使用用于癌症的辅佐治疗的李斯特菌属的方法和组合物的制作方法

专利名称：使用用于癌症的辅佐治疗的李斯特菌属的方法和组合物的制作方法
使用用于癌症的辅佐治疗的李斯特菌属的方法和组合物本发明要求2010年5月23日提交的美国临时专利申请61/347，447的优先权，包括所有表格、附图
和权利要求的其全部内容特此并入。关于联邦政府赞助研究的声明美国政府具有本发明的全额支付许可证以及在限制的情况下具有在根据美国国家癌症研究所(National Cancer Institute)授予号NHI 1K23CA104160-01所提供的合适的条款下要求专利权人许可其他人的权利。
背景技术：
据认为，建立对特异性病原体的强细胞免疫是所需的。已经证明，使用相同疫苗的重复施用(同源性加强)对于加强体液应答是有效的。然而，因为之前对载体的免疫倾向于损坏强抗原呈递和合适炎症信号的生成，所以该方法对加强细胞免疫相对无效。规避该 问题的一种方法为连续施用使用不同抗原依赖性系统(异源性加强)的疫苗。该方法称为“初免-加强(prime-boosting) ”。以下是异源性初免-加强方案的例子。涉及DNA初免的那些包括DNA初免针对病毒抗原的DNA初免/细菌加强(李斯特菌属)(Boyer等(2005) Virology 333:88-101)；DNA初免/细菌载体(芽孢杆菌属)加强，针对细菌抗原(Ferraz等(2004) InfectionImmunity72:6945-6950) ;DNA初免/病毒载体加强，针对肿瘤抗原(Goldberg等(2005)Clin. Cancer Res. 11:8114-8121 ； Smith 等(2005) Int. J. Cancer 113:259-266);针对病毒抗原的 DNA 初免 / 病毒加强(Toussaint 等(2005)Vaccine 23:5073-5081 ;Cebere 等(2006)Vaccine 24:417-425 ;Coupar 等(2006)Vaccine 24:1378-1388);针对病毒抗原的DNA 初免/ 蛋白加强(Cristillo 等(2006) Virology 346:151-168 ;Rasmussen 等(2006)Vaccine 24:2324-2332) ;DNA初免/病毒加强，针对寄生虫的抗原(Gilbert等(2006)Vaccine 24:4554-4561 ;Webster 等(2005)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102:4836-4841)；DNA初免/辅佐的蛋白加强，针对肿瘤抗原(Prud' homme (2005) J. Gene Med. 7:3-17) ；DNA初免/病毒加强以及蛋白加强，针对病毒抗原(Stambas等(2005) Vaccine23:2454-2464)；以及DNA初免(纳米颗粒)/蛋白加强，针对病毒抗原(Castaldello等(2006)Vaccine24:5655-5669)。以下异源性初免-加强方案利用不涉及DNA的初免组合物树状细胞(DC)初免/细菌(李斯特菌属)加强、以及DC初免/病毒加强，针对细菌抗原(Badovinac等(2005) Nat. Med. 11:748-756);细菌载体初免(沙门氏菌属)/蛋白加强，针对细菌抗原(Vindurampulle 等(2004)Vaccine 22:3744-3750 ；Lasaro 等(2005)Vaccine23:2430-2438);辅佐的蛋白初免/DNA加强，针对病毒抗原(Sugauchi等(2006) J. Infect.Dis. 193:563-572 ;Pal 等(2006) Virology 348:341-353);蛋白初免 / 细菌载体(沙门氏菌属)加强，针对病毒抗原(Liu等(2006)Vaccine24:5852-5861);蛋白初免/病毒载体加强，针对病毒抗原(Peacock等(2004) J. Virol. 78:13163-13172);异源性病毒初免/病毒加强，使用不同病毒载体，针对病毒抗原或肿瘤抗原(Ranasinghe等(2006)Vaccine24:5881-5895 ；Kaufman 等(2004)J. Clin. Oncol. 22:2122-2132 ；Grosenbach 等(2001) Cancer Res. 61:4497-4505)。使用脂囊泡的异源性初免/加强，针对细菌抗原(Luijkx 等(2006)Vaccine 24:1569-1577)。用于调控免疫系统的试剂是李斯特菌属以及特别地为单核细胞增生性李斯特菌(Listeria monocytogenes)。单核细胞增生性李斯特菌具有对肝脏和脾脏以及一定程度对诸如小肠的其他组织的天然向性(参见，例如，Dussurget等(2004)Ann. Rev.Microbiol. 58:587-610 ；Gouin 等(2005) Curr· Opin. Microbiol. 8:35-45 ；Cossart (2002)Int.J. Med.Microbiol.291:401-409 ;Vazquez-Boland 等(2001)Clin.Microbiol.Rev. 14:584-640 ;Schluter 等(1999) Tmmunobi ol. 201:188-195) 对于细菌位于肠道，则通过诸如ActA和internalin A的李斯特菌属蛋白来介导至血流的通道(参见,例如,Manohar等(2001)Infection Immunity69:3542-3549 ；Lecuit 等(2004)Proc. Natl. Acad. Sci.USAlOl: 6152-6157 ；Lecuit 和 Cossart (2002) Trends Mol. Med. 8:537-542)。一旦细菌进入宿主细胞，单核细胞增生性李斯特菌的生命周期包括从吞噬溶酶体脱逸至胞质溶胶。该生命周期对比于分枝杆菌属(Mycobacterium),其仍旧在吞曬溶酶体内(参见,例如,Clemens等(2002)Infection Immunity 70:5800-5807 ;Schluter 等(1998)Infect. Immunity66:5930-5938 ;Gutierrez等(2004) Cell 119:753-766)。单核细胞增生性李斯特菌从吞噬 溶酶体中的脱逸通过诸如猪单核细胞增生李斯特菌素(Iysteriolysin) (LLO)、PI-PLC和PC-PLC 的李斯特菌属蛋白介导(参见 Portnoy 等(2002) J. Cell Biol. 158:409-414)。对比以上所讨论的免疫治疗方法，其中免疫疗法用作主要治疗；辅助疗法是指在主要疗法之前(“新辅助疗法”)或者之后(“辅佐”)使用次要治疗，例如手术或辐射，其中主要疗法旨在去除或者破坏主要肿瘤。例如，在手术之后可提供辅助疗法，其中已经去除可检测的疾病，但是由于隐藏疾病还存在复发的统计学风险。对于包括结肠癌、肺癌、胰腺癌、乳腺癌、前列腺癌和一些妇科癌症的许多类型的癌症，手术之后提供辅助系统疗法和辐射疗法。
发明概要本发明提供采用李斯特菌属细菌用于癌症的次级治疗的辅助疗法方案。在已经向受试者施用一次或者多次初级治疗之前或之后，施用表达癌症相关抗原的有效量的李斯特菌属疫苗。本发明包括包装在合适的容器中的含有基于李斯特菌属的疫苗的试剂盒，以及可包括说明书。在第一方面，本发明涉及罹患癌症的哺乳动物的辅佐治疗的方法，该方法包括在向所述哺乳动物施用主要疗法之前或之后向所述哺乳动物施用有效量的组合物作为辅佐治疗以去除或者杀死表达癌症抗原的癌症细胞，所述组合物包含减毒的、代谢活性李斯特菌属，所述减毒的、代谢活性李斯特菌属编码所述癌症抗原的可表达的、免疫活性部分。如上所述，可将本发明的组合物提供作为新辅助疗法；然而在优选的实施方案中，在主要疗法之后施用本发明的组合物。在各个实施方案中，所述主要疗法包括去除所述哺乳动物的所述癌症细胞的手术；杀死在所述哺乳动物中所述癌症细胞的辐射疗法；或者所述手术以及所述辐射疗法。因为李斯特菌属可以为病原生物，以及特别是在免疫功能不全的情况下，优选所述施用步骤包括以多剂量施用所述减毒的、代谢活性李斯特菌属，所述减毒的、代谢活性李斯特菌属编码所述癌症抗原的可表达的、免疫活性部分。“减毒”是指藉此修饰细菌以减轻或者消除它的病原性但是仍保留用作目标疾病的预防或治疗的能力的方法。通过不同机制可获得细菌减毒。一种是引入突变至一种或者多种代谢途径内，其功能对于细菌体内生存和生长以致病是关键的。在李斯特菌属的情况下，在某些实施方案中，使细菌突变以减轻或者预防细胞内生长和扩散的能力。优选的李斯特菌属可包括使ActA失活的突变；使InlB失活的突变；或者两者。最优选地，在本发明中采用缺失它的天然ActA和inlB基因(AactAAinlB)的减毒的、代谢活性李斯特菌属。在某些实施方案中，本方法采用被杀死但具代谢活性的李斯特菌属("KBMA")。通过本发明的组合物提供编码各种癌症抗原的任意类型的一种或多种核酸的重组表达。在某些实施方案中，癌症抗原全部或者一部分是间皮素。其他合适抗原详细描述如下，以及可取决于待治疗的癌症类型以及通过癌症待表达的抗原。在各个实施方案中，待治疗的癌症选自胰腺癌、非小细胞肺癌、卵巢癌和间皮瘤。该清单并非旨在限制。
除了优选为如所述的手术或辐射的主要疗法之外，可将本发明的组合物递送作为初免-加强方案的一部分。例如，在施用本发明的李斯特菌属组合物之间，已经预先向哺乳动物施用表达目标癌症抗原的来自人细胞系的细胞，其中所述细胞已经被重组修饰以生成和分泌粒细胞巨噬细胞集落刺激因子，以及其中已通过辐射修饰所述细胞以防细胞分裂(SP’GVAX 疫苗，Cell Genesys, Inc.)。应理解，本发明在其应用时并不限于构造细节以及在以下描述中阐述或者附图中所图示的组分的布置。本发明能够具有实施方案(除了描述的那些实施方案之外)以及能够以各种方法实施和进行。而且，应理解，本文所采用的措辞和术语以及摘要用于描述的目的以及不应当视为限制。就其本身而言，本领域技术人员应理解，可容易地利用该公开基于的概念作为设计进行本发明的多种目的的其他结构、方法和系统的基础。因此，重要的是，只要它们未偏离本发明的精神和范围，权利要求就应被视为包括在这些等同构造内。附图简述图IA是显示使用表达抗原的单核细胞增生性李斯特菌和牛痘病毒的初免-加强方案所致的对靶抗原(OVA)的OVA特异性细胞免疫应答的图。显示在ICS测定中使用0VA257-264 肽(SIINFEKL(SEQ IDNO: I))接种的 C57BL/6 小鼠中的 OVA 特异性应答。图IB是显示由使用表达靶抗原(人间皮素)的单核细胞增生性李斯特菌和腺病毒的初免-加强方案所致的人间皮素特异性细胞免疫应答的图。图2是显示由使用单核细胞增生性李斯特菌、腺病毒和牛痘病毒的初免-加强方案所致的在Balb/c小鼠中人间皮素特异性细胞免疫应答的图。也图示初免-加强方案。图3A是显示由使用增加水平的腺病毒初免和恒定水平的单核细胞增生性李斯特菌加强的初免-加强方案所致的在C57BL/6 (HLA-A2转基因)小鼠中人间皮素特异性细胞免疫应答的图(使用间皮素肽池(peptide pool)来刺激脾细胞)。图3B显示由使用增加水平的腺病毒初免和恒定水平的单核细胞增生性李斯特菌加强的初免-加强方案所致的在Balb/c小鼠中人间皮素特异性细胞免疫应答(使用间皮素肽池来刺激脾细胞)。也图示初免-加强方案。图4A显示在图的左侧，其显示由具有预先存在的对腺病毒的免疫的小鼠中腺病毒初免所致的人间皮素特异性细胞免疫应答。也在图4A中显示如使用类型I Hex3表位(腺病毒特异性表位)测定的腺病毒特异性应答。也图示初免-加强方案。图4B是显示在具有预先存在的对腺病毒的免疫的小鼠中由腺病毒初免和单核细胞增生性李斯特菌加强所致的人间皮素特异性细胞免疫应答和中和腺病毒特异性抗体的滴度的图。也图示初免-加强方案。图5是显示由使用GVAX (CELL GENESYS, INC.)或者编码AHl的单核细胞增生性李斯特菌的初免以及使用GVAX (CELLGENESYS, INC.)或者编码AHl的单核细胞增生性李斯特菌的加强所致的AHl特异性细胞免疫应答的图。图6A是显示由使用经间皮素肽131-139脉冲的树状细胞或者编码人间皮素的腺病毒的初免以及使用编码人间皮素的单核细胞增生性李斯特菌的加强所致的在CD8+T细胞中的间皮素131_139特异性应答的百分率的图。初免发生在第O天；加强发生在第8天；以及在第13天收获脾细胞。·
图6B是显示由使用经间皮素肽131-139脉冲的树状细胞或者编码人间皮素的腺病毒的初免以及使用编码人间皮素的单核细胞增生性李斯特菌的加强所致的每个脾脏中间皮素131-139特异性⑶8+T细胞的绝对数的图。初免发生在第O天；加强发生在第8天；以及在第13天收获脾细胞。图6C是显示由使用经间皮素肽131-139脉冲的树状细胞的初免以及使用以下编码间皮素试剂的加强所致的在CD8+T细胞中间皮素131-139特异性应答的百分率的图单核细胞增生性李斯特菌、腺病毒或牛痘病毒。图7A是显不在脾细胞中小鼠间皮素特异性免疫应答的图,其中评估在小鼠间皮素肽文库中各肽的免疫应答。Balb/c小鼠接受使用编码小鼠间皮素的裸DNA载体的初免以及使用编码小鼠间皮素的单核细胞增生性李斯特菌的加强。图7B是显不在脾细胞中小鼠间皮素特异性免疫应答的图,其中评估在小鼠间皮素肽文库中各肽的免疫应答。Balb/c小鼠接受使用编码小鼠间皮素的腺病毒的初免以及使用编码小鼠间皮素的单核细胞增生性李斯特菌的加强。也图示初免-加强方案。图7C是显示酶联免疫斑点法(elispot)测定的结果的孔相片的半色调再现(hali-tone reproduction),其中从小鼠(其研究结果显示在图7B中)获得的脾细胞暴露于间皮素肽编号 278 (SEQ ID NO: 2) ,279 (SEQ ID NO: 3)或者 280 (SEQ ID NO: 4)。图8是显示由使用编码OVA的KBMA单核细胞增生性李斯特菌作为初免以及KBMA单核细胞增生性李斯特菌、牛痘病毒或“活”单核细胞增生性李斯特菌作为加强的初免-加强方案所致的OVA特异性细胞免疫应答的图。所有“加强”载体编码0VA。图9A显示在接种小鼠中AH-和AH 1/A5-特异性T细胞应答。图9B显示在接种小鼠中间皮素特异性T细胞应答。图9C显示在CT26肿瘤激发(tumor challenge)之后接种的小鼠的生存数据。发明详述本发明涉及用于引起对作为非李斯特菌属抗原的靶抗原的免疫应答的材料和方法。靶抗原优选为与疾病相关的靶抗原，使得对靶抗原的免疫应答提供治疗作用。本发明提供癌症的辅佐治疗的疫苗组，其中基于李斯特菌属的疫苗是代谢活性李斯特菌属，该代谢活性李斯特菌属编码其被施用的宿主中表达的靶抗原的免疫活性部分。
本发明部分基于施用疫苗的辅助使用可增强大量原发癌治疗的发现，该疫苗由编码癌症相关的抗原(例如间皮素)的活的减毒的单核细胞增生性李斯特菌组成。除非另有说明，否则本发明的实施采用包括分子生物学(包括重组技术)、免疫学、细胞生物学、生物化学和药物规程的常规技术。这些技术完整解释在文献中，例如，Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第二版，(Sambrook 等)；Methods inEnzymology(Academic Press, Inc. ) ；Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel 等编辑)；Current Protocols in Immunology (John Wiley & Sons, Inc. , N.Y. ) ；Handbook of Pharmaceutical Excipients (Rowe 等编辑)；Vaccine(Plotkinand Orenstein, 2003)；以及 Vaccine Protocols(Methods in Molecular Medicine)(Robinsin, Cranage 和 Hudson, 2003)。定义 用于表示在基因中突变或者在包含基因的细菌中突变的缩写如下。例如，缩写“李斯特菌属AactA”是指缺失部分或者所有actA基因。三角形符号(Λ)表示缺失。包括上标负号(李斯特菌属actA_)的缩写是指该actA基因突变，例如缺失、点突变或者移码突变，但不限于这些类型的突变。可将指数缩写，例如〃3e7〃是指3xl07。如包括所附权利要求的本文所使用，除文本另有明确说明外，诸如“一个”、“一种”、“所述”的词汇的单数形式包括复数指示物。本文所引用的参考资料通过引用整体并入，并入的程度如同明确且单独地指出各单独的公开、通过GenBank登录号所登记的序列、专利申请、专利、序列表、在序列表中的核苷酸或者寡肽或多肽序列、以及在所述公开和专利文献中的图片和照片通过引用并入。当应用至人、哺乳动物、哺乳类受试者、动物、兽类受试者、安慰剂受试者、研究受试者、实验受试者、细胞、组织、器官或生物流体，“施用”是指(但不限于)使受试者、细胞、组织、器官或生物流体等接触外源性脂质、试剂、安慰剂、小分子、药物试剂、治疗剂、诊断剂或者组合物。“施用”可表示例如治疗、预防、药代动力学、研究、安慰剂和实验方法。对细胞的“施用”涵盖使试剂接触细胞；以及试剂接触流体，其中该流体接触细胞。“施用”也涵盖通过试剂、结合组合物或者通过另一细胞的细胞的体外和离体方法。如与使用安慰剂施用或者不施用的相比较，可通过例如增加的生存时间(例如，对危及生命的增殖性疾患)；减小肿瘤尺寸；减少肿瘤数目；降低特异性组织的代谢；降低特异性组织的代谢；降低传染物的滴度等来评估施用的结果。“治疗”涵盖有预期功效的施用。“治疗”包括预防性(预防疾病)以及治疗施用。“抗原呈递细胞”是用于呈递抗原至T细胞的免疫系统的细胞。APC包括树状细胞、单核细胞、巨噬细胞、边缘区库弗氏细胞、小胶质细胞、朗氏细胞、T细胞、以及B细胞(参见，例如，Rodriguez-Pinto 和 Moreno(2OO5)Eur. J. Immunol. 35:1097-1105)。树状细胞出现在至少两个谱系中。第一谱系包括pre-DCl、骨髓DCl和成熟DC1。第二谱系包括 CD34++CD45RiT 早期多功能 T 祖细胞、CD34++CD45RA+ 细胞、CD34++CD45RA++CD4+IL-3Ralpha++pro-DC2细胞、CD4+CDllc_类浆细胞pre_DC2细胞、淋巴人DC2类浆细胞源性DC2、以及成熟 DC2(参见，例如，Gilliet 和 Liu (2002) J. Exp. Med. 195:695-704 ;Bauer 等(2001)J. Immunol. 166:5000-5007 ；Arpinati 等(2000)Blood95:2484-2490 ；Kadowaki 等(2001)J. Exp. Med. 194:863-869 ；Liu(2002)Human Immunology 63:1067-1071 ;McKenna 等(2005)J. Virol. 79:17-27 ；0' Neill 等(2004)Blood 104:2235-2246 ;Rossi 和 Young(2005)J. Immunol. 175:1373-1381 ；Banchereau 和 Palucka(2005)Nat. Rev. Tmmunol. 5:296-306)。“减毒”和“减毒的”涵盖经修饰以降低对宿主的毒性的细菌、病毒、寄生虫、感染生物、肿瘤细胞、感染生物中的基因等。宿主可以为人或动物宿主或者器官、组织或细胞。给出非限制性例子，可使细菌减毒以降低与宿主细胞的结合；以降低从一种宿主细胞扩散至另一宿主细胞；以降低宿主细胞中的细胞外生长；或者以降低在宿主细胞的细胞内生长。通过测定诸如毒性指标、LD5tl、从器官中清除速率或者竞争系数可评估减毒(参见，例如，Auerbuch 等(2001) Infect. Immunity 69:5953-5957)。通常，减毒导致 LD5tl 增加至少 25% ;更通常至少50% ;最通常至少100% (2倍);常规至少5倍；更常规至少10倍；最常规至少50倍；经常至少100倍； 更经常至少500倍；以及最经常至少1000倍；一般至少5000倍；更一般至少10，000倍；以及最一般至少50，000倍；并且最通常至少100，000倍。“减毒的基因”包括介导对宿主的毒性、病理或毒力；在宿主内生长；或者在宿主内存活的基因，其中基因以减轻、降低或者消除毒性、病理或毒力的方式来突变。“突变的基因”包括在基因的调控区、基因的编码区、基因的非编码区或其任何组合中的缺失、点突变、插入突变和移码突变。“癌病症”和“癌疾患”包括但不限于癌症；肿瘤；肿瘤的转移、血管生成；以及诸如发育异常的癌症前疾患。具有癌症、肿瘤、癌症前病症、癌症前疾患或者癌疾患等的哺乳类受试者涵盖不仅包括癌症、癌症前疾患或肿瘤的哺乳类受试者，而且涵盖已经去除肿瘤、明显消除癌症(例如，通过化学疗法或者手术或者单独针对受试者免疫系统)的哺乳类受试者。如在治疗中使用的“有效量”包括但不限于可改善、逆转、缓和或者预防医学病症或疾患的症状或迹象的量。除非另有明确或者以其他方式说明，“有效量”不限于足够改善病症的最小量；或者导致病症的最佳或者最大改善的量。在初免和/或加强的施用的文本内“有效量”是导致哺乳动物中免疫应答的量。“细胞外流体”涵盖例如血清、血浆、血液、间质液、脑脊液、分泌的流体、淋巴液、胆汁、汗液、粪便物和尿液。“细胞外流体”可包括胶体或者混悬物，例如全血。李斯特菌属细菌的“生长”是李斯特菌属领域的术语，其涵盖在诸如哺乳动物细胞的宿主细胞内生长的李斯特菌属细菌的细胞内生长。尽管可通过光学显微术、荧光显微术或菌落形成单位(CFU)测定法来测定李斯特菌属细菌的细胞内生长(“生长”)，但是生长不受测量的任何技术限制。诸如李斯特菌属抗原的量、李斯特菌属核酸序列或者李斯特菌属细菌脂质特异性的生化参数可用于评估生长。介导生长的基因是特异性介导细胞内生长的基因。特异性介导细胞内生长的基因包括但不限于其中基因失活降低细胞内生长速率但未可检测地降低细胞外生长速率(例如，肉汤中的生长)的基因；或者其中基因失活降低细胞内生长的速率的程度比对其降低细胞外生长的速率的程度更大的基因。为了提供非限制性例子，介导细胞内生长的基因是其中它的缺失降低细胞内生长至小于50%、小于40%、小于30%、小于20%或者小于10%的由野生型李斯特菌属表现出的细胞内生长的基因。为了提供进一步的非限制性例子，介导细胞内生长的基因涵盖其中它的缺失不仅降低细胞内生长至小于50%的野生型李斯特菌属的细胞内生长，而且降低细胞外生长至约95%、90%、85%或80%的使用野生型李斯特菌属所检测的细胞外生长的基因。在该文本中，术语“约”是指±5%。
“杀死但具代谢活性” (KBMA)涵盖任何含有修饰的基因组的细菌，例如其中基因组修饰足以预防菌落形成，但其中基因组修饰不足以基本上阻止或者破坏代谢。KBMA细菌不能形成如在琼脂上或者宿主细胞体内可检测的菌落。为了提供非限制性例子，可使用诸如补骨脂素的交联剂来修饰基因组。为了提供非限制性例子，在代谢中未被全部破坏的KBMA细菌是其中基因组仅在没有调控、编码、结构或者生物功能的基因间区中含有交联的一种。这对比于“活”细菌，其可形成菌落，尽管在一些实施方案中活细菌可以为减毒的。“样品”是指来自人、动物、安慰剂或者研究样品的样品，例如，细胞、组织、器官、流体、气体、气溶胶、浆料、胶体或者凝结的材料。“样品”也指例如包含流体或者组织样品的细胞或者从流体或者组织样品中分离的细胞。“样品”也可表示从人或动物中新鲜取样的细胞、组织、器官或流体；或者经处理或储存的细胞、组织、器官或者流体。细菌的“扩散”涵盖“细胞至细胞扩散”，其是部分被囊泡介导的来自第一宿主细胞的细菌传输至第二宿主细胞。与扩散相关的功能包括但不限于例如，肌动蛋白尾的形成；伪足样延长的形成；以及双膜液泡的形成。·
“初免剂量”或者“初免用量”的“有效量”是指如与在没有施用抗原的哺乳类受试者中免疫应答相比较在哺乳类受试者中引起可测定免疫应答的靶抗原的量。如本文所使用的“疫苗”是指由异源性蛋白组成或者由编码异源性蛋白的核酸组成的组合物，使得当向哺乳动物施用疫苗时，异源性蛋白在哺乳动物中表达以用于引起免疫应答的目的。免疫应答可以为体液、细胞介导的或者两者。如本文所使用的“初免疫苗(priming vaccine) ”是指包含以引起对目标抗原的免疫应答的有效量向受试者或者宿主施用的试剂的疫苗。初免疫苗可编码抗原，以及也可编码诸如GM-CSF的各种免疫刺激细胞因子，其用于补充和激活抗原呈递细胞。如本文所使用的“加强疫苗(boosting vaccine) ”是指包含编码具有祀抗原的免疫活性部分的抗原的试剂的疫苗，以及该试剂可包含靶抗原、其片段和/或含有接合在靶抗原中通常不存在的区域的靶抗原的至少免疫活性部分的融合多肽。“加强剂量”或者“加强用量”的“有效量”是指一旦向之前已经施用初免剂量的靶抗原的哺乳动物施用则引起对靶抗原的免疫应答的抗原的量。如本文所使用的“载体组”或“疫苗组”包含初免载体或初免疫苗以及加强载体或加强疫苗，其中各自编码共享免疫决定簇、交叉反应免疫决定簇、共享抗原、免疫蛋白或肽或其片段之一。“抗原”是指含有刺激诸如哺乳动物免疫系统的宿主免疫系统以产生体液和/或细胞抗原特异性应答的一种或者多种表位(线性、构象或者两者)或者免疫决定簇的分子。该术语与术语“免疫原”可交换使用。抗原可以是全蛋白、截短蛋白或者蛋白或肽的片段。抗原可以为蛋白的天然存在的、遗传工程化的变体；或者可以为用于特别是在哺乳类受试者或者宿主中表达的最佳化密码子。通常，B细胞表位至少包括约5个氨基酸，但也可少至3-4个氨基酸。诸如CTL表位的T细胞表位包括至少约7-9个氨基酸，并且辅助T细胞表位包括至少约12-20个氨基酸。通常，表位包括约7和15个氨基酸，例如，9、10、12或15个氨基酸。术语“抗原”表示两个亚单位抗原(即，从完整生物体中分离和离散的抗原以及与天然抗原相关的抗原)。诸如抗独特型抗体或其片段、以及可模拟抗原或抗原决定簇的合成肽模拟表位的抗体也涵盖在如本文所使用的抗原的定义下。为了本发明，抗原可来自多种已知病原性病毒、细菌、寄生虫和真菌的任意一种。它们也可来自癌症。而且，为了本发明，“抗原”是指只要蛋白维持引起免疫应答的能力则包括对天然存在的序列的通常在自然界中保守的诸如缺失、添加和取代的修饰的如本文所定义的蛋白。这些修饰可以为有意的，例如通过定点诱变；或者可以为偶然的，例如通过产生抗原的宿主的突变。本发明的抗原也可以为通过本领域已知方法最佳化的密码子以改善在宿主中的它们的表达或者免疫原性。如本文所使用，“交叉反应”免疫决定簇是指能够引起对相关但并不相同抗原决定簇的免疫应答的决定簇、表位或者抗原，例如HIV的交叉反应决定簇是能够引起对分化枝中HIV抗原的所有成员中两个或者多个的免疫应答的抗原。对抗原、载体或疫苗或者包含抗原的组合物的“免疫性应答”或“免疫应答”是在哺乳类受试者中对抗原或者存在于载体组中的抗原的体液和/或细胞免疫应答的发展。“细胞免疫应答”是通过T-淋巴母细胞和/或包括但不限于NK细胞和巨噬细胞的其他白血细胞介导的。本发明的T淋巴母细胞包括表达α βT细胞受体亚单位的T细胞或者表达Y δ受体的T细胞以及效应子或者抑制子T细胞。“Τ淋巴母细胞”或者“Τ细胞”是非抗体生成淋巴母细胞，其构成免疫系统的细胞介导的臂的一部分。T细胞源于不成熟淋巴母细胞，该成熟淋巴母细胞由骨髓迁移至胸腺，其中它们经历在胸腺激素的定向下的成熟过程。基于它们识别和结合特异性抗原的能力，成熟T细胞变得具有免疫能力。当抗原结合淋巴母细 胞的表面受体时，触发具有免疫能力的T细胞的激活。已知，为了产生T细胞应答，必须在细胞内合成抗原或者必须将抗原引入细胞内，随后通过蛋白酶体复合物将其处理为小肽，并且移位至内质网/Golgi复合物分泌途径以用于最后与主要组织相容性复合物(MHC)级别I蛋白缔合。功能细胞免疫包括抗原特异性细胞毒性T细胞(CTL)。当蛋白来自人类中时，如本文所使用的抗原特异性T细胞、CTL或者细胞毒性T细胞是指对与通过主要组织相容性复合物(MHC)或者人白细胞抗原(HLA)编码的蛋白缔合存在的肽抗原具有特异性的细胞。本发明的CTL包括激活的CTL，其在MHC的环境中被特异性抗原触发；以及称为由于再暴露于抗原以及可交叉反应CTL中而变得再激活的T细胞的记忆CTL或者恢复CTL。本发明的CTL包括CD4+和CD8+T细胞。本发明的激活的抗原特异性CTL通过以下各项促进CTL对其特异的病原体或癌症细胞感染的受试者的细胞的破坏和/或裂解尤其是趋化因子和细胞因子(包括但不限于巨噬细胞炎症蛋白Ia(MIP-Ia)、MIP-IB和RANTES)的分泌；以及抑制疾病状态的可溶性因子的分泌。本发明的细胞免疫是指通过T细胞的T辅助亚单位产生的抗原特异性应答。辅助T细胞用于帮助刺激功能，以及集中针对显示在它们的表面上与MHC分子缔合的肽的T细胞的非特异性效应细胞的活性。细胞免疫应答也指细胞因子、趋化因子和通过激活的T细胞和/或包括由CD4和CD8 T细胞以及NK细胞衍生的那些的其他白血细胞生成的其他这些分子的生成。引起细胞免疫应答的初免剂量或加强剂量或者包含初免剂量或加强剂量的组合物或疫苗通过呈递在细胞表面处与MHC分子缔合的抗原可用于敏化哺乳类受试者。将细胞介导的免疫应答定向在或者靠近在它们的表面处呈递抗原的细胞。此外，抗原特异性T-淋巴母细胞使得可进一步保护免疫的宿主。通过诸如淋巴组织增生(淋巴母细胞激活)测定法、CTL细胞毒性细胞测定法或者通过测定在敏化的受试者中抗原的T-淋巴母细胞特异性的本领域已知的多种测定法可测定特定抗原刺激细胞介导的免疫性应答的能力。这些测定法是本领域公知的。参见，例如，Erickson等,J. Immunol. (1993) 151:4189-4199 ；Doe 等；Eur. J. Immunol. (1994)24:2369-2376。测定细胞介导的免疫应答的方法包括通过T-细胞群体来测定细胞内细胞因子或细胞因子分泌；或者通过测定表位特异性T细胞(例如，通过四聚体技术)(由McMichael，A.J.，和 O’ Callaghan, C. A.，J. Exp. Med. 187 (9) 1367-1371，1998 ；Mcheyzer-ffilliams, M.G.等,Immunol. Rev. 150:5-21, 1996 ；Lalvani, A.等，J. Exp. Med. 186:859-865，1997 综述)。如本文所使用的免疫性应答或者免疫应答涵盖刺激CTL的生成和/或辅助T细胞和/或抗体介导的免 疫应答的生成或者激活的免疫性应答或者免疫应答。如本文所使用的“免疫性应答”或者“免疫应答”涵盖以下效应的至少一种或者多种通过B细胞生成抗体；和/或抑制T细胞和/或特异性定向抗原或者存在于目标载体、组合物或者疫苗中的抗原的T细胞的激活。在一些实施方案中，“免疫性应答”或者“免疫应答”涵盖抑制T细胞的失活。如本文所使用，“增强的加强免疫应答”是指通过加强剂量的引起如与通过初免剂量的单次施用引起的应答相比较更大的可测定的免疫应答的疫苗的施用。所谓“药学上可接受的”或者“药理上可接受的”是指不是生物学上期望或者另外期望的材料。如本文所使用，术语“试剂盒”是指包装和/或标记的尽管并不必要同时但共同使用的组分。试剂盒可在单独的容器中包括初免疫苗和加强疫苗。试剂盒也可在单独的容器中包括初免疫苗和/或加强疫苗的组分。试剂盒可包括用于合并组分以配制适合于向哺乳动物使用的免疫原性组合物的组分。“治疗作用”是减缓与待施用疫苗的疾病相关的一种或多种症状。“预防作用”是对与待施用疫苗相关的疾病的一种或多种症状的抑制。如本文所使用“哺乳类受试者”或者“宿主”是指亚门脊索动物门的任意成员，包括但不限于人和包括诸如黑猩猩和其他猿类以及猴类的非人灵长类的其他灵长类；家畜，例如牛、羊、猪、山羊和马；家养哺乳动物，例如狗和猫；包括啮齿类动物的实验室动物，例如小鼠、大鼠和豚鼠。术语不表示特定的年龄。因此，旨在包括成年和新生个体。如本文所使用“辐射疗法”或“放射疗法”是指作为癌症治疗的一部分的电离辐射的医学用途以控制恶性细胞。放射疗法可用于治愈性、辅助性或缓和性治疗。放射疗法的合适类型包括常规外粒子束放射疗法；立体定位的辐射疗法(例如，Axesse,身寸波刀(Cyberknife) > 伽玛刀、Novalis、Primatom、Synergy> X-Knife、TomoTherapy或者Trilogy)，；强度调制的辐射疗法；粒子疗法(例如，质子疗法)；短程治疗(brachytherapy);递送放射性同位素等。该清单并非旨在限制。弓I起对靶抗原的免疫应答的方法本发明涵盖用于在哺乳动物中引起免疫应答的方法。靶抗原可以为与疾病状态相关的那些，例如，如在癌细胞或者病原体上存在被识别的那些。在原发癌治疗之后，施用包含编码和表达靶抗原的免疫活性部分的减毒的代谢活性李斯特菌属的疫苗。I.靶抗原可在本发明的治疗方案中使用的靶抗原的例子列于下表中。靶抗原也可以为包含在表中列出的抗原的免疫活性部分的片段或者融合多肽。表I.抗原ImI参考文献
_胂瘤抗原_
间皮素GenBank登录号NM-005823; U40434; NM-O
13404; BC003512 (也参见例如Hassan等(2004)Clin. Cancer Res. 10:3937-3942; Muminova等(2004) BMC Cancer 4: 19; Iacotmzio-Donaluie 等
(2003)Cancer Res. 63:8614-8622), 维尔姆斯肿瘤-I相关的蛋WT-I同种型A(GenBank登录号NM 000378~白(Wt-I),包括同种型A; NP 000369)。WT-I同种型B(GenBank登录号同种型B;同种型C；同NM 024424 ; NP—077742) 。 WT-I同种型种型 D。C(GenBank 登录号 NM 024425: NP—077743)。·
WT-I 同种型 EKGenBank 登录号 NM 024426;
__NP—077744)。_
角质层糜蛋白酶(SCCE)及GenBank登录号NM 005046 ; NM_139277; 其变体 AF332583。也参见例如，Bondurant 等(2005) Clin. __Cancer Res. 11:3446-3454: Santin 辛(2004) Gynecol.
权利要求
1.一种用于罹患癌症的哺乳动物的辅佐治疗的方法，所述方法包括在向所述哺乳动物施用主要疗法之前或之后向所述哺乳动物施用有效量的组合物作为辅佐治疗以去除或者杀死表达癌症抗原的癌症细胞，所述组合物包含减毒的、代谢活性李斯特菌属，所述减毒的、代谢活性李斯特菌属编码所述癌症抗原的可表达的、免疫活性部分。
2.根据权利要求I所述的方法，其中在所述主要疗法之后施用所述组合物。
3.根据权利要求I或2中任一项所述的方法，其中所述主要疗法包括从所述哺乳动物中去除所述癌症细胞的手术；杀死所述哺乳动物中的所述癌症细胞的辐射疗法；或者所述手术以及所述辐射疗法二者。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述施用步骤包括以多剂量施用所述减毒的、代谢活性李斯特菌属，所述减毒的、代谢活性李斯特菌属编码所述癌症抗原的可表达的、免疫活性部分。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述减毒的、代谢活性李斯特菌属具有使ActA失活的突变。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述减毒的、代谢活性李斯特菌属具有使InlB失活的突变。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述减毒的、代谢活性李斯特菌属是 ΔactAΔinlB。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述李斯特菌属被杀死但具代谢活性 ("KMA")。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述癌症抗原是全部或者一部分间皮素。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中在所述施用步骤之前，已经预先向所述哺乳动物施用表达全部或者一部分所述癌症抗原的来自人细胞系的细胞，其中所述细胞已经被重组修饰以生成和分泌粒细胞巨噬细胞集落刺激因子，以及其中所述细胞已经被修饰以防细胞分裂。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述癌症选自胰腺癌、非小细胞肺癌、卵巢癌和间皮瘤。
全文摘要
本文提供初免-加强方案以及本文所使用的材料。初免-加强方案增强对靶抗原的免疫应答。用于加强的疫苗由编码可表达的抗原的重组减毒的代谢活性李斯特菌属(Listeria)组成，该可表达的抗原与靶抗原交叉反应。在一些例子中，免疫应答是细胞免疫应答。
文档编号C12N15/75GK102947452SQ201180030420
公开日2013年2月27日 申请日期2011年5月23日 优先权日2010年5月23日
发明者T·W·杜本斯盖, D·G·布洛克斯泰德, M·梁, K·S·巴哈贾特 申请人:艾杜罗生物科技公司