细菌产生软骨素的组合物和方法

专利名称：细菌产生软骨素的组合物和方法
技术领域：
本发明涉及软骨素产生的重组DNA技术领域，包括通过联合重组细菌发酵和发酵后硫酸化产生硫酸软骨素。
背景技术：
软骨素属于称为糖胺聚糖(GAG)的杂多糖家族。糖胺聚糖(GAG)是无支链的、带负电荷的多糖链，由重复的二糖单位组成，其中之一是酸性糖而另一种是可以被硫酸化的氨基糖(N-乙酰葡糖胺或N-乙酰基半乳糖胺)。由于它们非柔性的性质和高的负电荷，GAG表现出高度延展的构象，占用大量空间，吸收阳离子和水并在细胞外基质中形成多孔的凝胶。因此，在大多数动物中被发现的GAG帮助水合和扩展组织，并使基质能够承受压力(compressive force) 0通过这种机制，例如衬贴膝关节的软骨基质可以支持数百个大气压的压力。硫酸软骨素对于维持软骨的强度和韧性是重要的并作为营养补充剂销售以减轻关节疼痛和促进健康的软骨和关节功能。临床研究支持使用硫酸软骨素治疗骨性关节炎(参见，例如，Kahan 等，Arthritis and Rheumatism2009;60:524-533 ；Michel 等，Arthritis and Rheumatism 2005;52:779-786 和 Uebelhardt 等，Osteoarthritis and Cartilage 2004; 12:269-276) > 间质性膀胱炎(参见，例如，Nickel 等，BJU Int. 2009; 103:56-60 和 Cervigni 等，Int. Urogynecol. J. Pelvic FloorDysfunct. 2008; 19:943-947)、和滑膜炎(参见，例如，Hochberg 和 Clegg, Osteoarthritisand Cartilage 2008; 16 (Suppl. 3) : S22-S24 和 Μ ε ’，Osteoarthritis and Cartilage2009;17(Suppl. I) :S32_S33)。这些文献以整体引用的方式并入本文。目前通过使用化学和酶处理从蛋白中解离多糖并产生不同质量的多糖产品，从动物，包括牛、猪、鲨和家禽的软骨提取来产生硫酸软骨素(Barnhill等，J. Am. Pharm.Assoc. 2006 ；46:14-24，Volpi, J. Pharm. Pharmacol. 2009;61:1271-1280)。软骨素包含D-葡糖醛酸(GlcUA)和N-乙酰基-D-半乳糖胺(GalNAc)。它由二糖重复单位β 3GalNAc-^4GlcUA组成。通常，GalNAc残基在4位和6位不定地是硫酸化的。硫酸软骨素作为蛋白聚糖的组分自然发生，蛋白聚糖在人和其他动物中是软骨组织，例如关节的结构部件。蛋白聚糖由核心蛋白和多糖组分，例如硫酸软骨素组成，其通过如图I所示的寡糖接头与蛋白共价附接。核心蛋白以多种多糖链修饰。蛋白聚糖可以通过细胞外间隙存在的蛋白的含多糖部分锚定在细胞膜上或分泌和定位于细胞外基质中(Prydz和Dalen, J. Cell Sci.2000;113:193-205)。负责合成软骨素骨架的糖基转移酶(软骨素合成酶)通过向接受底物添加来自UDP-GalNAc和UDP-GIcUA供体GalNAc和GlcUA的交替单糖单位来进行。已经在人类中确定了这些酶(Kitagawa 等，J. Biol. Chem. 2001 ；276 :43894-43900 ;Yada 等，J. Biol.Chem. 2003 ；278 :39711-39725)，并且已经在多种其他动物，包括马、牛、啮齿类动物、狗、鸡、斑马鱼、线虫、和昆虫(www. ncbi. nlm. nih. gov/homologene/8950)中确定了人软骨素合成酶的同源物。有些细菌也产生软骨素或软骨素样多糖聚合物作为它们的荚膜的组分。与在脊椎动物中发现的硫酸软骨素不同，微生物软骨素不是作为蛋白聚糖存在，而是在细菌细胞表面作为脂质连接的多糖和在培养基中作为游离(即与细胞不相连的)多糖存在(Whitfield, Annu. Rev. Biochem. 2006;75:39-68 ;DeAngelis,Glycobiol. 2002;12:9R-16R)。据报道两种细菌，大肠杆菌K4(Rodriguez 等,Eur. J. Biochem. 1988; 177:117-124)和多杀巴斯德氏菌(Pasteurella multocida)血清型 F(Rimler, Vet.Rec. 1994;134:191-192)可以产生非硫酸化软骨素样荚膜多糖，其潜在地可进行化学修饰以产生硫酸软骨素。Rodriguez等展示了大肠杆菌K4产生具有果糖侧链(K4抗原)的非硫酸化的软骨素骨架作为荚膜聚合物成分。Ninomiya等(J. Biol.Chem. 2002;277:21567-21575)鉴定并测序了在大肠杆菌K4中软骨素样荚膜多糖生物合成所需的关键基因。这些序列保存于GenBank 中具有登录号AB079602。Ninomiya等公开的序列包含大肠杆菌K4 “2组”荚膜基因簇的所谓的“区域2”部分。Whitfield提供了大肠杆菌中荚膜基因簇组成的详细说明(Annu. Rev. Biochem. 2006;75:39-68)。大肠杆菌2组荚膜基因簇的区域2基因编码决定荚膜多糖结构的蛋白。AB079602序列包含一个编码大肠杆菌K4软骨素聚合酶的基因，称为kfoC。大肠杆菌K4软骨素聚合酶是一种双功能糖基转移酶，将GlcUA和GalNAc交替转移到软骨素糖链和相关寡糖的非还原性末端，产生K4抗原多糖的软骨素骨架。大肠杆菌K4产生的软骨素样荚膜多糖包含连接(β1，3)到软骨素GlcUA残基的果糖。多杀巴斯德氏菌血清型F也产生非硫酸化的软骨素荚膜成分，并且如 DeAngeIis&Padgett-McCue, J. Biol. Chem. 2000;275:24124-29 报道的，已经克隆了在此生物中负责软骨素聚合的糖基转移酶。与K4软骨素聚合酶一样，巴斯德氏菌软骨素合酶(pmCS, Genbank登录号AAF97500)是单一的多肽酶，在提供合适的受体底物时，它可以从UDP-GIcUA和UDP-GalNAc合成软骨素聚合物。涉及从动物组织中纯化的产生硫酸软骨素的传统方法费力且成本高。此外，从动物组织产生硫酸软骨素必然涉及硫酸软骨素产品中存在传染性病原体的可能。在从动物组织产生过程中必须小心以使这种潜在的传染性病原体存在的可能性最小化。可以使用利用重组DNA技术产生软骨素的替代方法克服这些缺点。最近，DeAngelis (美国专利申请公开第 20030109693 号)和 Cimini 等(AppI. Microbiol. Biotechnol. 2010; 85 (6) : 1779-87 (Epub Oct. 1,2009))已建议了微生物产生软骨素。然而，产生软骨素(多杀巴斯德氏菌)或软骨素样(大肠杆菌K4)多糖的已知微生物是已知的对各种哺乳动物的病原体并因此不适合大规模发酵。它们也是相对低的多糖生产者。特别的是，多杀巴斯德氏菌被认为不适合商业生产软骨素，因为它的产量低、要求昂贵的培养基、和生物危害等级2(BL2)状态，这需要专门且昂贵的设施。得自微生物的高产率是商业上可以获利的软骨素生产必然需要的。DeAngelis (美国专利申请公开第 20030109693号)提及在宿主细胞，例如食品级的乳球菌属(Lactococcus)或芽孢杆菌属(Bacillus)中表达pmCS以合成重组软骨素的可能性。然而，芽孢杆菌是革兰氏阳性细菌，并正因如此，其具有比革兰阴性生物如大肠杆菌和多杀巴斯德氏菌非常不同的膜/细胞壁结构。因此，预期聚合物的有效分泌在芽孢杆菌中将是有问题的。大肠杆菌K4也不适合生产软骨素，因为它是已知的人类病原体。此外，它本身不产生软骨素，反而如上文指出的产生软骨素的果糖基化形式。需要对此多糖进行大量的化学或酶修饰以生产软骨素。这样的修饰增加了方法的总成本。另外，它需要引入进一步的流程和质量控制措施以确定这样的修饰是完整的并且产生一致的产品。因此，软骨素生产需要一种有效、安全且合算的方法。本发明通过提供构建体和宿 主细胞和方法以供软骨素(可随后被硫酸化以产生硫酸软骨素)的重组微生物产生来满足这一需求。发明概述本发明涉及一种包含基因簇的构建体，所述基因簇包含kpsF、kpsE、kpsD、kpsU、kpsC、kpsS、kfoA、kfoC、和 kfoF,其中所述基因族不含 kfoD、orf3 (kfol) > kfoE、或orfl (kfoH)中的一种或多种的功能性基因，并且其中所述构建体适于在非致病性细菌宿主细胞中产生软骨素。在一些实施方案中，软骨素是非果糖基化的。在一些实施方案中，软骨素是从宿主细胞分泌的。在一些实施方案中，基因簇进一步包含kfoG、kfoB或kfoG和kfoB两者均包含。在一些实施方案中，基因簇进一步包含kfoM和kfoT。在一些实施方案中，构建体包含 pDD66、pDD67、pCX040、pCX041、pCX042、pCX043、pCX096、或 pBR1052。本发明涉及一种包含基因簇的构建体，所述基因簇包含kfoA、kfoC、和kfoF，其中所述基因簇不含kpsM、kpsT、kpsE、kpsD、kpsC、或kpsS中的一种或多种的功能性基因，并且其中所述构建体适于在非致病性细菌宿主细胞中产生软骨素。在一些实施方案中，软骨素是从宿主细胞分泌的。在一些实施方案中，构建体还不含1^00、0忖3、1^(^、或0忖1中的一种或多种的功能性基因。在一些实施方案中，软骨素是非果糖基化的。在一些实施方案中，基因簇进一步包含1^06、1^08、或1^06和kfoB两者均包含。在一些实施方案中，构建体包含pCX039、pCX044、或pCX092。在一些实施方案中，构建体包含pCX045或pCX048。本发明涉及一种包含基因簇的构建体，所述基因簇包含选自下组的基因kfoA、kfoB、kfoC、kfoF、kfoG 及其组合,其中所述构建体不含 kpsM、kpsT、kpsE、kpsD、kpsC、或kpsS中的一种或多种的功能性基因，并且其中所述构建体适于在非致病性细菌宿主细胞中产生软骨素或增加软骨素的量。在一些实施方案中，软骨素不从宿主细胞分泌。在一些实施方案中，构建体还不含kfoD、orf3、kfoE、或orfl中的一种或多种的功能性基因。在一些实施方案中，软骨素是非果糖基化的。在一些实施方案中，构建体包含kfoA、kfoB、kfoC、kfoF、和 kfoG。在一些实施方案中，构建体包含 pCX075、pCX081、pCX082、pCX092、pCXlOl、pBR1102、pBR1100、或pBRllOl。在一些实施方案中，构建体包含pCX045或pCX048。在一些实施方案中，修饰本发明的任一种构建体中的一个或多个基因以获得在细菌宿主细胞中的最佳密码子选择。在一些实施方案中，本发明的任一种构建体进一步包含启动子。在一些实施方案中，启动子选自下组Pm、Plac、Ptrp、Ptac、λ pL>PT7>PphoA>ParaC>PxapA, Pcad,和 PrecA。在一些实施方案中，启动子为Pm。在一些实施方案中，本发明的任何构建体进一步包含第二启动子。在一些实施方案中，第二启动子选自下组Pm、Plac、Ptrp、Ptac、λ pL、PT7、PphoA、ParaC、PxapA、Pcad、和PrecA0在一些实施方案中，第二启动子为Pm。在一些实施方案中，第二启动子在构建体中与一个或多个基因可操作地连接。在一些实施方案中，第二启动子与kpsFEDUCS可操作地连接。 在一些实施方案中，构建体进一步包含xylS调节基因。在一些实施方案中，本发明的任何构建体进一步包含抗生素抗性基因。在一些实施方案中，抗生素抗性基因选自下组氯霉素(CamR)、卡那霉素(KanR)，氨苄青霉素(AmpR)、四环素(TetR)、博来霉素(BleR)、大观霉素(SpcR)、磺酰胺(SuR)、链霉素(StrR)、羧苄青霉素(CbR)、和红霉素(EryR)。在一些实施方案中，本发明的任何构建体包含一个K4基因簇。在一些实施方案中，本发明的任何构建体适于在非致病性细菌宿主细胞中产 生软骨素，其中细菌宿主细胞是或源自选自埃希氏杆菌属(Escherichia)、假单胞菌属(Pseudomonas)、黄单胞菌属(Xanthomonas)、甲基单胞菌属(Methylomonas)、不动杆菌属(Acinetobacter)、和鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)的非致病性生物。本发明涉及一种包含本发明的任何构建体的非致病性细菌宿主细胞。在一些实施方案中，细菌宿主细胞是或者源自选自埃希氏杆菌属、假单胞菌属、黄单胞菌属、甲基单胞菌属、不动杆菌属和鞘氨醇单胞菌属的非致病性生物。在一些实施方案中，细菌宿主细胞是选自下组的细菌菌株MSC279、MSC280、MSC315、MSC316、MSC317、MSC319、MSC322、MSC323、MSC324、MSC325、MSC326、MSC328、MSC346、MSC347、MSC348、MSC350、MSC356、MSC359、MSC392、MSC402、MSC403、MSC404、MSC405、MSC410、MSC411、MSC436、MSC437、MSC438、MSC439、MSC458、MSC459、MSC460、MSC461、MSC466、MSC467、MSC469、MSC480、MSC494、MSC498、MSC499、MSC500、MSC510、MSC511、MSC522、MSC526、MSC537、MSC551、MSC561、MSC562、MSC563、MSC564、MSC566、MSC567、MSC619、MSC625、MSC627、MSC640、MSC641、MSC643、MSC646、MSC650、MSC656、MSC657、MSC658、MSC659、MSC660、MSC669、MSC670、MSC671、MSC672、MSC673、MSC674、MSC675、MSC676、MSC677、MSC678、MSC679、MSC680、MSC681、MSC682、MSC683、MSC684、MSC687、MSC688、MSC689、MSC690、MSC691、MSC692、MSC693、MSC694、MSC700、MSC701、MSC702、MSC722、MSC723 和MSC724。本发明涉及一种产生软骨素的方法，包括将本发明的任何构建体转移到非致病性细菌宿主细胞中，并在细菌宿主细胞产生软骨素的发酵条件下培养细菌宿主细胞。本发明涉及一种产生软骨素的方法，包括在足以产生软骨素的发酵条件下培养包含本发明的任何构建体的非致病性细菌宿主细胞。本发明涉及一种产生非致病性细菌宿主细胞的方法，包括将本发明的任何构建体转移到非致病性细菌宿主细胞中。在一些实施方案中，在本发明的任何方法中，本发明的任何构建体的基因簇或基因整合到细菌宿主细胞的染色体中。在一些实施方案中，在本发明的任何方法中，本发明的任何构建体的基因簇或基因的两个或更多个拷贝整合到细菌宿主细胞的染色体中。在一些实施方案中，所述基因簇或基因的两个或更多个拷贝包括相同基因或基因簇的两个或更多个拷贝。在一些实施方案中，本发明的任何方法产生的软骨素是非果糖基化的。在一些实施方案中，本发明的方法进一步包括硫酸化软骨素。
本发明涉及一种产生硫酸软骨素的方法，包括通过本发明的任何方法产生软骨素；和硫酸化软骨素。在一些实施方案中，在本发明的任何方法中的硫酸化软骨素的过程包括将三氧化硫-三乙胺复合物或氯磺酸与软骨素在甲酰胺中混合。在一些实施方案中，在任何本发明的方法中的细菌宿主细胞是或源自选自埃希氏杆菌属、假单胞菌属、黄单胞菌属、甲基单胞菌属、不动杆菌属和鞘氨醇单胞菌属的非致病性生物。在一些实施方案中，在本发明的任何方法中的细菌宿主细胞是或源自革兰氏阴性生物。在一些实施方案中，在本发明的任何方法中的细菌宿主细胞是野油菜黄单胞菌。在一些实施方案中，野油菜黄单胞菌选自下组的细菌菌株MSC255、MSC256、MSC257、 MSC225、和 MSC226。在一些实施方案中，在本发明的任何方法中的细菌宿主细胞是非致病性的大肠杆菌。在一些实施方案中，非致病性的大肠杆菌选自大肠杆菌K-12和大肠杆菌B。在一些实施方案中，大肠杆菌K-12是选自MSC188和MSC175组成的组的细菌菌株。在一些实施方案中，大肠杆菌B是细菌菌株MSC364。在一些实施方案中，通过同源重组缺失或灭活在本发明的任何方法中的细菌宿主细胞的内源基因。在一些实施方案中，在本发明的任何方法中的细菌宿主细胞不表达对宿主细胞是内源性的胞外多糖。在一些实施方案中，在本发明的任何方法中的细菌宿主细胞适合从实验室克隆菌株的接合转移。在一些实施方案中，本发明的方法进一步包括从细菌宿主细胞回收软骨素。在一些实施方案中，本发明的方法进一步包括从细胞外培养基回收软骨素。在一些实施方案中，从在本发明的任何方法中的细菌宿主细胞在24-72小时内分泌lg/L-50g/L的软骨素。在一些实施方案中，从细菌宿主细胞在24-72小时内分泌5g/L-50g/L的软骨素。在一些实施方案中，从细菌宿主细胞在24-72小时内分泌15g/L_50g/L的软骨素。在一些实施方案中，本发明的任何方法进一步包括纯化软骨素。在一些实施方案中，在本发明的任何方法中的细菌宿主细胞在25°C -37°C下培养。在一些实施方案中，在本发明的任何方法中的细菌宿主细胞在包含甘油的培养基中培养。本发明涉及由本发明的任何方法产生的软骨素。本发明涉及包含本发明的任何方法产生的软骨素的组合物。本发明涉及结合选自下组的氨基酸序列的抗体或抗体片段SEQ ID N0:92的KpsF,SEQ ID N0:93 的KpsE、SEQ ID NO:94 的KpsD、SEQ ID NO:95 的KpsU、SEQ ID N0:96 的KpsC,SEQ ID NO:97 的 KpsS、SEQ ID NO:91 的 KpsT、SEQ ID NO:83 的 KfoA、SEQ ID NO:84的 KfoB、SEQ ID NO:85 的 KfoC、SEQ ID NO:86 的 KfoI(0rf3)、SEQ ID NO:87 的 KfoE、SEQID NO:88 的 KfoH(Orfl)、SEQ ID NO:89 的 KfoF、和 SEQ ID NO:90 的 KfoG。附图简述图IA显示了软骨素和硫酸软骨素的结构。图IB显示了硫酸软骨素和蛋白聚糖的核心蛋白之间的连接。图2显示了如本发明之前提出的大肠杆菌K4荚膜合成中所涉及的基因簇的组成。在该图中所示区域2的组成是如Ninomiya等(J. Biol. Chem. 2002; 277:21567-21575)所描述。大肠杆菌K4荚膜基因簇的区域I和区域3在本发明之前未测序而因此在本发明之前它们的结构是未知的。图3 显示了本发明人对 Ninomiya 等(J. Biol. Chem. 2002; 277:21567-21575)所描 述的大肠杆菌K4荚膜区域2序列(AB079602)的分析。图3A显示存在额外的推定编码序列orfl、orf2和orf3，并进一步显示基于大肠杆菌K4与多杀巴斯德氏菌血清型B和E的区域2的序列比对；来自大肠杆菌K4的基因(比对数据如图3B所示)，kfoD、orf3、kfoE、orfl与多杀巴斯德氏菌M1404血清型B基因bcbDEFG和多杀巴斯德氏菌P1234血清型E基因ecbDEFG之间具有同源性。同源物由双头箭头连接。图4涉及本发明人确定的大肠杆菌K4菌株ATCC 23502的区域2基因的序列。图4A列出了本发明人确定的序列与先前Ninomiya等报道的序列相比之间的差异。图4B显示了本发明人确定的区域2基因序列编码的预测氨基酸序列(如图4B所示的SEQ ID NO:30,SEQID NO: 32,SEQ ID NO: 26,SEQ ID NO: 24 JPSEQ ID NO: 20)与 Ninomiya 等报道的序列编码的氨基酸序列(在图 4B 所示的 K4 Kfo put0RF2 和 K4 KfoG_BAC00518 ；K4 Kfo put0RF_l ；K4 KfoE_BAC00520 ；Κ4 KfoD_BAC00521 ；Κ4 KfoB_BAC00524)的比较。图5显示了大肠杆菌K4菌株U1-41的K4荚膜基因簇的组成。该基因簇包含17个预测编码蛋白的开放阅读框(除IS2以外)。图6 示意性代表了构建为 3 个片段，kpsFEDUCS (“FS 片段”)、kpsMTkfoABCFG(“MG片段”)和kfoDIEH( “DH片段”)的合成基因的结构。如所描绘的，限制性位点整合在策略性定位以允许将成合成的片段装配到一个或多个操纵子并利于单个基因的操纵。图7A显不了用于通过缺失特定基因或基因族构建衍生细囷囷株的pop in,pop-out策略。图7B显示了此策略中用于在野油菜黄单胞菌中实施这一策略的自杀载体pCX027 (SEQ ID NO: 141)的图谱。图8A-8U 代表了本发明的质粒和 DNA 片段 pBHRl、pDD39、pDD42、pDD47、pREZ6、pDD49、pJ201:11352、pDD50、pDD54、pJ241:10662、pJ241:10664、pJ241:10663、pDD37、pDD38、pDD51、pDD52、pDD57、pDD58、pDD61、pDD62、pDD63、pDD59、pDD67、pDD60、pDD66、PBR1052、pMAK-CL、pDD74、pDD76、pDD73、pDD77、pDD79、pDD80、pCX045、pCS048、pCX039、pCX044、pCX040、pCX042、pCX041、pCX043、MSC467、MSC561 和 pBR1087 的 DNA 图谱。图9显示了使用针对大肠杆菌K42组荚膜基因簇编码蛋白的抗血清进行的Western印迹的结果的举例。

图10A-10D显示了用于将克隆的大肠杆菌K4软骨素生物合成基因引入野油菜黄单胞菌的质粒构建体的DNA图谱。图IlA显示了抑制性ELISA中测量的典型的K4果糖基化的软骨素荚膜多糖(“K4P”)的校准曲线。图IlB显示了在用于软骨素的软骨素酶/HPLC测定中测量的典型的二糖，2-乙酰氨基-2-脱氧-3-0- ( β -D-葡萄糖-4-烯吡喃糖基糖酮酸)-D-半乳糖(“Adi-OS”)的标准曲线。图12显示了软骨素酶的重组软骨素消化率。图13显示了软骨素酶的K4果糖基化的软骨素荚膜多糖(K4P)和去果糖基化的K4P (DFK4P)的消化率。图14A-14X 显示了本发明的质粒构建体 pCX096、pCX097、pCX100、pCX101、pCS102、pCX075、pCX082、pCX081、pCX092、pBR1077、pBR1082、pCX050、pCX070、pCX093、pCX094、pCX095、pMAK705pl、pBR1103、pBR10931acZ、pBR100-lac、pBR1094mtl、pBR1101-mtl、pBR1095fru 和 pBR1102_fru 的 DNA 图谱。
图15显示了产生软骨素的大肠杆菌菌株的家族树和用于菌株衍生化的步骤。发明详述本发明涉及用于产生软骨素的构建体和重组细胞，产生软骨素的方法，从所述方法产生的软骨素以及软骨素的用途。如本文所述，本发明是基于一种允许产生软骨素和硫酸软骨素的新技术。本发明通过以更低的成本却提供更优的产品质量，提供一种安全、稳定、且可靠的软骨素和硫酸软骨素供应，来满足本领域的一个重要需求。此过程还可以提供一种素食的和合乎犹太教规定的(kosher)产品。重组产生的软骨素可以使用已知的方法硫酸化以形成硫酸软骨素。因此，本发明包括硫酸化重组产生的软骨素的方法，重组产生的硫酸软骨素产品，以及重组产生的硫酸软骨素产品的用途。如下面详细描述的，本发明人测序了编码参与大肠杆菌K4果糖基化的软骨素荚膜多糖(K4P)生物合成的蛋白的大肠杆菌K4基因簇的序列，基于天然序列合成和装配了DNA片段，将这些基因转移到适于大规模发酵的替代的宿主细胞，并证明了在这些宿主细胞中重组果糖基化的软骨素荚膜多糖的产生。由于替代的宿主细胞应产生非-果糖基化的软骨素是优选的，确定了大肠杆菌K4负责软骨素果糖基化的基因，并将其从转移到替代宿主的大肠杆菌K4软骨素生物合成基因集中缺失。结果是含有该基因集的替代宿主产生了非-果糖基化的软骨素。替代宿主产生的该重组软骨素(rCH)可以硫酸化以产生硫酸软骨素产品。如本文所用的，术语“K4P”指由野生型大肠杆菌K4菌株合成的天然的或天然存在的果糖基化的软骨素荚膜多糖。术语“软骨素”指软骨素骨架。软骨素可以是果糖基化的或未果糖基化的(或非果糖基化的)。除非特别指出，如本文所用的术语“软骨素”包括果糖基化的和未果糖基化的两种形式。此外，如本文所用的，术语软骨素指未硫酸化的软骨素。本发明的方法产生的软骨素可以通过酶学或化学方式硫酸化，如下面详细说明的，在此情况下，将其称为硫酸软骨素。在一个方面中，本发明包含含有大肠杆菌K4基因集或基因簇的DNA构建体。如本文所述的术语“K4基因簇”指大肠杆菌K4的涉及软骨素样荚膜多糖(K4P)生物合成的基因的集合。术语“K4基因簇”可以指大肠杆菌K4涉及软骨素样荚膜多糖生物合成的所有基因或这些基因的一个子集。如实施例I详细描述的，大肠杆菌K4包含涉及称为K4P的软骨素样荚膜多糖合成的多基因的集合。如上面指出的，该多糖由通过加入果糖残基修饰的软骨素骨架组成。如图2所示，这些基因组织在三个主要区域(区域1(“R1”)、区域2(“R2”)、和区域3(“R3”))中。基于Ninomiya等(2002)描述的区域2的序列(GenBank登录号AB079602),预测区域2包含7个与荚膜生物合成相关的基因，kfoA、kfoB、kfoC、kfoD、kfoE、kfoF和kfoG。Ninomiya等没有披露预期的大肠杆菌K4荚膜基因簇区域I和区域3部分的序列。然而，根据已知的其它大肠杆菌荚膜基因簇的组成，预测区域I会包含6个基因，1^)亦、1^)述、1^)如、1^)如、1^^(、kpsS 且预测区域 3 会包含 2 个基因，kpsM 和 kpsT。kpsM、kpsT、kpsD、kpsE、kpsC 和 kpsS基因编码将荚膜多糖从细胞质易位到细胞表面所需的蛋白，认为在细胞表面成熟的荚膜多糖通过与该膜的脂质成分的共价键锚定到外部细胞膜上(Whitfield，2006)。kpsF和kpsU基因编码预期催化CMP-Kdo生物合成中的步骤的蛋白。已经提出了大肠杆菌中CMP-Kdo在软骨素荚膜生物合成中的功能(Roberts，Annu. Rev. Microbiol. 1996; 50:285-315)，但尚未得到实验证实(Whitfield，2006)。因此，在本发明披露之前认为整个K4基因簇包含15个基因。为了确认Ninomiya等报道的序列(GenBank登录号AB079602),本发明人测序了大肠杆菌K4菌株ATCC 23502的K4荚膜基因簇区域2。当将本发明人确定的序列和AB079602 序列进行比较时，发现了多个单碱基对差异，包括在26个位置的取代、缺失和插入。如实施例I中详细说明的，这些差异中的一些导致在基因簇编码的区域2蛋白的预测氨基酸序列中的实质差异。此外，本发明人检测了 Ninomiya等确定的作为分离基因的间隔序列的区域并确定了在之前未确定的区域2中的三个额外的开放阅读框orfl (本文也称为kfoH), orf2和orf3 (本文也称为kfol)。为了确定包含所有三个区域的基因的整个K4基因簇的正确序列，从StatensSerum Institut (Copenhagen, Denmark)获得了大肠杆菌血清型 K4 菌株 Ul-41。U1-41 是ATCC 23502菌株的前体并已经报道在培养中产生K4荚膜多糖。它也是用于大肠杆菌血清分型的K4参考菌株并由Rodriguez等(1988)用于产生用于K4P结构测定的多糖制备物。对在大肠杆菌U1-41中跨越K4荚膜基因簇的共约23kb的DNA进行了测序。该序列(SEQID NO: 117)证实了区域I中kpsF、kpsE、kpsD、kpsU、kpsC和kpsS基因的存在和区域3中kpsM和kpsT基因的存在。发现U1-41的区域2序列和本发明人确定的ATCC23502的区域2序列是相同的。如实施例I中详细描述的，发现U1-41的基因簇含有(除IS2序列以外)17个预测编码软骨素生物合成相关蛋白的开放阅读框(而不是如Ninomiya等先前描述的15个)。这些基因的排列对于大肠杆菌2组荚膜基因簇是典型的。包含保守的基因kpsF、kpSE、kpSD、kpsU、kpsC和kpsS的区域I和包含保守的基因kpsM和kpsT的区域3在区域2的9个开放阅读框的两侧。区域I和区域3的基因包含大肠杆菌中所有2组荚膜的合成和易位所需的蛋白。区域I还包含两个编码酶的基因(kpsF和kpsU)，如上文指出的，预测该酶催化CMP-Kdo生物合成中的步骤。在区域2中确定的9个基因中，3个编码具有明确荚膜生物合成相关活性的蛋白kfoA(UDP-GlcNAc差向异构酶，转化UDP-GlcNAc为UDP-GalNAc前体)，kfoF (UDP-Glc-脱氢酶，转化UDP-Glc为UDP-GlcUA前体)和kfoC (软骨素合酶，即聚合酶，它可以将任一前体，UDP-GalNAc或UDP-GIcUA添加到受体软骨素分子上)。存在于K4荚膜基因簇的区域2中的其他基因kfoB、kfoG、kfoD、kfoE、kfoH(orfl)和kfol (orf3)编码的蛋白的功能是未知的。kfoB和kfoG基因编码与已知产生其他葡糖胺聚糖(GAG)荚膜的细菌，例如多杀巴斯德氏菌血清型A、F和DCTownsend等，J. Clin. Microbiol. 2001;39:924-929)和大肠杆菌血清型 K5 (Petit 等，Mol.Microbiol. 1995;4:611-620)的荚膜簇中存在的基因编码的蛋白同源的蛋白。这些间接证据表明kfoB和kfoG能够在含GAG的K4荚膜的生物合成中发挥功能。如在实施例7中详细解释的，本发明人已经发现kfoB和kfoG基因不是在大肠杆菌中产生软骨素必需的，但kfoG基因是软骨素的最优产生所必需的。在本发明之前，没有证据表明kfoD、kfoE、kfoH(或者orfl)和kfol (或orf3)参与K4荚膜的生物合成。有趣的是，发现4个连续的K4基因，kfoD、kfol (或orf3)、kfoE、和kfoH(或orfl)与连续的多杀巴斯德氏菌血清型B基因bcbDEFG和多杀巴斯德氏菌血清型E基因ecbDEFG具有同源性。但是，在本发明之前不知道这两个巴斯德氏菌属菌株是软骨素产生者，也不知道这些基因在大肠杆菌K4中的功能。因此，看来1^00、1^01(0忖3)、1^成和kfoH(orfl)可能不参与软骨素合成。如实施例6和7所示，这些基因都不是软骨素生物合成所需的，但这些基因中的一种或多种对于K4基因集产生的软骨素的果糖基化是必不可少的。
用U1-41K4荚膜基因簇的序列为基础，本发明人进一步设计了合成的基因，为在宿主，例如大肠杆菌、野油菜黄单胞菌、少动鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas elodea)和枯草芽孢杆菌中表达对这些基因进行了密码子优化。这些密码子优化的基因的设计和合成在实施例2中详细解释。实施例4描述了为在异源细菌中表达这些基因的质粒载体的构建。本发明中密码子优化的基因的完整的核苷酸序列和它们所编码的氨基酸序列如下所示。本发明中使用的kpsF的完整核苷酸序列如本文SEQ ID NO: I所示。kpsF是一个981核苷酸的序列(不包括终止密码子)，其编码一个327个氨基酸的序列，在本文中如SEQID N0:2所示。本发明中kpsE的完整核苷酸序列如本文SEQ ID N0:3所示。kpsE是一个1146核苷酸的序列(不包括终止密码子)，其编码一个382氨基酸的序列，在本文中如SEQID N0:4所示。本发明中kpsD的完整核苷酸序列如本文SEQ ID N0:5所示。kpsD是一个1674核苷酸的序列(不包括终止密码子)，其编码一个558氨基酸的序列，在本文中如SEQID N0:6所示。本发明中kpsU的完整核苷酸序列如本文SEQ ID N0:7所示。kpsU是一个738核苷酸的序列(不包括终止密码子)，其编码一个246氨基酸的序列，在本文中如SEQID N0:8所示。本发明中kpsC的完整核苷酸序列如本文SEQ ID N0:9所示。kpsC是一个2025核苷酸的序列(不包括终止密码子)，其编码一个675氨基酸的序列，在本文中如SEQID NO: 10所示。本发明中kpsS的完整核苷酸序列如本文SEQ ID NO: 11所示。kpsS是一个1209核苷酸的序列(不包括终止密码子)，其编码一个403氨基酸的序列，在本文中如SEQID N0:12所示。本发明中kpsM的完整核苷酸序列如本文SEQ ID N0:13所示。kpsM是一个774核苷酸的序列(不包括终止密码子)，其编码一个258氨基酸的序列，在本文中如SEQID NO: 14所示。本发明中kpsT的完整核苷酸序列如本文SEQ ID NO: 15所示。kpsT是一个666核苷酸的序列(不包括终止密码子)，其编码一个222氨基酸的序列，在本文中如SEQID NO: 16所示。本发明中kfoA的完整核苷酸序列如本文SEQID NO: 17所示。kfoA是一个1017核苷酸的序列(不包括终止密码子)，其编码一个339氨基酸的序列，在本文中如SEQID NO: 18所示。本发明中kf oB的完整核苷酸序列如本文SEQ ID NO: 19所示。kf oB是一个1638核苷酸的序列(不包括终止密码子)，其编码一个546氨基酸的序列，在本文中如SEQID NO: 20所示。本发明中kfoC的完整核苷酸序列如本文SEQ ID NO :21所示。kfoC是一个2058核苷酸的序列(不包括终止密码子)，其编码一个686氨基酸的序列，在本文中如SEQID NO: 22所示。本发明中kfoD的完整核苷酸序列如本文SEQ ID NO: 23所示。kfoD是一个1431核苷酸的序列(不包括终止密码子)，其编码一个477氨基酸的序列，在本文中如SEQID NO: 24所示。本发明中kfoE的完整核苷酸序列如本文SEQ ID NO: 25所示。kfoE是一个1566核苷酸的序列(不包括终止密码子)，其编码一个522氨基酸的序列，在本文中如SEQID NO: 26所示。本发明中kfoF的完整核苷酸序列如本文SEQ ID NO: 27所示。kfoF是一个1167核苷酸的序列(不包括终止密码子)，其编码一个389氨基酸的序列，在本文中如SEQID N0:28所示。本发明中kfoG的完整核苷酸序列如本文SEQ ID N0:29所示。kfoG是一个1464核苷酸的序列(不包括终止密码子)，其编码一个488氨基酸的序列，在本文中如SEQ ID NO:30 所示。 orfl (本文也称为kfoH)的完整核苷酸序列在本文中如SEQ ID N0:31所示。orfl是一个723核苷酸的序列(不包括终止密码子)，其编码一个241氨基酸的序列，在本文中如SEQ ID N0:32所示。orf3 (本文也称为kfol)的完整核苷酸序列在本文中如SEQ IDN0:33所示。orf3是一个378核苷酸的序列(不包括终止密码子)，其编码一个126氨基酸的序列，在本文中如SEQ ID NO:34所示。 在多个实施方案中，本发明包括DNA构建体，其包含大肠杆菌K4基因簇、大肠杆菌K4基因簇的一个或多个区域、大肠杆菌K4基因簇的基因的一个或多个子集、大肠杆菌K4基因簇的一个或多个单独基因、及其组合，其中所述构建体用于产生软骨素或在细菌宿主细胞中增加软骨素的量。在多个实施方案中，构建体可以包括上述的全部17个基因簇或上述 17 基因族的一个或多个基因，即 kpsF、kpsE、kpsD、kpsU、kpsC、kpsS、kpsM、kpsT、kfoA、kfoB、kfoC、kfoD、kfoE、kfoF、kfoG、kfoH和kfol。在一些实施方案中，该构建体包含K4簇的一个或多个区域(即，本文所述的区域1、2和/或3)。在一些实施方案中，该构建体包含K4簇基因的一个或多个子集(包括本文所述的区域1、2和/或3的基因的子集)。该构建体可以包含基因族，在族中的基因是以相对于族中任意其他基因的任意顺序存在的。正因如此，构建体内基因簇中的基因的顺序可以与K4簇中基因的天然存在顺序不同。类似地，构建体可以包含K4簇的一个区域、一个基因的子集、或一个基因，它们可以在构建体中以相对于K4簇任意其他区域、基因子集或单个基因的任意顺序存在。在一些实施方案中，基因在构建体中以特定顺序存在。构建体可以包含一个或多个分离自上面提到的大肠杆菌血清型K4菌株U1-41的天然基因(即具有存在于大肠杆菌K4U1-41或其它血清型K4菌株中的序列的基因)和/或一个或多个合成的基因，即基于分离自U1-41的天然基因的基因，但其中的DNA序列已经进行修饰以在细菌宿主细胞中获得最佳密码子选择而且不改变这些基因编码的氨基酸序列。这种合成基因的设计和制备在实施例2中说明。如上所述和在实施例6和7中进一步详细说明的，kfoD、kfol、kfoE和kfoH基因中的一种或多种对于在大肠杆菌中果糖基化软骨素是必不可少的，但是这些基因都不是合成软骨素所需的。同时删除或灭活所有这四种基因导致产生未果糖基化的软骨素。在一些实施方案中，本发明的构建体不含kfoD、kfoI、kfoE和kfoH中的一种或多种的功能性基因。换言之，在这些实施方案中，构建体中不存在kfoD、kfol、kfoE和kfoH中的一种或多种的功能性基因。不含功能性基因的构建体(即不存在某功能性基因的构建体)包括其中整个基因不存在的构建体，以及其中的基因或其部分存在但是非功能性(即无效的)的构建体。在一些实施方案中，本发明的构建体包含已经修饰以灭活kfoD、kfoI、kfoE和kfoH中的一个或多个的基因簇。在一些实施方案中，本发明还包括构建体,其包含含有kpsF、kpsE、kpsD、kpsU、kpsC、kpsS、kfoA、kfoC和kfoF的基因族，其中所述构建体不含kfoD、kfol、kfoE和kfoH中的一种或多种的功能性基因。在一些实施方案中，构建体适于在如本文所述的非致病性细菌宿主细胞中产生软骨素。在一些实施方案中，软骨素是非果糖基化的。在一些实施方案中，构建体可以进一步包含kfoG和/或kfoB。如上所述，没有发现kfoB和kfoG基因是产生软骨素必不可少的，但是发现kfoG基因是最优产生软骨素所必需的(参见实施例7)。在一些实施方案中，本发明的构建体可以进一步包含kpsM和/或kpsT。在一些实施方案中，构建体用于产生从细胞中分泌的重组软骨素。在一些实施方案中，这些构建体包括表达载体pDD66(含kpsMT-kfoABCFG-kpsFEDUCS 的表达载体)、pDD67 (包含 kpsFEDUCS-kpsMT-kfoABCFG的表达载体)、PCX040 (包含kp sMT-kf oACFG-kp sFEDUCS的表达载体)、pCX041 (包含kp sMT-kf oABCF-kp sFEDUCS 的表达载体)、pCX042 (包含 kpsFEDUCS-kpsMT-kfoACFG 的表达载体)、PCX043 (包含kpsFEDUCS-kpsMT-kf oABCF的表达载体)和pCX096 (包含kpsFEDUCS-kfoABCFG的表达载体)。另一个实施方案是表达质粒pBR1052。如实施例4中描述的，pBR1052包含与pDD66 (kp sMT-kf oABCFG-kp sFEDUCS)相同的K4基因集，并额外具有插入kpsF基因紧邻上游的Pm启动子序列的第二拷贝。pDD66的核苷酸序列如SEQ ID NO: 35所示；pDD67的核苷酸序列如SEQ ID NO: 36所示；pCX040的核苷酸序列如SEQ ID NO: 37所示；pCX041的核苷酸序列如SEQ ID NO:38所示；pCX042的核苷酸序列如SEQ ID NO:39所示；PCX043的核苷酸序列如SEQ ID N0:40所示;pCX096的核苷酸序列如SEQ ID NO: 149所示；和PBR1052的核苷酸序列如SEQ ID N0:41所示。这些DNA构建体的设计和构建在实施例4中详细说明。在一些实施方案中，本发明包括构建体，其用于产生细胞内软骨素的目的，即不从宿主细胞分泌的软骨素。软骨素的胞内产生是可取的以消除培养基中高水平多糖导致的发酵的粘度。此外，与分泌相比细胞内产生可能实现更高水平的软骨素。在一些实施方案中，构建体不含区域3的kpsM和kpsT中至少一种的功能性基因。在一些实施方案中，构建体包含基因簇，其不含或已经修饰以灭活区域3的kpsM和kpsT中至少一种。在一些实施方案中，构建体不含区域I的kpsE、kpsD、kpsC和kpsS中至少一种的功能性基因。在一些实施方案中，构建体包含基因簇，其不含或已经修饰以灭活区域I的kpsE、kpSD、kpSC和kpsS中至少一种。在一些实施方案中，构建体不含区域3的kpsM和kpsT中至少一种和区域I的kpsE、kpsD、kpsC和kpsS中至少一种的功能性基因。在一些实施方案中，构建体包含一个基因簇，其不含或已经修饰以灭活区域3的kpsM和kpsT中至少一种和区域I的kpsE、kpsD、kpsC和kpsS中至少一种。这些构建体在实施例4和9中描述。在一些实施方案中，本发明包括构建体，其包含含有kfoA、kfoC和kfoF的基因簇，其中所述基因簇不含kpsM、kpsT、kpsE、kpsD、kpsC、和kpsS中的一种或多种的功能性基因。在一些实施方案中，构建体适于在如本文所述的非致病性细菌宿主细胞中产生软骨素。在一些实施方案中，软骨素不从宿主细胞分泌。在一些实施方案中，软骨素是非果糖基化的。在一些实施方案中，构建体也不含kfoD、orf3、kfoE和orfl中的一种或多种的功能性基因。在一些实施方案中，构建体可以进一步包含kfoG和/或kfoB。在一些实施方案中，构建体包含 kfoA、kfoB、kfoC、kfoF 和 kfoG。在一些实施方案中，本发明的构建体包含选自kfoA、kfoB、kfoC、kfoF、kfoG、及其组合的基因，其中所述构建体不含kpsM、kpsT、kpsE、kpsD、kpsC和kpsS中一种或多种的功能性基因。在一些实施方案中，构建体适于在如本文所述的非致病性细菌宿主细胞中产生软骨素。在一些实施方案中，构建体适于在如本文所述的非致病性细菌宿主细胞中增加软骨素的量。在一些实施方案中，将构建体转移至细菌宿主细胞，其包含一个或多个已经存在的大肠杆菌K4基因簇拷贝、簇的区域、簇的基因子集、或已经整合到宿主染色体中的簇的基因。在一些实施方案中，软骨素是非果糖基化的。在一些实施方案中，构建体也不含kfoD、orf3、kfoE和orfl中一种或多种的功能性基因。在一些实施方案中，构建体包含kfoA、kfoB、kfoC、kfoF 和 kfoG。 在一些实施方案中，本发明的构建体包含表达载体pCX039(包含kfoABCFG的表达载体)、pCX044(包含表达载体的kfoACFG)、pCX092 (包含kf oABCF的表达载体)、pCX045(包含 kp sMT-kf oABCFG-kp sFEDUS 的表达载体)和 pCX048 (包含 kpsM_kfoABCFG_kp sFEDUCS 的表达载体)。PCX039的核苷酸序列如SEQ ID NO:42所示；pCX044的核苷酸序列如SEQ IDNO:43所示；pCX092的核苷酸序列如SEQ ID NO: 154所示；pCX045的核苷酸序列如SEQ IDNO:44所示；和pCX048的核苷酸序列如SEQ ID NO:45所示。这些DNA构建体的设计和构建在实施例4中详细说明。在一些实施方案中，本发明的构建体包含表达载体pCX075(包含kfoABFG的表达载体)、pCX081 (包含kfoABCG的表达载体)、pCX082 (包含kfoBCFG的表达载体)、pCXlOl (包含kf oABCFG-kp sMT的表达载体)、pBRl 102 (包含kfoABCFG的表达载体)、pBRllOO (包含kfoABCFG的表达载体)和pBRllOl (包含kfoABCFG的表达载体)。pCX075的核苷酸序列如SEQID NO: 153所示；pCX081的核苷酸序列如SEQ ID NO: 151所示；pCX082的核苷酸序列如SEQ ID N0:152所示；pCX101的核苷酸序列如SEQ IDN0:150所示；pBR1102的核苷酸序列如SEQ ID NO: 170所示；pBR1100的核苷酸序列如SEQ ID NO: 171所示；和PBR1101的核苷酸序列如SEQ IDNO: 172所示。这些DNA构建体的设计和构建在实施例18和20中详细说明。本发明的构建体可以包含一种或多种已经进行修饰以在如本文所述的细菌宿主细胞中获得最佳密码子选择的基因。本发明的构建体可以进一步包含启动子。启动子应该能够在如本文所述的细菌宿主细胞中驱动基因簇的表达。许多这类用于在所需的细菌宿主细胞驱动表达的启动子是本领域技术人员熟知的并可用于本发明。已经通常用于表达异源蛋白的启动子的例子，包括但不限于，Pm、lac、trp、tac、λ pL、T7、phoA、araC、xapA、cad 和 recA (参见,例如,Weikert等，Curr. Opin. Biotechnol. 1996;7:494-499)。这样的启动子可以是组成型或诱导型的。终止控制区也可以是来自于优选的宿主天然的各种基因。任选地，终止位点可以是不必要的。在一些实施方案中，本发明的构建体包含Pm启动子以及xylS调节基因(Mermod等，J. Bacteriol. 1986; 167:447-54)。分离自恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida) TOL M粒的Pm启动子和它的调节基因xylS提供了一种在多种革兰氏阴性细菌中显示功能的强的、调节良好的启动子(Blatny等，Plasmid 1997;38:35-51)。XylS蛋白可以作为单体或二聚体存在。在二聚体形式中，XylS蛋白可以结合Pm启动并刺激转录。某些效应分子，例如直接结合XylS并促进该蛋白二聚化的间苯甲酸(3-苯甲酸甲酯)(meta-toluicacid(3-methylbenzoate)),提高XylS蛋白质的二聚化以及由此在Pm启动子的转录起始(Dominguez-Cuevas 等，J. Bact. 2008; 190:3118-3128)。启动子可以与基因族的一个或多个基因可操作地连接。
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本发明的构建体可以进一步包含第二启动子。例如，如果在替代宿主中分析克隆的K4基因的表达分析表明某一基因或基因集的表达水平低于最佳,可以在选择的位点对表达构建体添加第二启动子以增强不是在最佳水平表达的基因或基因集的转录。通常情况下，添加的启动子将插入感兴趣的基因或基因集的紧邻上游(即5’-)。第二启动子可以是Pm或上面所列的作为用于表达K4基因集的例子的任何启动子。在一些实施方案中，第二启动子可以是Pm。第二启动子可以与基因簇的一个或多个基因可操作地连接。在一个实施方案中，第二启动子可以与kpsFEDUCS基因集可操作地连接。参见，例如，如实施例4中描述的表达载体PBR1052。对于任何给定的质粒或染色体基因集,通过Western印迹分析凭经验确定使用第二启动子可以利于表达或增加其表达的基因或基因的组合。本发明的构建体可以进一步包含赋予特定抗生素抗性的抗生素抗性基因。这样的基因是本领域公知的。抗生素抗性基因的例子，包括但不限于，氯霉素抗性基因(CamR)、卡那霉素抗性基因(KanR)，氨苄青霉素抗性基因(AmpR)、四环素抗性基因(TetR)、大观霉素抗性基因(SpcR)、磺酰胺抗性基因(SuR)、博来霉素抗性基因(BleR)、链霉素抗性基因(StrR)、羧苄青霉素抗性基因(CbR)、和红霉素抗性基因(EryR)。本发明的构建体是用于在细菌宿主细胞中产生软骨素。虽然可以在本发明中使用任意细菌细胞作为宿主细胞，在一些实施方案中，宿主是革兰氏阴性细菌。革兰氏阴性细菌的例子包括但不限于埃希氏菌属、假单胞菌属、黄单胞菌属、甲基单胞菌属、不动杆菌属和鞘氨醇单胞菌属。在一些实施方案中，宿主是非致病性的革兰氏阴性细菌。非致病性革兰氏阴性细菌的例子包括但不限于非致病性大肠杆菌，例如大肠杆菌K-12或大肠杆菌B、野油菜黄单胞菌、少动鞘氨醇单胞菌和恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)。在一些实施方案中，通过同源重组缺失或灭活本文所述的细菌宿主细胞的内源基因。无法制造自己的天然胞外多糖的宿主衍生物是需要的。使用这种衍生物宿主将利于重组软骨素(rCH)生物合成的可视和化学鉴定，以及当引入K4基因集时，宿主产生的rCH的纯化。此外，在适当设计的衍生物宿主中的rCH生物合成不会受到天然多糖合成竞争的限制。例如，灭活或缺失天然多糖生物合成途径的第一糖基转移酶基因会防止利用天然途径的任何潜在脂质载体并防止在天然途径的酶与脂质载体的K4酶，或与作用于新生多糖链并可能限制利用度的任意其他细胞组分之间的竞争。整个天然生物合成基因簇的失活(如通过缺失)将去除大多数的竞争因素，但可能会对生理和/或膜结构产生不良影响。如实施例3中详细描述的，通过举例的方式但不限于这些例子，本发明使用大肠杆菌K-12 (“K-12”)、大肠杆菌B (“EcB”)、和野油菜黄单胞菌野油菜致病变种(Xanthomonascampestris pv. campestris) ( “Xcc”)作为宿主表达本发明的构建体。利用如实施例3详细描述的两个步骤的“pop-in/pop-out”同源性驱动的方法进行在编码合成天然胞外多糖的酶的基因簇的一个或多个基因中包含缺失的衍生宿主的产生。例如，可拉酸(M抗原)是由许多肠细菌产生的胞外多糖。构建了在可拉酸生物合成方面缺乏的或有缺陷的大肠杆菌K-12和大肠杆菌B菌株。菌株MSC188和MSC175是大肠杆菌K-12菌株的衍生物，其分别包含整个可拉酸操纵子，和编码在可拉酸生物合成中负责将第一个糖加载到脂质载体上的糖基转移酶的wcaj基因的缺失。菌株MSC364是大肠杆菌B的衍生物，其包含整个可拉酸操纵子的缺失。类似地，构建了在胞外多糖，黄原胶的生物合成方面缺乏的或有缺陷的野油菜黄单胞菌野油菜致病变种菌株。菌株MSC225和MSC226是Xcc菌株的衍生物，其包含编码糖基转移酶I酶的gumD基因的缺失，而菌株MSC255、MSC256和MSC257包含整个黄原胶操纵子的缺失。本发明涉及一种产生包含任何一种或多种本发明的构建体的非致病性细菌宿主细胞的方法，其包括将任何一种或多种本发明的构建体转移至非致病性细菌宿主细胞。可以通过任何已知的表达存在于构建体中的基因的方法，将本发明的构建体引入到细菌宿主细胞中。这样的方法可包括但不限于转化、电穿孔、接合或转导。本发明涉及非致病性细菌宿主细胞，其包含任何一种或多种本发明的构建体。正因如此,本发明也包括通过将包含本发明的表达载体的构建体引入宿主菌株,包括有缺失的衍生菌株，来构建的各种菌株。在实施例6-9、11、13和14中详细描述了某些例子。在一些实施方案中，将本发明的构建体中含有的基因导入受体宿主菌株的染色体中使得基因整合到宿主染色体中。将克隆的基因置于染色体中提供以下优点消除了保持选择压力以保持携带软骨素生物合成基因的质粒或载体的要求，从而能潜在地提供更稳定的表达菌株或提供在没有任何选择压力的情况下是稳定的表达菌株。相应地，本发明包括包含本发明的构建体中含有任何一种或多种基因的一个或多个拷贝整合到其染色体中的细菌菌株。作为示例，本发明人构建了包含整合到其染色体中用于软骨素生物合成的一个或多个合成的基因的大肠杆菌K-12和Xcc菌株。本发明也包括通过将包含本发明的表达载体的构建体引入包含整合到其染色体的构建体的一个或多个拷贝的本发明的菌株构建的菌株。在一些实施方案中，使用本发明的构建体和本文所述的方法，将K4基因簇、簇的一个或多个区域、簇的基因的一个或多个子集、或簇的一个或多个基因整合到如本文所述的非致病性细菌宿主细胞的染色体中。在一些实施方案中，将基因簇、区域、子集或基因的两个或更多个拷贝整合到非致病性细菌宿主细胞的染色体中。在一些实施方案中，将基因簇、区域、子集或基因的 2-20、2-19、2-18、2-17、2-16、2-15、2-14、2-13、2-12、2-11、2-10、
2-9、2-8、2-7、2-6、2-5、2-4或2-3个拷贝整合到非致病性细菌宿主细胞的染色体中。在一些实施方案中，将基因簇、区域、子集或基因的2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、
17、18、19或20个拷贝整合到非致病性细菌宿主细胞的染色体中。在一些实施方案中，使用相同的构建体将两个或更多个拷贝整合到宿主染色体中。在一些实施方案中，使用不同 的构建体将两个或更多个拷贝整合到宿主染色体中。在一些实施方案中，也将启动子整合到宿主染色体中以控制整合到宿主染色体中的基因簇、区域、子集、或基因的表达。在一些实施方案中，整合到宿主染色体中的两个或更多个拷贝从相同的启动子或不同的启动子表达。在一些实施方案中，将选自kf0A、kf0B、kf0C、kf0F、kf0G及其组合的区域2基因的两个或更多个拷贝整合到宿主染色体中。在一些实施方案中，将kfoA、kfoB、kfoC、kfoF、kfoG的两个或更多个拷贝整合到宿主染色体中。在一些实施方案中，将区域I、区域3、或区域I或区域3的一个或多个基因的两个或更多个拷贝整合到宿主染色体中。在一些实施方案中，将本发明的构建体中含有的基因整合到细菌宿主细胞的染色体中，该宿主细胞也包含一个或多个本发明的构建体，其包含未整合到染色体中的基因。这样的菌株的例子在实施例10-13和20-21中有详细描述。描述的构建体和菌株
可用于产生软骨素。本发明的菌株的例子包括但不限于，大肠杆菌K-12菌株MSC279、MSC280、MSC322、 MSC323、MSC324、MSC325、MSC328、MSC346、MSC356、MSC359、MSC392、MSC402、MSC403、MSC404、MSC405、MSC410、MSC411、MSC436、MSC437、MSC438、MSC439、MSC458、MSC459、MSC460、MSC466、MSC467、MSC498、MSC499、MSC500、MSC510、MSC511、MSC522、MSC526、MSC537、MSC551、MSC561、MSC562、MSC563、MSC564、MSC566、MSC567、MSC619、MSC625、MSC627、MSC640、MSC641、MSC643、MSC646、MSC650、MSC656、MSC657、MSC658、MSC659、MSC660、MSC669、MSC670、MSC671、MSC672、MSC673、MSC674、MSC675、MSC676、MSC677、MSC678、MSC679、MSC680、MSC681、MSC682、MSC683、MSC684、MSC687、MSC688、MSC689、MSC690、MSC691、MSC692、MSC693、MSC694、MSC700、MSC701、MSC702、MSC722、MSC723 和 MSC724 ;大肠杆菌 B 菌株 MSC315、MSC316、MSC317、MSC319和 MSC347 ;和野油菜黄单胞菌菌株 MSC326、MSC348、MSC350、MSC480、MSC461、MSC469 和MSC494。本发明涉及一种产生软骨素的方法，包括将任何一种或多种本发明的构建体转移到非致病性细菌宿主细胞中，并在发酵条件下培养细菌宿主细胞，其中软骨素由细菌宿主细胞产生。本发明涉及一种产生软骨素的方法，包括在足以产生软骨素的发酵条件下培养包含任何一种或多种本发明的构建体的非致病性细菌宿主细胞。本发明包括一种产生未硫酸化的软骨素的方法。该方法包括在足以产生未硫酸化的软骨素的发酵条件下培养本发明的非致病性细菌宿主细胞。在一些实施方案中，该方法包括将本发明的构建体转移至非致病性细菌宿主细胞并在发酵条件下培养细菌宿主细胞，导致细菌宿主细胞产生未硫酸化的软骨素。在实施例7-15中描述了各种实施方案。具体而言，实施例6_9、11、13和14展示了当本发明的构建体转化到宿主细胞中时证明产生软骨素的数据，而实施例10-15展示了当本发明的构建体整合到宿主细胞染色体中时证明产生软骨素的数据。依赖于特定构建体和其中基因的组合，产生果糖基化或非果糖基化的软骨素是可能的(参见实施例6和7)。此外，依赖于特定构建体和其中基因的组合，重组软骨素可以被分泌到培养基中或保留在胞内位置(参见实施例9)。培养细菌细胞的方法和培养基的组成在本领域中是公知的并可用于本发明。为了重组软骨素的最优产生，应优化各种培养参数，例如温度、PH值、溶解氧浓度、诱导剂浓度和培养诱导后的持续时间，以及包括其中营养物质和盐含量的培养基的组成。实施例8描述了在各种生长培养基、温度和诱导条件下软骨素的重组产生。基于此信息，进一步优化这些参数对于本领域技术人员将是显而易见的。在一些实施方案中，细菌宿主细胞培养在
20。C-37。C，例如 20° C、21。C、22。C、23。C、24。C、25。C、26。C、27。C、28。C、29。C、30° C、31。C、32° C、33° C、34° C、35。C、36° C 或 37° C。在一些实施方案中，培养基含有酵母提取物、蛋白消化物、磷酸钾和水。在一些实施方案中，培养基含有甘油(glycerine)(也称为glycerol)。在一些实施方案中，在24_72小时内从细菌宿主细胞分泌lg/L-50g/L、5g/L-50g/L或15g/L_50g/L的未硫酸化的软骨素。在一些实施方案中，本发明的产生软骨素的方法进一步包括从细菌宿主细胞中回收软骨素。在一些实施方案中，本发明的产生软骨素的方法进一步包括从细胞外培养基中回
收软骨素。可以通过醇沉淀或本领域中已知的任何技术从发酵液中回收软骨素，包括但不限于冻干，以获得干燥粉末。在一些实施方案中，产生软骨素的方法可以包括纯化回收的软骨素的步骤。软骨素的纯化可以通过本领域已知的任何技术完成，包括，例如碱处理、酸处理、蛋白酶处理、层析、提取、溶剂提取、膜分离、电渗析、反渗透、蒸馏、沉淀、化学衍生、结晶、超滤和/或使用有机溶剂的多糖沉淀。参见，例如，Taniguchi, N.，1982.Isolation and analysis of glycosaminoglycans. Pages20-40in:Glycosaminoglycansand Proteoglycans in Physiological and Pathological Process of BodySystems. R. S. Varma 和 R. Varma, ed. Karger, Basel, Switzerland ；Fraquharson等,Oral.Microbiol. Immunol. 2000;15:151-157;Manzoni 等,J. Bioact. Comp.Polm. 1993;8:251-257;Manzoni 等，Biotechnol. Letters 2000;22:759-766;Johns等，Aust. J. Biotechnol. 1991; 5:73-77 ;这些文献中的每一个通过述及整体并入本文。沉淀溶剂的例子包括但不限于丙酮、甲醇、乙醇或异丙醇。在一些实施方案中，产生软骨素的方法进一步包括硫酸化软骨素。本发明涉及一种产生硫酸软骨素的方法，包括由本发明的方法产生软骨素和硫酸化软骨素。可以化学地或酶学地进行硫酸化。化学硫酸化多糖的几个方法在本领域中是已知的，其中任何一种均可用于本文。例如，硫酸化可以通过将多糖溶解到有机溶剂中，随后在受控温度下与硫酸化剂反应来完成。溶解溶剂的例子包括但不限于甲酰胺、N，N- 二甲基甲酰胺(DMF)、吡啶或二甲亚砜。硫酸化试剂的例子可以包括但不限于氯磺酸、三氧化硫和各种三氧化硫-胺复合物。适合三氧化硫-胺复合物的胺的例子包括但不限于吡啶、DMF、三甲胺、三乙胺(TEA)和哌啶。在一些实施方案中，在重组软骨素硫酸化时，硫酸化的产品包含与天然硫酸软骨素对应的5. 0-7. 5%的硫含量。在进一步的实施方案中，硫酸化产物不发生显著的解聚。实施例15描述了一种化学硫酸化重组软骨素的方法。在一些实施方案中，硫酸化本发明的方法产生的软骨素包括在甲酰胺中将三氧化硫-三乙胺复合物或氯磺酸与软骨素混合。本发明涉及通过任何本发明描述的方法产生的重组软骨素或重组硫酸软骨素。本发明涉及一种组合物，该组合物包含通过任何本发明描述的方法产生的重组软骨素或重组硫酸软骨素。在一些实施方案中，组合物可包含如葡糖胺、硫酸葡糖胺或盐酸葡糖胺的补充齐U。葡糖胺(2-乙酰氨基-2-脱氧葡萄糖)是一种在软骨中存在的天然存在的化合物。硫酸葡糖胺是在软骨基质和滑液中的糖胺聚糖的一种正常组分。一些临床试验支持在骨关节炎，特别是膝盖治疗中使用硫酸葡糖胺(Herrero-Beaumont等，ArthritisRheum. 2007;56:555-67;Bruyere 等，Osteoarthritis Cartilage 2008;16:254-60)。已经提出，通过加强软骨和协助糖胺聚糖的合成，硫酸部分在滑液中提供临床益处(SilbertGlycobiology2009; 19:564-567)。在营养补充剂中葡糖胺通常与硫酸软骨素组合提供，旨在促进关节健康和作为骨关节炎的治疗。在一些实施方案中，本发明包括在患者中保持健康的关节功能的方法。在其它实施方案中，本发明包括用于治疗或预防骨关节炎、间质性膀胱炎和/或滑膜炎的方法。这些方法包括向受试者施用包含上述的重组硫酸软骨素的组合物。本发明的组合物通常可以按治疗有效量施用。本发明涉及选择性结合K4软骨素生物合成基因簇的基因编码的蛋白的抗体或抗体片段。这些抗体和抗体片段可以用于确认细菌宿主中K4软骨素生物合成基因簇的基因的表达。在一些实施方案中，抗体或抗体片段结合选自下组的氨基酸序列SEQ ID N0:92的KpsF,SEQ ID N0:93 的KpsE、SEQ ID NO:94 的KpsD、SEQ ID NO:95 的KpsU、SEQ ID N0:96 的KpsC,SEQ ID NO:97 的 KpsS、SEQ ID NO:91 的 KpsT、SEQ ID NO:83 的 KfoA、SEQ ID NO:84 的 KfoB、SEQ ID NO:85 的 KfoC、SEQ ID NO:86 的 KfoI(0rf3)、SEQ ID NO:87 的 KfoE、SEQID NO:88 的 KfoH(Orfl)、SEQ ID NO:89 的 KfoF、和 SEQ ID NO:90 的 KfoG。在实施例 5 中详细描述了抗体的产生。发酵培养基和条件在产生软骨素的方法中，在发酵培养基中培养具有本文所述的遗传修饰的微生物以产生软骨素。合适的或有效的发酵培养基是指在其中本发明的遗传修饰的微生物在培养时能够产生软骨素的任何培养基。这种培养基通常是包含可同化的碳、氮和磷源的含水培养基。这种培养基还可以包括适当的盐、矿物质、金属和其他营养物质。下文和实施例部分描述了示例性培养基。但是应当认识到，各种发酵条件是合适的并可以由本领域技术人员来选择。可用于合适的发酵培养基的可同化碳的来源包括但不限于，糖及其聚合物，包括糊精、蔗糖、麦芽糖、乳糖、葡萄糖、果糖、甘露糖、山梨糖、阿拉伯糖和木糖；脂肪酸；有机酸，如乙酸；伯醇，如乙醇和正丙醇；和多元醇如甘油。本发明的碳源包括多元醇、单糖、二糖和二糖。在一些实施方案中，碳源是甘油。碳源，如甘油在发酵培养基中的浓度应促进细胞生长，但不能过高以至抑制所用微生物的生长。通常情况下，以一种碳源，如甘油进行发酵，其以达到所期望的生长和生物量水平的水平添加，但维持在低浓度水平(低于lg/L)以避免有机酸，特别是乙酸的积累。在其它实施方案中，碳源，如甘油在发酵培养基中的浓度大于lg/L、大于2g/L、或大于5g/L.另外，碳源，如甘油在发酵培养基中的浓度通常是小于100g/L、小于50g/L、或小于20g/L。应该指出的是，发酵组分浓度的参考可以参考初始和/或进行中的组分浓度。在某些情况下，可能希望的是在发酵过程中使发酵培养基中的碳源用完。可用于合适的发酵培养基的可同化氮的来源包括但不限于，简单的氮源、有机氮源和复杂的氮源。这样的氮源包括无水氨、铵盐和动物、植物和/或微生物来源的物质。合适的氮源包括但不限于，蛋白水解物、微生物生物质水解物、蛋白胨、酵母提取物、硫酸铵、氢氧化铵、尿素和氨基酸。通常情况下，发酵培养基中氮源的浓度大于O. lg/L、大于O. 25g/L、或大于I. Og/L。但是超过特定浓度，向发酵培养基中加入氮源是不利于微生物生长的。其结果是，发酵培养基中的氮源的浓度小于20g/L、小于10g/L、或小于5g/L。此外，在某些情况下，可能希望的是在发酵过程中使发酵培养基中的氮源用完。有效的发酵培养基可以包含其它化合物，例如消泡剂、无机盐、维生素、痕量金属和/或生长促进剂。这样的其它化合物也可以存在于有效培养基中的碳、氮或矿物源中或者可以专门加入培养基中。发酵培养基还可以包含合适的磷源。这种磷源包括无机磷源和有机磷源。磷源包括但不限于磷酸盐，如磷酸二氢或磷酸一氢钠和钾盐、磷酸铵及其混合物。通常情况下，发酵培养基中磷的浓度大于I. Og/L、大于2. Og/L、或大于5. Og/L。但是超过特定浓度，向发酵 培养基中加入磷是不利于微生物生长的。因此，发酵培养基中磷浓度通常小于20g/L、小于15g/L、或小于 10g/L。 合适的发酵培养基还可以包含镁源。在一些实施方案中，镁源是生理上可接受的盐的形式，如硫酸镁七水合物，虽然可以以贡献相似量的镁的浓度使用其它镁源。通常情况下，发酵培养基中镁的浓度大于O. 5g/L、大于I. Og/L、或大于2. Og/L。但是超过特定浓度，向发酵培养基中加入镁是不利于微生物生长的。因此，发酵培养基中镁浓度通常小于IOg/L、小于5g/L、或小于3g/L。另外，在某些情况下，可能希望的是在发酵过程中使发酵培养基中的镁源用完。发酵培养基还可以包含生物学上可接受的螯合剂，如柠檬酸三钠二水合物或柠檬酸。在此情况下，发酵培养基中螯合剂的浓度大于0. lg/L、大于0. 2g/L、大于0. 5g/L、或大于lg/L。但是超过特定浓度，向发酵培养基中加入螯合剂是不利于微生物生长的。因此，发酵培养基中螯合剂浓度通常小于10g/L、小于5g/L、或小于2g/L。发酵培养基最初也可以包含生物学上可接受的酸或碱以维持所需的发酵培养基pH。生物学上可接受的酸包括但不限于，盐酸、硫酸、硝酸、磷酸及其混合物。生物学上可接受的碱包括但不限于，无水氨、氢氧化铵、氢氧化钠、氢氧化钾及其混合物。在本发明的一些实施方案中，使用的碱是氢氧化铵。发酵培养基还可以包含生物学上可接受的钙源，包括但不限于氯化钙。通常情况下，发酵培养基中钙源，如二水氯化钙的浓度是5mg/L-2000mg/L、20mg/L-1000mg/L、或50mg/L_500mg/L。发酵培养基也可以包含氯化钠。通常情况下，发酵培养基中的氯化钠浓度的范围为 0. lg/L-5g/L、lg/L-4g/L、或者 2g/L_4g/L。如之前讨论的，发酵培养基还可以包含痕量金属。这样的痕量金属可以作为贮液添加到发酵培养基中，为方便起见，贮液可与发酵培养基中的其余部分分开制备。用于发酵培养基的合适的痕量金属贮液如下表IA和IB所示。通常情况下，加入到发酵培养基中的这样的痕量金属溶液的量大于lmL/L、大于5mL/L、或大于10mL/L。但是超过特定浓度，向发酵培养基中加入痕量金属是不利于微生物生长的。因此，加入发酵培养基的这种痕量金属溶液的量通常小于100mL/L、小于50mL/L、或小于30mL/L。应当指出的是，除了在贮液中添加微量金属，可以单独加入各组分，各自的范围单独地对应于上述范围的痕量金属溶液指定的组分的量。如下表IA所示，用于本发明的合适的痕量金属溶液包括但不限于，七水硫酸亚铁、五水硫酸铜、七水硫酸锌、二水钥酸钠、六水氯化钴和一水硫酸锰。将盐酸加入到贮液以保持溶液中的痕量金属盐。表 IA痕量金属贮液A
权利要求
1.一种含有包含 kpsF、kpsE、kpsD、kpsU、kpsC、kpsS、kfoA、kfoC、和 kfoF 的基因族的构建体，其中所述基因簇不含kfoD、orf3 (kfol)、kfoE、或orfl (kfoH)中的一种或多种的功能性基因，并且其中所述构建体适于在非致病性细菌宿主细胞中产生软骨素。
2.依照权利要求I所述的构建体，其中所述软骨素是非果糖基化的。
3.依照权利要求I所述的构建体，其中所述软骨素是从宿主细胞分泌的。
4.依照权利要求I所述的构建体，其中所述基因簇进一步包含kfoG。
5.依照权利要求I所述的构建体，其中所述基因簇进一步包含kfoB。
6.依照权利要求I所述的构建体，其中所述基因簇进一步包含kpsM和kpsT。
7.依照权利要求I所述的构建体，其中所述构建体包含pDD66、pDD67、pCX040、pCX041、pCX042、pCX043、pCX096、或 pBR1052。
8.一种含有包含kfoA、kfoC、和kfoF的基因簇的构建体，其中所述基因簇不含kpsM、kpsT、kpsE、kpsD、kpsC、或kpsS中的一种或多种的功能性基因，并且其中所述构建体适于在非致病性细菌宿主细胞中产生软骨素。
9.一种包含选自kfoA、kfoB、kfoC、kfoF、kfoG及其组合的基因的构建体，其中所述构建体不含kpsM、kpsT、kpsE、kpsD、kpsC、或kpsS中的一种或多种的功能性基因，并且其中所述构建体适于在非致病性细菌宿主细胞中产生软骨素或增加软骨素的量。
10.依照权利要求8或9所述的构建体，其中所述软骨素不是从宿主细胞分泌的。
11.依照权利要求8或9所述的构建体,其中所述构建体还不含kfoD、orf3、kfoE、或orfl中的一种或多种的功能性基因。
12.依照权利要求8或9所述的构建体，其中所述软骨素是非果糖基化的。
13.依照权利要求8所述的构建体，其中所述基因簇进一步包含kfoG、kfoB、或其组合。
14.依照权利要求8或9所述的构建体,其中所述构建体包含kfoA、kfoB、kfoC、kfoF、和 kfoGo
15.依照权利要求8或9所述的构建体，其中所述构建体包含pCX039、pCX044、或PCX092。
16.依照权利要求9所述的构建体，其中所述构建体包含pCX075、pCX081、pCX082、pCX101、pBR1102、pBR1100、*pBR1101。
17.依照权利要求11所述的构建体，其中所述构建体包含PCX045或pCX048。
18.依照权利要求1-17任一项所述的构建体，其中修饰一个或多个基因用于在细菌宿主细胞中的最佳密码子选择。
19.依照权利要求1-18任一项所述的构建体，其进一步包含启动子。
20.依照权利要求19所述的构建体,其中所述启动子选自下组Pm、Plac、Ptrp、Ptac、λ pL、PT7、PphoA> ParaC> PxapA, Pcad,和 PrecA0
21.依照权利要求20所述的构建体，其中所述启动子为Pm。
22.依照权利要求1-21任一项所述的构建体，其中所述构建体进一步包含第二启动子。
23.依照权利要求22所述的构建体,其中所述第二启动子选自下组Pm、Plac、Ptrp、Ptac、λ pL、PT7、PphoA> ParaC> PxapA> Pcad、和 PrecA0
24.依照权利要求23所述的构建体，其中所述第二启动子为Pm。
25.依照权利要求22所述的构建体，其中所述第二启动子与一个或多个基因可操作地连接。
26.依照权利要求25所述的构建体，其中所述第二启动子与kpsFEDUCS可操作地连接。
27.依照权利要求1-26任一项所述的构建体,其中所述构建体进一步包含xylS调节基因。
28.依照权利要求1-27任一项所述的构建体，其进一步包含抗生素抗性基因。
29.依照权利要求28所述的构建体，其中所述抗生素抗性基因选自下组氯霉素(CamR)、卡那霉素(KanR)，氨苄青霉素(AmpR)、四环素(TetR)、博来霉素(BleR)、大观霉素(SpcR)、磺酰胺(SuR)、链霉素(StrR)、羧苄青霉素(CbR)、和红霉素(EryR)。
30.依照权利要求1-29任一项所述的构建体，其包含K4基因簇。
31.依照权利要求1-30任一项所述的构建体，其中所述细菌宿主细胞是或者是源自选自下组的非致病性生物埃希氏杆菌属(Escherichia)、假单胞菌属(Pseudomonas)、黄单胞菌属(Xanthomonas)、甲基单胞菌属(Methylomonas)、不动杆菌属(Acinetobacter)^PI鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)。
32.包含权利要求1-31任一项所述的构建体的非致病性细菌宿主细胞。
33.依照权利要求32所述的非致病性细菌宿主细胞，其中所述细菌宿主细胞是选自下组的细菌菌株MSC279、MSC280、MSC315、MSC316、MSC317、MSC319、MSC322、MSC323、MSC324、MSC325、MSC326、MSC328、MSC346、MSC347、MSC348、MSC350、MSC356、MSC359、MSC392、MSC402、MSC403、MSC404、MSC405、MSC410、MSC411、MSC436、MSC437、MSC438、MSC439、MSC458、MSC459、MSC460、MSC461、MSC466、MSC467、MSC469、MSC480、MSC494、MSC498、MSC499、MSC500、MSC510、MSC511、MSC522、MSC526、MSC537、MSC551、MSC561、MSC562、MSC563、MSC564、MSC566、MSC567、MSC619、MSC625、MSC627、MSC640、MSC641、MSC643、MSC646、MSC650、MSC656、MSC657、MSC658、MSC659、MSC660、MSC669、MSC670、MSC671、MSC672、MSC673、MSC674、MSC675、MSC676、MSC677、MSC678、MSC679、MSC680、MSC681、MSC682、MSC683、MSC684、MSC687、MSC688、MSC689、MSC690、MSC691、MSC692、MSC693、MSC694、MSC700、MSC701、MSC702、MSC722、MSC723 和 MSC724。
34.—种产生软骨素的方法,包括 (a)将权利要求1-31任一项所述的构建体转移到非致病性细菌宿主细胞中，并 (b)在细菌宿主细胞产生软骨素的发酵条件下培养细菌宿主细胞。
35.一种产生软骨素的方法，包括在足以产生软骨素的发酵条件下培养包含权利要求1-31任一项所述的构建体的非致病性细菌宿主细胞。
36.一种产生包含权利要求1-31任一项所述的构建体的非致病性细菌宿主细胞的方法，包括将权利要求1-31任一项所述的构建体转移到非致病性细菌宿主细胞中。
37.依照权利要求34-36任一项所述的方法，其中所述构建体的基因簇或基因整合到细菌宿主细胞的染色体中。
38.依照权利要求37所述的方法，其中所述基因簇或基因的两个或多个拷贝整合到细菌宿主细胞的染色体中。
39.依照权利要求34或35所述的方法，其中所述软骨素是非果糖基化的。
40.依照权利要求34或35所述的方法，其进一步包括硫酸化软骨素。
41.一种产生硫酸软骨素的方法，包括(a)通过权利要求34或35所述的方法产生软骨素，和 (b)硫酸化所述软骨素。
42.依照权利要求40或41所述的方法，其中所述硫酸化包括将三氧化硫-三乙胺复合物或氯磺酸与软骨素在甲酰胺中混合。
43.依照权利要求34-36任一项所述的方法，其中所述细菌宿主细胞是或源自选自下组的非致病性生物埃希氏杆菌属、假单胞菌属、黄单胞菌属、甲基单胞菌属、不动杆菌属、和鞘氨醇单胞菌属。
44.依照权利要求34-36任一项所述的方法，其中所述细菌宿主细胞是或源自革兰氏阴性生物。
45.依照权利要求43所述的方法，其中所述细菌宿主细胞是野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris)。
46.依照权利要求45所述的方法，其中所述野油菜黄单胞菌是选自下组的细菌菌株MSC255、MSC256、MSC257、MSC225、和 MSC226。
47.依照权利要求43所述的方法，其中所述细菌宿主细胞是非致病性大肠杆菌。
48.依照权利要求47所述的方法，其中所述非致病性大肠杆菌选自下组大肠杆菌K-12和大肠杆菌B。
49.依照权利要求48所述的方法，其中所述大肠杆菌K-12是选自下组的细菌菌株MSC188 和 MSC175。
50.依照权利要求48所述的方法，其中所述大肠杆菌B是细菌菌株MSC364。
51.依照权利要求34-50任一项所述的方法，其中通过同源重组缺失或灭活细菌宿主细胞的内源基因。
52.依照权利要求34-50任一项所述的方法，其中所述细菌宿主细胞不表达对于所述宿主细胞为内源性的胞外多糖。
53.依照权利要求34-50任一项所述的方法，其中所述细菌宿主细胞适合从实验室克隆菌株的接合转移。
54.依照权利要求34或35所述的方法，进一步包括从细菌宿主细胞回收软骨素。
55.依照权利要求34或35所述的方法，进一步包括从胞外培养基回收软骨素。
56.依照权利要求34或35所述的方法，其中在24-72小时内从细菌宿主细胞分泌Ig/L_50g/L的软骨素。
57.依照权利要求56所述的方法，其中在24-72小时内从细菌宿主细胞分泌5g/L_50g/L的软骨素。
58.依照权利要求57所述的方法，其中在24-72小时内从细菌宿主细胞分泌15g/L_50g/L的软骨素。
59.依照权利要求34或35所述的方法，其进一步包括纯化软骨素。
60.依照权利要求34或35所述的方法，其中所述细菌宿主细胞在25°C_37°C下培养。
61.依照权利要求34或35所述的方法，其中所述细菌宿主细胞在包含甘油的培养基中培养。
62.权利要求34-35或37-61任一项所述的方法产生的软骨素。
63.包含权利要求62所述的软骨素的组合物。
64.一种抗体或抗体片段，其结合选自下组的氨基酸序列SEQ ID NO:92的KpsF、SEQID NO:93 的 KpsE、SEQ ID NO:94 的 KpsD、SEQ ID NO:95 的 KpsU、SEQ ID NO:96 的 KpsC、SEQ ID NO:97 的 KpsS、SEQ ID N0:91 的 KpsT、SEQ ID NO:83 的 KfoA、SEQ ID NO:84 的KfoB,SEQ ID NO:85 的 KfoC、SEQ ID NO:86 的 KfoI(0rf3)、SEQ ID NO:87 的 KfoE、SEQ IDNO:88 的 KfoH(Orfl)、SEQ ID NO:89 的 KfoF、和 SEQ ID NO:90 的 KfoG。
全文摘要
本发明涉及用于软骨素产生的重组DNA技术领域，包括通过联合重组细菌发酵和发酵后硫酸化产生硫酸软骨素。
文档编号C12P19/04GK102869782SQ201180022154
公开日2013年1月9日 申请日期2011年3月1日 优先权日2010年3月1日
发明者D.H.多尔蒂, C.A.韦弗, 宫本健太郎, 南泽俊和 申请人:Dsm Ip资产公司, 生化学工业株式会社