的保守置换为赖氨酸与精氨酸的互換，从而可保持正电荷；
谷氨酸和天冬氨酸的互換，从而可保持负电荷；丝氨酸和苏氨酸的互換，从而保持游离-OH ；以及谷氨酰胺和天冬酰胺的互換，从而保持游离的NH2。这些序列同一性的百分比可通过使用BLAST程序来获得(blast2seq，缺省參数)[Tatutsova 和 Madden, FEMS Microbiol. Lett. , 174, 247-250(1990)]。此处使用的术语“产生IFNa5的大肠杆菌宿主細胞”指的是这样一种大肠杆菌宿主细胞，其已经进行了遗传工程改造，以生产具有与IFNa5相关的生物活性的蛋白质。在ー个特定的具体实施方式
中，大肠杆菌宿主细胞是大肠杆菌蛋白酶缺陷型菌株，例如大肠杆菌Ion_/ompT_蛋白酶缺陷型宿主菌株,优选为大肠杆菌BL21菌株,最优选大肠杆菌BL21(DE3)菌株。
此处使用的术语“IFNa5的牛物活件”指的是所述IFNa5的任意的生物活性，包括所述IFNa5的治疗活性。WO 83/02459公开了 IFNa5显示了抗DNA和RNA病毒的抗病毒活性，细胞生长活性和调节细胞内酶和其它细胞产生物质的生产；因此，可以推测IFNa5可用来治疗病毒感染(例如慢性こ型肝炎感染)，肿瘤和癌症。此处使用的表述发酵培养基为“不含动物来源或酵母来源的成分”指的是没有通过医药产品引起海绵状脑的传染因子的风险，没有任何证据证明有与药物产品有关的BSE污染或vCJD的情形。产品不含有来自酵母细胞的痕量的污染蛋白质。牛产IFNa5的方法一方面，本发明涉及在产生IFNa5的大肠杆菌宿主细胞中通过表达来生产干扰素a 5(IFNa5)蛋白质的方法，下文称为“本发明的方法”，其包括a)提供一种产生IFNa5的大肠杆菌宿主细胞；b)在通过所述产生IFNa5的重组大肠杆菌宿主细胞中有效表达所述IFNa5蛋白的条件下，在发酵培养基中培养该产生IFNa5的大肠杆菌宿主细胞，所述发酵培养基添加碳料液，其中-所述发酵培养基不含动物来源或酵母来源的成分，并且-所述碳料液包含碳源和每升添加的碳料液中大约3.O至大约3. 7mL的微量元素溶液；以及c)分离，以及任选地纯化,该表达的IFNa5蛋白质。可根据本发明的方法生产的重组IFNa5在前文中已经定义过。在ー个特定的具体实施方案中，所述可根据本发明的方法生产的重组IFNa5是ー种与天然IFNa5实质上相同的IFNa5蛋白质，S卩，由产生IFNa5的大肠杆菌宿主细胞产生的蛋白质，该细胞已经使用IFNa5编码基因或其修饰体进行了转化，其编码的蛋白质具有(I)氨基酸序列至少实质上与天然IFNa5的氨基酸序列相同以及(2)与天然IFNa5共有的生物活性。在一个优选的具体实施方案中，所述IFNa5是hIFNa5。在ー个更优选的特定的具体实施方式
中，根据本发明的方法生产的重组IFNa5为具有SEQ ID NO 1 (图4)所示的氨基酸序列的IFNa5，其对应于在多肽链的N-末端有额外甲硫氨酸残基的成熟的hIFNa5。根据本发明的方法，提供了一种产生IFNa5的大肠杆菌宿主细胞[步骤a)]。虽然，原则上，任意大肠杆菌菌株均可用于本发明的方法中，在一个优选的具体实施方案中，该大肠杆菌宿主细胞是大肠杆菌蛋白酶缺陷型菌株，例如大肠杆菌IorT/ompr蛋白酶缺陷型宿主菌株，优选为大肠杆菌BL21菌株，最优选大肠杆菌BL21(DE3)菌株。产生IFNa5的大肠杆菌宿主细胞可以通过常规的用于克隆和表达IFNa5的方法和步骤来获得[例如，Sambrook 等 Molecular cloning: ALaboratory Manual. Seconded. , CSH Laboratory, Cold Spring Harbor, 1989 ；Current Protocols in MolecularBiology, vol. 1-3 (Ausubel F. M.等,ed. ) John Wiley & Sons, Inc. , Brooklyn, NewYork, 1994-1998]。在ー个特定的具体实施方案中，IFNa5编码基因的克隆和表达以及产生重组IFNa5蛋白质的菌株(即，产生IFNa5的大肠杆菌宿主细胞)的构建可以按照下述方法进行，所述方法包括克隆编码IFNa5的cDNA基因，修饰所述基因的DNA序列以优化其在大肠杆菌中的表达，构建表达质粒，将该选择质粒转化入合适的大肠杆菌菌株中以及选择表达/诱导条件。实施例I公开了产生hIFNa5的大肠杆菌宿主细胞的构建。在ー个特定的具体实施方案中，当大肠杆菌宿主细胞是大肠杆菌蛋白酶缺陷型菌株，例如大肠杆菌BL21 (DE3)菌株吋，所述宿主细胞用包含在诱导型启动子控制之下的编 码IFNa5蛋白质的序列的载体进行了转化；在该方案中，蛋白质的表达需要添加诱导物，例如，举例来说，异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)。因此，根据ー个特定的具体的实施方式，当大肠杆菌宿主细胞是大肠杆菌BL21菌株，例如大肠杆菌BL21 (DE3)菌株吋，步骤b)的条件包括用IPTG诱导。在本发明的方法的步骤b)中，在通过所述产生IFNa5的重组大肠杆菌宿主细胞中有效表达所述IFNa5蛋白的条件下，在发酵培养基中培养该产生IFNa5的大肠杆菌宿主细胞，所述培养基添加碳料液，其中-所述发酵培养基不含动物来源或酵母来源的成分，并且-所述碳料液包含碳源和每升添加的碳料液中大约3.O到大约3. 7mL的微量元素溶液；以及产生IFNa5的大肠杆菌宿主细胞表达所述IFNa5蛋白质需要培养的有效条件，通常来讲，是本领域技术人员已知的。所述条件包括发酵培养基，其包括氮源、碳源和金属离子，适合培养大肠杆菌宿主细胞，并包含附加条件，根据本发明，所述发酵培养基不含有动物来源或酵母来源的组分，例如合成的化学发酵培养基。在ー个特定的具体实施方式
中，磷酸氢ニ铵和氨，单独或组合使用，可以用作氮源。在另ー个特定的具体实施方案中，碳源可以是柠檬酸、葡萄糖，或其组合。实施例2公开了培养产生IFNa5的产生大肠杆菌BL21 (DE3)菌株的ー种发酵培养基，所述培养基包括磷酸氢ニ铵、硫酸镁、磷酸ニ氢钾、柠檬酸、D(+)_葡萄糖和微量元素原液，其中所述微量元素原液包含选自由铁、钙、锌、锰、铜、钴、钥、硼及其组合组成的微量元素组中的微量元素。在ー个特定的具体实施方式
中，所述发酵培养基包括微量元素源，其选自由氯化铁(III)、氯化钙、硫酸锌(II)、硫酸锰(II)、硫酸铜(II)、氯化物钴(II)、钥酸钠、硼酸及其组合组成的微量元素源组中的微量元素。在ー个特定的具体实施方式
中，该微量元素(痕量元素)原液包含(g/L):六水合氯化铁(III) (30. O)、ニ水合氯化钙(4. 05)、七水合硫酸锌(II) (6. 75)、一水合硫酸锰(II) (I. 5)、五水合硫酸铜(II) (3. O)、六水合氯化钴
(II)(I. 14)、ニ水合钥酸钠(O. 3)和硼酸(O. 69)[实施例4]。本发明的方法的另ー个特征是碳料液包括碳源和每升添加的碳料液中添加从大约3. OmL至大约3. 7mL的微量元素溶液。所述微量元素溶液的详情在上文已经进行了定义。在ー个特定的具体实施方案方式中，碳料液包括碳源(例如，柠檬酸和/或葡萄糖)，硫酸镁和，根据本发明，浓缩的微量元素溶液，添加浓度为每升碳料液大约3. OmL到大约3. 7mL的微量元素溶液。如上所述，实施例2和4公开了微量元素储原液包括选自由铁、钙、锌、锰、铜、钴、钥、硼和其组合组成的微量元素组中的微量元素；在ー个特定的具体的实施方式中，所述微量元素原液包括氯化铁(III)、氯化钙、硫酸锌(II)、硫酸锰(II)、硫酸铜(II)、氯化钴(II)、钥酸钠、硼酸和其组合。在ー个特定的具体的实施方案方式中，所包括的微量元素储原液包括浓度为每升碳料液中大约3. OmL到大约3. 7mL的微量元素溶液，是实施例2和4中公开的微量元素储原液。实施例2公开了由生产生菌株生物合成hIFNa5的方法。发明人进行的不同的研究显示了微量元素在重组IFNa5 (例如，hIFNa5)的翻译后修饰中的影响，即，在大肠杆菌中产生的重组IFNa5(例如重组hIFNa5)的纯化的API中发现的氧化的-甲硫氨酸的相对量与在多肽链的N-末端的“未处理的甲硫氨酸”的数量紧密相关。为了获得小于10%的N-末端上的所述的“未处理的甲硫氨酸”，再折叠之后的氧化-甲硫氨酸IFNa5的数量(由RP-HPLC确定)的组成将不超过1%。 在优化重组hIFNa5生物合成方法的过程中，发明人注意到了发酵培养基中的微量元素的浓度在hIFNa5的翻译后修饰上具有重要的影响。事实上，当IL碳料液包含
3.OmL-3. 7mL 所述的微量元素原液时或当在 O. 0048mL/L/o. u_0. 0070mL/L/o. u. [o. u.:光学単位]的限度内时，确定了氧化甲硫氨酸hIFNa5形式(氧化-甲硫氨酸hIFNa5)的形成被消除，并且こ酰化hIFNa5形式的数量減少了两倍(一半)。在ー个特定的具体实施方式
中，本发明的方法在如下条件下进行，其中在诱导之后的平均“特定培养物生长速率”(μ)等于或高于O. 17[μ ((In 0D2-In0Dl)/T2-Tl))，其中OD是“光密度”(光学単位，o. u. )，T是“时间”)。发明人进行的研究显示了培养物生长和微量元素的浓度是紧密相关，特别是当微量元素的浓度极低/接近极限吋。当培养基中的微量兀素的浓度低于O. 95mL/L最终悬浮液体积(实施例4,表3)或低于3. OmL/L碳料液时，在诱导之后的平均μ仅达到0.121-0.158，目卩，小于0.17(] -83、]\1-84、]\1-85、]\1-86)。然而，当诱导之后的平均μ小于O. 17时，实际上氧化甲硫氨酸IFNa5形式会的出现是许可的。培养基中微量元素的浓度高于I. 23mL/L最终悬浮液体积时使得生长更快(M_89，M-90), WCff更大和こ酰化IFNa5形式+未知的蛋白质数量更大。然而，当诱导之后的平均μ等于或高于O. 17吋，该方法运行良好，直到微量元素的浓度高于O. 123mL/L最终悬浮液体积或高于
3.7mL/L碳料液。本发明的方法的步骤c)包括分离，以及任选地纯化，该表达的IFNa5蛋白质。在ー个特定的具体实施方式
中，在裂解产生IFNa5的大肠杆菌宿主细胞后，分离包涵体形式(IB)的IFNa5蛋白质，通过将所述IB进行增溶来形成包含变性IFNa5的混合物，之后进行氧化复性处理来形成包含复性的IFNa5的混合物，随后进行纯化过程以获得相应的纯化的IFNa5。在ー个特定的具体实施方式
中，所述IFNa5是，优选为hIFNa5。为了分离和纯化根据本发明的方法表达的IFNa5，首先裂解产生IFNa5的大肠杆菌宿主细胞，以分离包涵体形式(IB)的所述重组IFNa5。简言之，在ー个特定的具体实施方式
中，产生IFNa5的大肠杆菌宿主细胞的细胞膜通过使用传统方法，例如均质化，超声处理，或压カ循环等来进行裂解。优选的方法包括超声处理或使用Poter’ s均质器(特氟隆/玻璃)的均质化处理。在细胞被裂解之后，从裂解物的液相中分离包含IFNa5的IB，例如通过离心，以及再悬浮在适当的缓冲溶液中。IB可任选地通过洗涤来移除其中任何的水溶性的大肠杆菌蛋白质。之后，所述IB在存在增溶剂的情况下溶解，所述增溶剂例如促溶剤，如，蛋白变性齐U，其分解氢键并影响蛋白质的三级和ニ级结构，引起蛋白质的展开，溶解一般在水缓冲溶液中进行，以产生包含变性IFNa5的混合物。说明性的、非限定的促溶剂的例子包括尿素和盐酸胍(GdmHCl)，优选盐酸胍，一种强的促溶剂，其抑制多肽链的甲氨酰化作用(该作用在使用浓缩尿素溶液时可能发生)。促溶剂的浓度将依赖于特定的使用的促溶剂和微孔材料的数量。优选的盐酸胍溶液浓度为6-7M，最优选使用6M。pH可通过添加适当的缓冲液进行调节，并且，优选地，PH将高于7，一般地，等于或高于大约8，优选地，等于或高于8. 6，更优选地，在9. 55和9. 65之间，包含促溶剤。通常，在一个优选的具体实施方式
中，IB溶解作用是在与再折叠步骤中相同的PH下进行的，因此避免了再折叠步骤中另外调节溶解pH。在溶解包含IFNa5的IB之后，分离不溶微粒物并弃去。出现在包含变性IFNa5的 混合物中的变性IFNa5通过在复性溶液例如复性缓冲液中稀释所述混合物来进行复性。在ー个特定的具体实施方式
中，所述复性缓冲液包含活化试剂(例如，L-精氨酸等)，氧化还原对(例如，GSH/GSSG等)，以及，任选的，螯合化合物，在pH高于7. O的缓冲体系中，一般地，等于或高于大约8，优选的，等于或高于8. 6，更优选的，在9. 55和9. 65之间。在复性之后，包含正确折叠的IFNa5的得到的蛋白质溶液通过常规方法澄清，例如，离心或过滤，以除去任意剰余的微粒物。然后，如有必要，该澄清蛋白质溶液的PH用合适的酸(例如，HCl)调节到8. 0-8. 20，包含复性IFNa5的混合物(蛋白质溶液)随后可以用任意合适的方法来纯化IFNa5。虽然实际上可以使用任意的IFNa5的纯化方法，本发明进一歩提供了一种纯化IFNa5的有效的方法，其包括将复性IFNa5进行ー个4步的色谱方法，包括I)将包含复性的IFNa5的所述混合物进行疏水作用层析；2)将步骤I)中获得的溶液进行阴离子交换色谱；3)将步骤2)获得的溶液进行第一阳离子交換色谱；以及4)将步骤3)获得的溶液进行第二阳离子交换色谱，其中所述溶液，任选地，用包含甲硫氨酸的缓冲液稀释。简言之，将在氧化复性处理之后的包含蛋白质池的pH调节、澄清的蛋白质溶液，在步骤I)中，上样于苯基琼脂糖柱中以将复性的IFNa5与其它的成分分离，例如，残留的促溶剂等。另外，使用吸附剂的疏水性表面接触复性的IFNa5，其更有利于IFNa5的成熟。然后，在步骤2)中，对在步骤I)中获得的蛋白质池调节电导率(例如，
13.00-14. 00mS/cm),并且调节pH到8. 75-8. 85，然后上样于Q-琼脂糖(阴离子交换色谱)从而将IFNa5単体与其聚集形式分离。具有特定纯度的组分(例如等于或高于55%)可以收集来进行进一步的纯化。随后，在步骤3)中，调节步骤2)中获得的蛋白质池的电导率(例如，6. 00-7. OOmS/cm)，并且将pH调节为5. 15-5. 20，然后将其上样于SP-琼脂糖柱(第一阳离子交换色谱)以将主要的IFNa5形式与带电荷的异构体例如N-甲硫氨酰基IFNa5和こ酰化IFNa5(其是翻译后修饰产物的形式)分离。具有特定的纯度(例如，等于或高于70%)的部分可以收集来进行进一步的提纯。最后，在步骤4)中，调节在步骤3)获得的蛋白质池的电导率(例如，6. 00-7. OOmS/cm),并将pH调节至5. 00-5. 20，然后上样于第二 SP-琼脂糖柱(第二阳离子交换色谱)来将主要的IFNa5形式与带电荷的异构体分离。在ー个具特定的体实施方式中，在上样溶液中添加L-甲硫氨酸以避免在室温下进行色谱的过程中IFNa5的氧化。以这种方式收集组分，可实现IFNa5纯度等于或高于(>)95% (由RP HPLC确定)。如果需要，这样获得的IFNa5可用药学上可接受的介质和赋形剂，例如，磷酸钠，pH 6.80-7. 20，包含氯化钠，来进行配制。如果需要，蛋白质溶液可以浓缩到需要的浓度，例如，在ー个特定的具体实施方式
中，蛋白质溶液浓缩到了 10mg/mL,例如，到I. 0-1. 5mg/mL蛋白质浓度，使用超滤法进行缓冲液更换，通过最大孔径O. 22 μ m的无菌过滤器来进行无菌过滤从而达到灭菌的效果。实施例3公开了从产生hIFNa5的菌株中分离纯化hIFNa5的方法。 以下的实施例用于进一歩解释本发明的具体实施方式
。实施例I表达IFNa5的大肠杆菌菌株的构建本实施例公开了生产重组人干扰素a-5(hIFNa5)的大肠杆菌菌株的开发和构建。简言之，hIFNa5基因的克隆和表达以及生产重组IFNa5蛋白质的菌株的构建按照如下所述的方法步骤来完成克隆编码hIFNa5的cDNA基因，修饰所述基因的DNA序列以优化其在大肠杆菌中的表达，构建表达质粒，将选出的质粒转化入合适的大肠杆菌菌株，以及选择表达/诱导条件。方法使用常规方法和步骤来克隆和表达hIFNa5[Sambrook等Molecular cloning ALaboratory Manual. Second ed. , CSH Laboratory, Cold Spring Harbor, 1989 ；CurrentProtocols in Molecular Biology, vol. 1-3 (Ausubel F. M.等，ed. ) John Wiley &Sons, Inc. , Brooklyn, New York, 1994-1998]。使用酶，DNA和蛋白质标记的所有操作按照厂商说明书来进行[主要是Fermentas(Lithuania)]。遗传构建产生hIFNa5的大肠杆菌的构建按照如图I所示的遗传构建的过程的流程图的步骤进行。初始质粒hIFNa5编码序列(无信号肽)是从匿名的接受了非肝脏病理的腹部外科手术的捐赠者病人(在征得其同意后)的正常的肝脏组织中克隆的，方法如下正常的肝脏组织在ImL的Ultraspec溶液(Biotex)中勻衆,使用脱氧核糖核酸酶(Gibco-BRL, Paisley, U. K)处理总RNA，之后用M-MLV逆转录酶(Gibco-BRL)在RnaseOUT (Gibco-BRL)存在的条件下进行反转录。hIFNa5编码序列(无信号肽)通过之前获得的互补DNA (cDNA)来进行PCR扩增，使用以下的上游和下游引物(5，-3’ )GGAATTCCA17m,TGTGATCTGCCTCAGACCCA (seq ID N0:2)，和CGGGATCC TTGAACCAGTTTTCATTCCTTC (SEQ ID NO :3)。
两条引物都包含hIFNa5序列(粗体标记)以及特定的限制性内切酶序列NdeI和BamHI (下划线标记)。PCR产物使用琼脂糖凝胶电泳分析,将条带从凝胶上切下,使用GeneClean试剂盒(MP Biomedicals)来进行纯化。用TOPO TA克隆试剂盒(Invitogen)来将纯化的PCR产物克隆到pCR2. 1T0P0质粒中。插入序列的克隆在使用染料若丹明终止子循环测序试剂盒(Perkin Elmer)的 ABIPRISM 310 Genetic Analyzer (Perkin Elmer)上进行测序，以验证插入的确实是hIFNa5序列。之后，用NdeI和BamHI限制性内切酶消化pCR
2.ITOPO-IFNa 5，将534pb的条带(对应于IFNa5编码序列)克隆到已用相同的酶消化的pET28b载体(Novagen)中。该序列通过使用相同的步骤进行再次确认。来自不同菌落的初始质粒DNA PET28-IFN α-5使用限制性内切酶酶切分析进行分析(图2)。质粒PET28-IFN α-5通过使用ABI Prism 377测序仪来对DNA双链进行测序分析。该分析证实了 hIFNa5的编码序列。质粒pET28_IFN α-5用作具有密码子优化的成熟构建体的构建中的PCR扩增的模板。 具有密码子优化的成熟结构包含密码子优化的的hIFNa5的编码某闵的PCR扩增PCR扩增通过使用质粒pET28-IFN α-5作为模板来进行。合成以下的寡聚核苷酸ιΗ 义引物(SP) : 5，-CAT ATG TGT GAT CTG CCG CAG ACCCAC TCC CTG TCT MC CGTCGT ACT CTG ATG ATC ATG GCACAG ATG GGT CGT ATC TCT CCT TTC[SEQ ID NO 4]反义引物(ASP): 5’-CTG CAG TTA TTC CTT ACG ACG TAAACG TTC TTG CAA G[SEQID NO 5]SP[SEQ ID NO 4]和ASP[SEQ ID NO 5]引物已用于置换大肠杆菌中使用频率最少的密码子，密码子优化主要涉及精氨酸密码子AGA和AGG。克降PCR片段至中间质粒使用Rapid DNA 连接试剂盒(#_K1421，Fermentas Lithuania),将纯化的大约500bp的扩增产物克隆至pUC57/T质粒(#_SD0171 Fermentas, Lithuania)中，并且转化入大肠杆菌 JM109 (ATCC 53323, ATCC Bacteria and Bacteriophages, 19th edition, 1996)。通过限制性内切酶酶切分析选择重组的克隆(图3)。选择了两个克隆，并且将提取的质粒进行了测序。中间质粒IFNa -5的序列分析和人IFNa -5编码序列再克隆至质粒pET21b(+)核苷酸序列分析证实了 hIFNa5编码部分的序列，如图4所示。hIFNa5编码片段用Ndel+BamHI酶切，将纯化的DNA片段连入Ndel+BamHI酶切载体pET21b(+) (Novagen)来形成质粒pET21_IFN α -5。在转化入大肠杆菌JM109菌株之后，通过添加ΙΟΟμ g/mL的氨苄青霉素来筛选细菌。转化细胞获得的菌落的重组插入分析用菌落PCR测试方法来进行。详细的质粒pET21-IFNa -5的限制性内切酶酶切分析，PCR阳性的克隆的纯化，都获得了预期的限制性酶切图谱(图5)。重组hIFNa5的表达在非表达的宿主中建立质粒PET21-IFN α-5 (稳定的)之后，将其转化到具有用于表达目标蛋白质的相关遗传元件的宿主大肠杆菌BL21(DE3)中，从而形成了大肠杆菌BL21(DE3)pET21-IFN a_5菌株。hIFNa5的表达用ImM IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)进行诱导，结果如图6所示。根据SDS-PAGE，hIFNa5的分子量在大约20kDa处，其对应于计算的19. 7kDa的大小。在总的细胞裂解物的不溶部分中检测重组hIFNa5 ;目标蛋白质的得率为总细胞蛋白质的大约20%。hIFNa5包括了接近40%的细胞裂解物的不溶部分。获得的表达菌株的ー个菌落用于建立研究原始细胞库(RMCB)。实施例2
通过生产菌株的hIFNa5的生物合成方法大肠杆菌BL21 (DE3)pET21-IFN α -5菌株(实施例I)在培养基中培养，所述培养基具有以下组分(g/L):a)在烧瓶中的接种物制备(培养)(g/L):磷酸氢ニ钠(17. O)，磷酸ニ氢钾(I. 82)，硫酸铵(3. O)，七水合硫酸镁(O. 5)，D(+)_水合葡萄糖(15. O)和微量元素原液e)(O. 16mL)；b)用于发酵(g/L):磷酸氢ニ铵(4. O)，七水合硫酸镁(O. 5)，磷酸ニ氢钾(13. 3)，梓檬酸一水合物(I. 6)，D(+)_水合葡萄糖(30. O)和微量兀素原液e) (O. 25mL)；c)料液A (g/L) :D(+)_水合葡萄糖(700. O)，七水合硫酸镁(20. 7)和微量元素原液 e) (3. AmLfD ;d)料液B (g/L):磷酸氢ニ铵(360. O)和磷酸ニ氢钾(306. 7);以及e)微量元素(痕量元素)原液(g/L):六水合氯化铁(III) (30.0)，ニ水合氯化钙(4. 05)，七水合硫酸锌(II) (6. 75)，一水合硫酸锰(II) (I. 5)，五水合硫酸铜(II) (3. O)，六水合氯化钴(II) (I. 14)，ニ水合钥酸钠(O. 3)和硼酸(O. 69)。图7示出了人IFN α-5生物合成方法完整的方案。接种物制备:锥形瓶包含500mL无菌的培养基，以在烧瓶[a)]中进行培养，在锥形瓶中接种O. 25mL储用培养的WCB (工作细胞库)大肠杆菌BL21 (DE3) pET21_IFN α -5。随后，将烧瓶在旋转振荡器中培养，振荡速度为300rpm，30°C的温度下培养21-22小吋。培养之后的光密度必须等于或高于4. 50o. u.(光学单位)[λ =595nm]。发醛发酵罐(总体积13. 7L)，包含7. OL的发酵培养基[b)]，接种I. 5%-1. 6%的在接种物烧瓶中获得的培养物。发酵在自动控制的温度(37°C )、pH(6.8)和p02 (20%)的条件下进行。25%铵溶液用于pH的校正。在8-9小时培养后，开始补料。料液A[c)]以一定的剂量泵入以保持培养基中葡萄糖的浓度在大约3g/L和22g/L之间。使用IPTG在90-110o.u. (λ =595nm)进行诱导到最終的IPTG浓度为O. 5mM。在诱导点的特定的培养物生长率应不低于O. 45以使得在诱导之后有足够的比生长速率。在诱导之后的平均特定培养物生长率应当高于0.17。料液B[d)]以单独的剂量泵入诱导之后在60-70O.u.为150mL，在120-140O. u为150mL,在I. 5小时(90分钟)为75mL和在2小时为75mL。在诱导之后在相同的条件下继续发酵3小吋。然后细胞悬液在发酵罐中12-15°C下冷却，并且通过蠕动泵(35L/h)转移到离心机中。细胞悬液在4°C以5，OOOrpm的转速进行离心。收获的生物量收集到聚こ烯袋中，放置在(_33±5)°C冰箱中冷冻之后储存。取出一部份冷冻的生物量来评估总的蛋白质和hIFNa5的表达。
实施例3从牛产菌株中分离和純化hIFNa5的方法I.生物量的均质化，裂解和分离包涵体(IB)在实施例2中获得的生物量的680. O - 700. Og在再悬浮缓冲液(O. IMTris-HCl, pH
7.80-8. 00，2mM EDTA, O. l%TritonX-100 和 ImM PMSF)中均质化，比率为 1/10 (w/v)，即，Ig湿的生物量/IOmL再悬浮缓冲液。再悬浮在Poter’ s匀浆器(特氟隆/玻璃)中进行，随后细胞使用高压匀浆器在600-800bar，4-10°C的温度下裂解。在细胞裂解之后，通过在8，OOOrpm离心超过30-35分钟来分离包涵体(IB)。 2.洗涤包涵体(IB)分离的IB的预洗涤通过使用洗涤缓冲液I-III的4个连续的步骤来进行洗涤缓冲液I 10mM Tris-HCl 缓冲液，pH 7. 45-7. 55，包含 IM NaCl, O. 1% 聚山梨醇酯-80 ；洗涤缓冲液II 10mM Tris-HCl 缓冲液，pH 8. 00-8. 20，包含 6M 尿素；洗涤缓冲液III 10mM Tris-HCl 缓冲液，pH 8. 00-8. 20。简言之，IB的洗涤按照如下步骤进行a)最初的两次洗涤(步骤I和2)，IB用洗涤缓冲液I洗涤；b)第三步洗涤(步骤3)，IB用洗涤缓冲液II洗涤；以及c)第四步洗涤(步骤4)，IB用洗涤缓冲液III洗涤。在整个IB的洗涤过程中，保持洗涤缓冲液/湿的生物量的比率为IOml缓冲液/Ig
湿的生物量。3. IB的增溶作用为了溶解IB，使用增溶缓冲液(50mM甘氨酸/NaOH缓冲液，pH 9. 55-9. 65，包含6MGdmHCl)。溶解比率从Ig生物量中分离的IB在6mL增溶缓冲液中在2_8°C溶解2小吋，随后8，OOOrpm离心25-30分钟。4.复性复性缓冲液50mM甘氨酸/NaOH 缓冲液，pH 9. 55-9. 65，包含 I. 2MNaCl，O. 22Mし-精氨酸，2. 85mM GSH, O. 285mM GSSG，电导率在 4_10°C 为 110-110mS/cm。GdmHCl-变性人IFNa 5的复性通过滴加IB增溶液到复性缓冲液中(体积比I :7)到达到复性混合物中O. 2M L-精氨酸，2. 5/0. 25mM GSH/GSSG的终浓度。复性混合物在2-8°C持续搅拌44-66小吋。在复性之后，蛋白质溶液通过8，OOOrpm离心30-35分钟来澄清。5.色谱法hIFNa5的纯化通过如下所示的四步色谱方法来进行。5. I苯基琼脂糖柱(疏水作用层析)的色谱法使用苯基琼脂糖柱将复性的hIFNa5与残余的促溶剂GdmHCl分离。另外，将复性的hIFNa5与吸附剂的疏水性表面接触有利于hIFNa5的成熟。简言之，澄清蛋白质溶液的pH用6M HCl调节至8. 00-8. 20，然后将蛋白质溶液上样于苯基琼脂糖色谱柱，使用如下方法參数
色谱介质苯基-掠脂糖凝胶FF (Amersham Pharmacia Biotech AB)；俥用的梓子BPG100 X 500mm,直径 IOcm ；线件流谏60cm/小时；色谱介质梓床体积2. 7 ± O. 3L平衡缓冲液20mMTris-HCl 缓冲液，pH 8. 00-8. 20，包含 I. 5M 氯化钠，15_25°C 电导率 115-125mS/cm (4_10°C为 110-120mS/cm)洗脱缓冲液10mMTris-HCl 缓冲液，pH 9. 20-9. 25，15_25°C 电导率 O. 1-0. 2mS/cm ；洗脱用超过6个柱体积(CV)[即，6CV]洗脱缓冲液进行洗脱。收集蛋白质溶液2-6CV。 5. 2Q-琼脂糖柱色谱法(阴离子交换色谱)Q-琼脂糖柱用于将hIFNa5単体与其聚集形式分离。简言之，在之前的步骤(5. I)中获得的蛋白质池通过添加包含5MNaCl的20mMTris-HCl，pH 8. 75-8. 85的缓冲液来调节电导率到13. 00-14. 00mS/cm，并且用6M HCl将pH调节至8. 75-8. 85。蛋白质溶液随后上样于Q-琼脂糖色谱柱，使用以下的參数色谱介质Q_掠脂糖凝胶 FF (Amersham Pharmacia Biotech AB)；俥用的梓子=BPG140 X 500MM,直径 14cm ；逢性流速60cm/小时；色谱介质梓床体积3. 3 + 0. 3L平衡缓冲液包含O. 12M 氯化钠的 20mM Tris-HCl 缓冲液，pH8. 75-8. 85，15-25°C电导率 13. 00-14. 00mS/cm;洗脱缓冲液:包含0. 23mM氯化钠的 20mM Tris-HCl 缓冲液，ρΗ8· 75-8. 85，15-25°C电导率 23. 00-25. 00mS/cm;洗脱使用超过5倍柱体积(5CV)线性梯度到100%洗脱缓冲液和5CV100%洗脱缓冲液。组分体积是400-1，OOOrnL。只有纯度(由RP-HPLC确定)等于或高于(彡)55%的hIFNa5组分收集进行进ー步纯化。5. 3SP-琼脂糖梓第一色谱法(阳离子交換色谱I)SP-琼脂糖柱用于第三和第四色谱法步骤，以将主要的hIFNa5形式与电荷异构体例如N-甲硫氨酰基hIFNa5和こ酰化hIFNa5 (其是翻译后修饰产物的形式)分离。简言之，在之前的步骤(5.2)中获得的蛋白质池通过添加IOmMこ酸钠缓冲液，ρΗ4· 95-5. 05将电导率调节到6. 00-7. 00mS/cm，pH用4Mこ酸调节到5. 15-5. 20。蛋白质溶液随后上样于色谱法的SP-琼脂糖柱，使用以下參数色谱介质SP_谅脂糖凝胶 FF (Amersham Pharmacia Biotech AB)；使用的梓子=BPG100 X 500mm,直径 IOcm ；线性流速60cm/小时:色谱介质梓床体积3. 3±0. 3L平衡缓冲液:包含50mM氯化钠的20mMこ酸钠缓冲液，pH5. 15-5. 20，15-25°C电导率 6. 00-7. 00mS/cm ； 洗脱缓冲液包含2mM/L-甲硫氨酸和O. IM NaCl的20mMこ酸钠缓冲液，pH
5.15-5. 20，15-25°C 电导率 11. 00-13. OOmS/cm ；洗脱用超过10倍柱体积(IOCV)洗脱缓冲液进行洗脱。组分体积为400-2，OOOmL。只有等于或高于(>)70%纯度的hIFNa5 (由RP-HPLC确定)的组分收集以进行进
一步的纯化。5. 4SP-琼脂糖凝胶柱第二色谱法(阳离子交换色谱II)
简言之，上样溶液[从第一 SP-琼脂糖柱(步骤5.3)中回收的蛋白质组分]用包含2mM/L-甲硫氨酸的5mMこ酸钠缓冲液，pH 5. 00-5. 20，进行稀释，在15_25°C的电导率0. 200-0. 800mS/cm到15_25°C的电导率6. 00-7. 00mS/cm。上样溶液中加入2mM/L_甲硫氨酸是为了防止在室温下进行色谱的过程中hIFNa5的氧化。上样溶液上样于SP-琼脂糖色谱柱，使用以下的參数色谱介质SP_掠脂糖凝胶 FF (Amersham Pharmacia Biotech AB)；俥用的梓子BPG100 X 500mm,直径 IOcm ；线件流谏60cm/小时:色谱介质梓床体积:3. O ± 0. 3L·平衡缓冲液:包含50mM氯化钠的20mMこ酸钠缓冲液，pH5. 15-5. 20，15-25°C电导率 6. 00-7. OOmS/cm ；洗脱缓冲液:包含O. IM NaCl的20mMこ酸钠缓冲液，pH 5. 15-5. 20, 15_25°C电导率 11. 00-13. 00mS/cm ；洗脱线件流谏45cm/小时；SR用超过20倍柱体积(20CV)的线性梯度到100%洗脱缓冲液。组分体积是400-2，OOOmL。收集通过RP-HPLC确定的等于或高于(>)95%纯度的hIFNa5组分。配制、浓缩、无菌过滤配制缓冲液包含0. IM氯化钠的25mM磷酸钠，pH 6. 80_7. 20，15_25 °C电导率10.00-14. 00mS/cm。缓冲液更换/蛋白质溶液浓缩通过透滤法/浓缩通过等于或高于(彡)I. 00mg/mL的Biomax IOkDa膜来进行,无菌过滤通过无菌的0. 22 μ m过滤器(Millipak 20)来进行，并装入玻璃管中。图8示出了在重组hIFNa5蛋白质的还原以及非还原的条件下，通过SDS-PAGE(14%)测得的，根据本发明的方法和配方获得的三个大規模纯化批次中重组hIFNa5的纯度。图9示出了通过“反相-高效液相色谱”(RP-HPLC)测得的，根据本发明的方法和配方获得的重组hIFNa5的纯度(该图示出了三个大规模批次的重组hIFNa5的結果)。图10示出了通过“分子筛-HPLC” (SE-HPLC)测得的，根据本发明的方法和配方获得的3个重组hIFNa5大規模批次的重组hIFNa5的纯度。图11示出了通过等电点聚焦分析测得的，根据本发明的方法和配方获得的三个大规模批次的重组hIFNa5的重组hIFNa5的纯度。泳道1，11 pl标准样品(AmershamPharmacia);泳道 2，3，4 :重组 hIFNa5，15 μ g ;泳道 5，6，7 :重组 hIFNa5，5 μ g ;泳道 8，9，10 :重组 hIFNa5，ly g。图12示出了根据本发明纯化和制备的3个大規模的重组hIFNa5制剂批次的肽图色谱。实施例4微量元素和葡萄糖浓度对重组人IFN α ~5的生物合成的影响的评估本实施例的目的实施为了证实在重组人IFNt5 (hIFNa5)的翻译后修饰中微量元素的影响，来确定在碳料液中关键微量元素浓度的限度，以及评估在重组hIFNa5的生物 合成中葡萄糖浓度的影响。因此本实施例描述了在研究中进行的分析以及获得的结果，来论证碳料液中的微量元素浓度和论证重组hIFNa5的生物合成方法中的葡萄糖浓度。在优化hIFNa5生物合成方法的过程中，发现了发酵培养基中金属或微量元素(痕量元素)的浓度对于hIFNa5蛋白质的翻译后修饰有影响。因此，本研究的目的是确认所述的痕量元素在hIFNa5蛋白质翻译后修饰的影响，以及确定在碳料液中关键微量元素浓度的限度。除此之外，还决定评估在提供了每个碳补料剂量后的发酵培养基中葡萄糖浓度(17g/L和22g/L)，以确定其是否对培养物生长具有影响(即，其是否參与培养物生长限制，影响生物量得率，或者其是否对培养物生长没有影响)，以及是否对目标蛋白质(重组hIFNa5)的质量有影响。材料和方法本实验的计划根据“实验设计”(DOE)来进行设计和监控，其在表I中示出。表I设计和进行的实验
权利要求
1.一种在大肠杆菌宿主细胞中通过表达来生产干扰素a5(IFNa5)蛋白质的方法,其包括 a)提供一种产生IFNa5的大肠杆菌宿主细胞； b)在通过所述产生IFNa5的重组大肠杆菌宿主细胞中有效表达所述IFNa5蛋白的条件下，在发酵培养基中培养该产生IFNa5的大肠杆菌宿主细胞，所述培养基添加碳料液，其中 -所述发酵培养基不含动物来源或酵母来源的成分，并且 -所述碳料液包含碳源和每升添加的碳料液中大约3. O至大约3. 7mL的微量元素溶液；以及 c)分离，以及任选地纯化，表达的IFNa5蛋白质。
2.根据权利要求I的方法，其中大肠杆菌宿主细胞用包含在诱导型启动子调控下的IFNa5蛋白质的编码序列的载体来进行转化。
3.根据权利要求I或2的方法，其中大肠杆菌宿主细胞是大肠杆菌蛋白酶缺陷型菌株，优选地，大肠杆菌IorT/ompr蛋白酶缺陷型宿主菌株,更优选地,大肠杆菌BL21菌株,最优选地，大肠杆菌BL21 ( DE3)菌株。
4.根据权利要求3的方法，其中大肠杆菌宿主细胞是大肠杆菌BL21( DE3)菌株，并且步骤b)的条件中包括使用IPTG诱导。
5.根据权利要求4的方法，其中在诱导之后的特定的培养物生长率(μ)等于或高于O. 17。
6.根据权利要求I的方法，其中所述微量元素选自由铁、钙、锌、锰、铜、钴、钥、硼和其组合组成的微量元素组中。
7.根据权利要求I或6的方法，其中包含在所述碳料液中的微量元素溶液包含氯化铁(III)、氯化钙、硫酸锌(II)、硫酸锰(II)、硫酸铜(II)、氯化钴(II)、钥酸钠、硼酸或其组合。
8.根据权利要求I的方法，其中所述IFNa5蛋白质是hIFNa5。
9.根据权利要求I的方法，其中编码IFNa5蛋白质的序列包括如SEQID NO :1所示的核酸序列。
10.根据权利要求I的方法,其中从包含所述包涵体(IB)形式的IFNa5蛋白质的混合物中分离并且任选地纯化IFNa5蛋白质，通过将所述IB进行增溶来形成包含变性IFNa5的混合物，随后进行氧化复性处理过程形成包含复性IFNa5的混合物，并且对包含所述复性IFNa5的混合物进行纯化从而获得纯化的IFNa5。
11.根据权利要求10的方法，其中包含复性IFNa5的混合物通过将所述混合物进行4-步色谱处理方法来纯化，其包括 1)将所述包含复性IFNa5的混合物进行疏水作用层析； 2)将步骤I)获得的溶液进行阴离子交换色谱； 3)将步骤2)获得的溶液进行第一阳离子交換色谱；以及 4)将步骤3)获得的溶液进行第二阳离子交换色谱，其中所述溶液任选地，用包含甲硫氨酸的缓冲液进行稀释。
全文摘要
一种在产生IFNa5的大肠杆菌宿主细胞中通过表达产生干扰素α5(IFNa5)蛋白质的方法，该方法使得多肽链的N-末端的额外甲硫氨酸残基的掺入以及氧化类型的产生最小化。IFNa5蛋白质可以使用有效的方法来纯化从而产生有生物活性的IFNa5。
文档编号C12N1/38GK102869767SQ201180013665
公开日2013年1月9日 申请日期2011年1月31日 优先权日2010年2月1日
发明者巴尔达斯·阿尔吉尔达斯·布梅里斯 申请人:迪格纳生物技术公司