专利名称：在植物中制造dha和其他lc-pufa的制作方法
技术领域：
本发明大致上关于重组宿主生物体(譬如植物)，该生物体系以容许和/或增进宿主生物体中PUFAs生产的多不饱和脂肪酸(PUFA)合成酶系统与一或多个辅助蛋白之基因修饰。本发明亦关于制造和使用该类生物体(譬如用以获得PUFAs)的方法以及由该类生物体获得的产品(譬如油与籽)。
背景技术：
多不饱和脂肪酸(PUFAs)被认为有益于营养应用、药学应用、工业应用、及其它目的。然而，来自天然来源(譬如鱼油)或来自化学合成的PUFAs现有供应就长期商业需求而言并不足够。衍生自植物(譬如油籽作物)的蔬菜油较便宜且没有和鱼油相关的污染议题。然而，在商业开发植物与植物油发现的PUFAs通常不包括较饱和或较长链PUFAs，并仅通常包括诸如亚油酸(十八个碳，带有2个双键，在Λ9与12位置一18:2Λ9，12)与亚麻酸(18:3Δ9, 12，15)之脂肪酸。已说明了藉由修饰植物内源产生的脂肪酸以在植物中产生较不饱和或较长链的PUFAs。举例来说，已说明了以编码脂肪酸延长酶和/或去饱和酶的不同个别基因对植物进行基因修饰，结果生成含有大量较长链与较不饱和PUFAs—例如二十碳五烯酸(EPA) —但亦含有大量混合短链与较不饱和PUFAs的叶或籽(Qi et al.，NatureBiotech.22:739(2004) ；W004/071467 ；Abbadi et al.,Plant Cell 16:1 (2004) ；Napierand Sayanova, Proceedings of the Nutrition Society 64:387-393(2005) ；Robert etal., FunctionalPlant Biology32:473-479(2005) ；U.S.App1.Pub.N0.2004/0172682)。芸薹属(Brassica)包括芥花(canola)-世界上最重要油籽作物之一以及生长在温带地区的最重要油籽作物。芥花传统上具有油菜(Brassica napus,由芜菁(Brassicarapa)与甘蓝(Brassica oleracea)种间杂交所衍生的品种)的特征，其中芥酸与硫化葡萄糖苷已经由常规育种去除或显著减少。大部分芥花油系生产为供人类食用的蔬菜油形式。亦有将芥花油用于工业应用的增长中市场。衍生自特定种类芥花籽的食用与工业油质量系取决于其组成脂肪酸，因为脂肪酸不饱和性的种类与份量就饮食与工业应用而言皆有意涵。常规芥花油含有约60%油酸(C18:l)、约20%亚油酸(C18:2)及约10%亚麻酸(18:3)。常规芥花通常内含的多不饱和亚麻酸水平系非所欲的，因为该油极易氧化，氧化速率受到几个因素影响，包括氧的存在、曝露至光与热、油内固有或外加抗氧化剂与促氧化剂的存在。反复油炸(诱导氧化)或长期储存(自发氧化)造成的氧化导致走味与腐败。氧化亦会改变芥花油的润滑与黏稠性质。相对于常规芥花油，展现降低多不饱和脂肪酸水平并增加单元不饱和油酸水平的油和较高氧化稳定性有关。个别脂肪酸对氧化的易感性取决于其不饱和度。于是，亚麻酸一其拥有三个碳-碳双键一 的氧化速率是油酸一其仅有一个双键一的25倍，是亚油酸的2倍，其有两个双键。亚油酸与亚麻酸亦对味道与气味影响最大，因该等容易形成过氧化氢。高油酸油(> 70%油酸)在储存、油炸与精炼期间较不易氧化，并可加热至较高温而不生烟，使其更适宜作为烹饪油。具有籽油中的油酸(C18:l)超过70%(以重量计)且亚麻酸(C18:3)低于3.5%(以重量计)之脂肪酸配置的市售芥花品种例子为Nexera 品种，由 Dow AgroSciences LLC(Indianapolis, IN)发售，该品种产生 〃ω-9 油",一种非氢化之高油酸、低亚麻酸油，目前在餐厅与餐饮业用于众多应用，包括油炸、快炒、烘焙、喷雾及用于色拉酱。
发明概要本领域对于有效率并有效地在植物、植物籽或植物油中制造一定数量(譬如商业数量)的较长链或较不饱和PUFAs以及在植物、植物籽或植物油的该PUFAs中富含一定数量的脂质(譬如三酸甘油酯(TAG)与磷脂(PL))之较便宜方法有所需求。一种如本案所述藉由提供以多不饱和脂肪酸(PUFA)合成酶和一或多个辅助蛋白之基因改造的重组宿主生物体在宿主生物体(譬如植物)中提供并增进PUFA制造的系统是本领域做法的重要替代方案。本发明系指涉一种基因改造植物(譬如芸薹属)、其子代、籽、细胞、组织或部位，其包含:(i)编码多不饱和脂肪酸(PUFA)合成酶系统(譬如藻类PUFA合成酶系统)之核酸序列，该系统系制造至少一 PUFA ;及(ii)编码磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶(PPTase)之核酸序列，该酶系将磷酸泛酰巯基乙胺基辅助因子转移至PUFA合成酶系统(譬如藻类PUFA合成酶系统)ACP域。在某些具体例中，该基因改造植物、其子代、籽、细胞、组织或部位系来自经济重要芸薹属物种(譬如油菜或芥菜(Brassicajuncea))。在某些具体例中,PUFA合成酶系统系包含和SEQ ID NO:1之氨基酸序列至少60%至99%相同的氨基酸序列或包含SEQID NO:1之氨基酸序列。在某些具体例中，编码PUFA合成酶系统之核酸序列系包含和SEQID N0:6之核酸序列至少60%至99%相同的核酸序列或包含SEQ ID N0:6之核酸序列。在某些具体例中，PUFA合成酶系统系包含和SEQ ID NO: 2之氨基酸序列至少60%至99%相同之氨基酸序列或包含SEQ ID N0:2之氨基酸序列。在某些具体例中，编码PUFA合成酶系统之核酸序列系包含和SEQ ID NO: 7之核酸序列至少60%至99%相同的核酸序列或包含SEQID N0:7之核酸序列。在某些具体例中，PUFA合成酶系统系包含和SEQ ID N0:3之氨基酸序列至少60%至99%相同的氨基酸序列或包含SEQ ID NO: 3之氨基酸序列。在某些具体例中，编码PUFA合成酶系统之核酸序列系包含和SEQ ID NO: 8之核酸序列至少60%至99%相同的核酸序列或包含SEQ ID N0:8之核酸序列。在某些具体例中，PUFA合成酶系统系包含SEQ ID NOs:1、2、或3或其任意组合之氨基酸序列。在某些具体例中，编码PUFA合成酶系统之核酸序列系包含SEQ ID NOs:6、7或8或其任意组合之核酸序列。在某些具体例中，PPTase系包含和SEQ ID NO: 5至少60%至99%相同的氨基酸序列或包含SEQ ID NO: 5之氨基酸序列。在某些具体例中，编码PPTase之核酸序列系和SEQID NO: 10之核酸序列至少60%至99%相同或包含SEQID NO: 10之核酸序列。在某些具体例中，(i)与(ii)之核酸序列系包含于单一重组表达载体。在某些具体例中，(i)与(ii)之核酸序列系可操作地连接至籽特异性启动子。在某些具体例中，(i)与(ii)之核酸序列系可操作地连 接至选自由PvDlec2、Pv菜豆素、LfKCS3及FAEl所构成之群组的启动子。在某些具体例中，该基因改造植物(譬如产生芥花油的芸薹属物种)、其子代、籽、细胞、组织或部位又包含(iii)编码酰基-CoA合成酶(ACoAS)之核酸序列，该酶系催化长链PUFA游离脂肪酸(FFA)转换成酰基-CoA。在某些具体例中，ACoAS系包含和SEQ IDNO: 4至少60%至99%相同之氨基酸序列或包含SEQ ID NO: 4之氨基酸序列。在某些具体例中，ACoAS系包含和SEQ IDNO: 9之核酸序列至少60%至99%相同的核酸序列或包含SEQ IDNO:9之核酸序列。在某些具体例中，编码ACoAS之核酸序列系包含SEQ ID N0:34之核酸序列。在某些具体例中，和/或(iii)之核酸序列系包含于单一重组表达载体。在某些具体例中，和/或(iii)之核酸序列系可操作地连接至籽特异性启动子。在某些具体例中，⑴、( )和/或(iii)之核酸序列系可操作地连接至选自由下列所构成之群组的启动子:PvDlec2、LfKCS3及FAE1。在某些具体例中，该基因改造植物(譬如芸薹属)、其子代、细胞、组织或部位又包含编码乙酰基CoA羧化酶(ACCase)之核酸序列和/或编码第2型二酰基甘油酯酰基转移酶(DGAT2)之核酸序列。本发明系指涉一种分离核酸分子，其包含选自下列之核酸序列:SEQ ID NOs:6-10与SEQ ID N0:34、重组表达载体pDAB7361、重组表达载体pDAB7362、重组表达载体PDAB7363、重组表达载体pDAB7365、重组表达载体pDAB7368、重组表达载体pDAB7369、重组表达载体PDAB7370、重组表达载体pDAB100518、重组表达载体pDAB101476、重组表达载体pDAB9166、重组表达载体pDAB9167、重组表达载体pDAB7379、重组表达载体pDAB7380、重组表达载体PDAB9323、重组表达载体pDAB9330、重组表达载体pDAB9337、重组表达载体PDAB9338、重组表达载体pDAB9344、重组表达载体pDAB9396、重组表达载体pDAB101412、重组表达载体PDAB7733、重组表达载体pDAB7734、重组表达载体pDAB101493、重组表达载体pDAB109507、重组表达载体pDAB109508、重组表达载体pDAB109509、重组表达载体pDAB9151、重组表达载体pDAB 108207、重组表达载体pDAB 108208、重组表达载体PDAB108209、重组表达载体pDAB9159、重组表达载体pDAB9147、重组表达载体pDAB108224、或重组表达载体pDAB108225。在某些具体例中，得自该基因改造植物、其子代、籽、细胞、组织或部位的籽油系包含可检测量的DHA (十二碳六烯酸(C22:6，n-3))和/或EPA ( 二十碳五烯酸(C20: 5，n_3))。在某些具体例中，该籽油系包含0.01%至15%DHA、0.05%至10%DHA、或0.05%至5%DHA。在某些具体例中，该籽油系包含0.01%至59ffiPA、0.05%至596EPA、或0.05%至P/oEPA。在其它具体例中，在籽油中发现的可检测量DHA和/或EPA亦可在得自该基因改造植物的粮食和/或膳食中发现。在某些具体例中，可检测量DHA和/或EPA系于具有包含-以重量计一70%或更多油酸(C18:l)和/或4%或更少亚麻酸(C18:3)之脂肪酸含量的芸薹属物种籽油中发现。本发明系指涉一种油或一种籽，该等系得自本案所述基因改造植物(譬如芸薹属)、其子代、细胞、组织或部位。本发明系指涉一种食品，其包含得自本案所述基因改造植物、其子代、细胞、组织或部位之油。本发明亦指涉一种功能食品，其包含得自本案所述基因改造植物、其子代、细胞、组织或部位之油，或得自本案所述基因改造植物、其子代、细胞、组织或部位之籽。本发明系指涉一种医药产品，其包含得自本案所述基因改造植物、其子代、细胞、组织或部位之油。 本发明系指涉一种制造包含至少一 LC-PUFA之油的方法，该方法系包含从本案所述基因改造植物(譬如芸薹属)、其子代、细胞、组织或部位或从本案所述基因改造植物(譬如芸薹属)、其子代、细胞、组织或部位之籽回收油。本发明亦指涉一种制造包含至少一LC-PUFA之油的方法，该方法系包含栽种本案所述基因改造植物(譬如芸薹属)、其子代、细胞、组织或部位。本发明亦指涉一种在籽油中制造至少一 LC-PUFA的方法，该方法系包含从本案所述基因改造植物(譬如芸薹属)、其子代、细胞、组织或部位之籽回收油。本发明系指涉一种在籽油中制造至少一 PUFA的方法，该方法系包含栽种本案所述基因改造植物(譬如芸薹属)、其子代、细胞、组织或部位。本发明亦指涉一种提供含有至少一 PUFA之补充品或治疗产品给一个体的方法，该方法包含提供本案所述基因改造植物(譬如芸薹属)、其子代、细胞、组织或部位、本案所述之油、本案所述之籽、本案所述之食品、本案所述之功能食品、本案所述之医药产品给该个体。在某些具体例中，该具体例所包含的PUFA为DHA和/或EPA。本发明系指涉一种制造本案所述基因改造植物(譬如芸薹属)、其子代、细胞、组织或部位的方法，该方法系包含以下列转化植物或植物细胞(i)编码PUFA合成酶系统(譬如藻类PUFA合成酶系统)之核酸序列，该系统系制造至少一多不饱和脂肪酸(PUFA);及( )编码磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶(PPTase)之核酸序列，该酶系将磷酸泛酰巯基乙胺基辅助因子转移至PUFA合成酶系统(譬如藻类PUFA合成酶系统)ACP域。在某些具体例中，该方法又包含以下列转化植物或植物细胞:(iii)编码酰基-CoA合成酶(ACoAS)之核酸序列，该酶系催化长链PUFA游离脂肪酸(FFA)转换成酰基-CoA。附图简述本发明各种具体例可由下列详细说明、图式、及随附序列说明更完整地理解。
图1绘示编码PUFA OrfA的9个重复域各者之重新设计DNA序列的Clustal W (于Vector NTI 之比对)。图2展示pDAB7361的质粒图谱。图3展示pDAB7362的质粒图谱。图4展示pDAB7363的质粒图谱。图5展示来自芥花事件5197 [14]-032.002的T1籽之单一籽分析DHA含量。图6展示以Orf A、Orf B与Orf C特异性血清探测来自芥花事件5197 [14]-032.002的晚期(>30DAP)发育中Tl籽之萃取物的SDS-PAGE蛋白质印迹法结果。图7A展示从DHA生产芥花事件5197 [14]-032.002.Sx002之授粉后日数15、20、
25、30、35与42收集的发育中T2籽样本的脂质含量。图7B藉由蛋白质印迹法展示OrfA、OrfB与OrfC多肽存在于DHA生产芥花事件5197[14]-032.002.Sx002 之萃取物。图8展示芥花事件51 97 [ 14] -032.002之温室生长Tl植物的纯合T2植物的LC-PUFA 含量。图9展示六个纯合品系的单一 T2籽分析LC-PUFA的总结。图10展示来自两个T1品系与未转化o-9Nexera710之正逆杂交(reciprocalcross)的所得亲代与Fl杂交籽的DHA含量。图11展示衍生自芥花事件5197[13]-010.001之六十个个别Tl植物的pat基因
拷贝数。
图12展示在以授粉后日数(DAP)表示的各别6个时点使用原始强度值之空白未转化co-9Nexera710品系中感兴趣基因的表达图样。图13展示在以DAP表示的各别6个时点使用正规化强度值之空白未转化co-9Nexera710品系中感兴趣基因的表达图样。图14展示在以DAP表示的各别6个时点使用原始强度值之纯合子事件5197[14]-032.002品系中感兴趣基因的表达图样。图15展示在以DAP表示的各别6个时点使用正规化强度值之纯合子事件5197[14]-032.002品系中感兴趣基因的表达图样。图16展示以 薄层层析法(TLC)测量之成熟转基因芥花籽的PUFA合成酶活性。图17展示参考肽彼此相对的计算比例，其系来自在有与无共同表达HetI之大肠杆菌表达的OrfA，及于芥花事件5197 [14]-032.002表达的OrfA。图18展示apo2_9肽对六个参考肽各者的计算比例，其系来自在有与无HetI之大肠杆菌表达的OrfA，及于转基因芥花事件5197 [14]-032.002表达的OrfA。图19展示pDAB7365的质粒图谱。图20展示pDAB7368的质粒图谱。图21展示pDAB7369的质粒图谱。图22展示pDAB7370的质粒图谱。图23展示pDAB100518的质粒图谱。图24展示pDAB101476的质粒图谱。图25展示pDAB101477的质粒图谱。图26展示pDAB9166的质粒图谱。图27展示pDAB9167的质粒图谱。图28展示pDAB7379的质粒图谱。图29展示pDAB7380的质粒图谱。图30展示pDAB9323的质粒图谱。图31展示pDAB9330的质粒图谱。图32展示pDAB9337的质粒图谱。图33展示pDAB9338的质粒图谱。图34展示pDAB9344的质粒图谱。图35展示pDAB9396的质粒图谱。图36展示pDAB101412的质粒图谱。图37展示pDAB7733的质粒图谱。图38展示pDAB7734的质粒图谱。图39展示pDAB101493的质粒图谱。图40展示pDAB109507的质粒图谱。图41展示pDAB109508的质粒图谱。图42展示pDAB109509的质粒图谱。图43展示pDAB9151的质粒图谱。图44展示pDAB108207的质粒图谱。
图45展示pDAB108208的质粒图谱。图46展示pDAB108209的质粒图谱。图47展示pDAB9159的质粒图谱。图48展示pDAB9147的质粒图谱。图49展示pDAB108224的质粒图谱。图50展示pDAB108225的质粒图谱。图 51 例示以 pDAB101493、pDAB7362、pDAB7369、pDAB101412 或 pDAB7380 转化之个别转基因拟南芥事件的T2籽的DHA与LC-PUFA含量。发明详述本案所用〃多不饱和脂肪酸〃或"PUFA"等词系指带有由至少16个碳、至少18个碳、至少20个碳、或22或更多个碳构成之碳链并带有至少3或更多个双键、4或更多个双键、5或更多个双键、或6或更多个双键的脂肪酸，其中双键皆为顺式构型。本案所用〃长链多不饱和脂肪酸〃或"LC-PUFAs"等词系指由18个及更多碳链长度、20个及更多碳链长度、含有3或更多个双键、或是22或更多个碳带有至少3或更多个双键、4或更多个双键、5或更多个双键、或6或更多个双键所组成的脂肪酸。ω-6系列的LC-PUFAs包括但不限于Y-亚麻酸(C18:3)、双-升-Y-亚麻酸(C20:3n_6)、花生四烯酸(C20:4n-6)、肾上腺酸(亦称二十二碳四烯酸或DTA) (C22: 4n_6)、及二十二碳五烯酸(C22:5n_6)。ω-3系列的LC-PUFAs包括但不限于α-亚麻酸(C18:3)、二十碳三烯酸(C20:3n-3)、二十碳四烯酸(C20:4n-3)、二十碳五烯酸(C20: 5n_3)、二十二碳五烯酸(C22:5n-3)、及二十二碳六烯酸(C22:6n_3)。LC-PUFAs亦包括带有大于22个碳及4或更多个双键的脂肪酸，包括但不限于C28:8 (n-3)。本案所用〃PUFA合成酶〃或〃PUFA合成酶系统〃或〃SzPUFA〃或〃hSzThPUFA〃等词系指制造多不饱和脂肪酸(PUFAs)且尤其是长链PUFAs (LC-PUFAs)的酶系统还有该酶在复合体中的任何域。PUFA合成酶一词系包括但不限于用于制造PUFAs的PUFA PKS系统或类PKS系统。本案所用〃磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶〃或〃PPTase〃或〃N0HetI〃 一词系指藉由将辅助因子(譬如4-磷酸泛酰巯基乙胺)从辅酶A(CoA)转移至存在于PUFA合成酶系统的一或多个ACP域来活化PUFA合成酶系统的酶。本案所用〃酰基-CoA合成酶〃或"ACoAS"或"SzACS-2" —词系指催化长链多不饱和游离脂肪酸(FFA)转换成酰基-CoA的酶。本案所用〃植物〃 一词系包括但不限于植物的任何子代、细胞、组织、或部位。〃保健品〃意指由植物分离、纯化、浓缩、或制造的产品，其提供生理帮助或提供对疾病的防护，包括补充有该类产品的加工食品，连同由已进行基因工程以含有加强水平之该类生理活性成分的作物制造的食品。〃功能食品〃意指下列食品:(a)外观相似于或可为作为一部分日常饮食食用的常规食品及(b)凭借修饰通常存在于未修饰食品中的成分比例而具有加强营养值和/或特定饮食帮助。
〃多核苷酸〃与〃核酸〃等词系意图涵盖单数核酸还有复数核酸、核酸分子或其片段、变体或衍生物、或构建体，譬如信使RNA(mRNA)或质粒DNA(pDNA)。多核苷酸或核酸可含有全长cDNA序列之核苷酸序列、或其片段，包括未翻译5’与3’序列及编码序列。多核苷酸或核酸可由任何聚核糖核苷酸或聚脱氧核糖核苷酸构成，该等可为未修饰RNA或DNA或经修饰RNA或DNA。举例来说，多核苷酸或核酸可由单/双链DNA、混合有单/双链区的DNA、单/双链RNA、及混合有单/双链区的RNA、包含可为单链或更通常为双链或混合有单/双链区之DNA与RNA的杂交分子所构成。该等用词亦囊括多核苷酸或核酸的化学性、酶性、或代谢性修饰形式。多核苷酸或核酸序列可称作〃分离〃，其中彼等系从其原生环境被移出。举例来说，包含在载体内的编码具有二羟酸脱水酶活性之多肽或多肽片段的异源性多核苷酸或核酸就本发明目的而言被视为分离。分离多核苷酸或核酸的另外例子系包括维持于异源宿主细胞内的重组多核苷酸或于溶液中的(部分地或实质上)纯化多核苷酸或核酸。根据本发明之分离多核苷酸或核酸又包括以合成方式制造的该类分子。呈DNA聚合物形式的分离多核苷酸或核酸可包含一或多 个cDNA片段、基因组DNA或合成DNA。〃基因〃 一词系指能够表达特定蛋白、选择性地包括编码序列之前(5’无编码序列)与之后(3’无编码序列)的调控序列的核酸或其片段。用于本案时，〃编码区〃 一词系指编码特定氨基酸序列的DNA序列。〃适宜调控序列"系指位于编码序列上游(5’无编码序列)、内部、或下游(3’无编码序列)的核苷酸序列，其影响相关编码序列的转录、RNA处理或稳定性、或翻译。调控序列可包括启动子、翻译前导序列、内含子、聚腺苷酸识别序列、RNA处理位点、效应物结合位置、及茎环结构。用于本案时，〃多肽〃 一词意图涵盖单数〃多肽〃还有复数〃多肽〃及其片段并指称由以酰胺键(亦习知为肽键)线性联结之单体(氨基酸)所组成的分子。"多肽"一词系指由二或多个氨基酸所组成的任何链或多链，并非指称特定长度产物。于是，肽、二肽、三肽、寡肽、蛋白、氨基酸链、或用于指称由二或多个氨基酸所组成之任何链或多链的任何其它用词系包括在〃多肽〃定义内，而〃多肽〃 一词可代替任一该等用词或互换使用。多肽可衍生自天然生物来源或以重组科技制造，但不一定由指定核酸序列翻译。可以任何方式生成,包括化学合成。"分离"多肽或或其片段、变体或衍生物意指不在其天然环境的多肽。不需特殊程度的纯化。举例来说，分离多肽可从其原生或自然环境移出。在宿主细胞中表达的重组制得多肽与蛋白就本发明目的而言被视为分离，以任何适宜技术分离、分割、或是部分或实质上纯化的原生或重组多肽亦然。用于本案时，〃原生〃系指多核苷酸、基因或多肽在自然界被发现-连同其本身调控序列，倘若存在的话-的形式。用于本案时，〃内源性〃系指多核苷酸、基因或多肽在其位于生物体或生物体基因组内的天然位置的原生形式。"内源性多核苷酸"系包括在其位于生物体基因组内的天然位置的原生多核苷酸。"内源性基因"系包括在其位于生物体基因组内的天然位置的原生基因。〃内源性多肽〃系包括在其位于生物体内的天然位置的原生多肽。用于本案时，〃异源性〃系指不是在宿主生物体内正常发现而是引进宿主生物体内的多核苷酸、基因或多肽。"异源性多核苷酸"系包括以异于对应原生多核苷酸的形式再次引进来源生物体内的原生编码区、或其之一部分。〃异源性基因〃系包括以异于对应原生基因的形式再次引进来源生物体内的原生编码区、或其之一部分。举例来说，异源性基因可包括以包括非原生调控区的嵌合基因之一部分再次引进原生宿主的原生编码区。〃异源性多肽"系包括以异于对应原生多肽的形式再次引进来源生物体内的原生多肽。用于本案时，〃修饰〃 一词系指改变本案所揭示的多核苷酸造成该多核苷酸编码之多肽的活性降低、实质上消除或消除，还有改变本案所揭示的多肽造成该多肽的活性降低、实质上消除或消除。该类改变可以本领域熟知方法进行，包括但不限于删除、突变(譬如自发诱变、随机诱变、突变加成基因导致的诱变、或转位子诱变)、取代、插入、负调控、更动细胞位置、更动多核苷酸或多肽状态(譬如甲基化、磷酸化或泛素化)、移除辅助因子、弓丨进反义RNA/DNA、引进干扰RNA/DNA、化学修饰、共价修饰、以UV或X-光照射、同源重组、有丝分裂重组、启动子置换法、和/或该等之组合。决定哪个核苷酸或氨基酸残基可被修饰的指引可藉由下列找到:比对特定多核苷酸或多肽和同源一譬如酵母或细菌一多核苷酸或多肽的序列，并使高度同源区(保守区)或共同序列内进行的修饰数量最大化。本案所用〃衍生物〃 一词系指本发明揭示序列之修饰。该类修饰的举例为取代、插入、和/或删除和本案所揭示编码序列的核酸序列相关的一或多个碱基，其保留、稍微更动、或增进油籽作物品种中本案所揭示编码序列的功能。该类衍生物可由本领域技术人员轻易决定，举例来说，使用计算机仿真技术以预测与最佳化序列结构。"衍生物"一词于是亦包括和本案所揭示编码序列具有实质序列同源性之核酸序列，由此使得其能具有用于制造本发明LC-PUFAs之揭示功能性。用于本案时，〃变体〃 一词系指藉由使用譬如重组DNA技术，例如诱变所创造的氨基酸插入、删除、突变、及取代而异于本发明明确列举多肽之多肽。决定哪个氨基酸残基可被置换、添加、或删除而不破坏感兴趣活性的指引可藉由下列找到:比对特定多肽和同源多肽的序列，并使高度同源区(保守区)内进行的氨基酸序列改变数量减至最少或以共同序
列置换氨基酸。或者，编码该等相同或类似多肽的重组多核苷酸变体可利用基因密码的〃冗余性"来合成或选择。可引进各式密码子取代-例如产生各式限制位点的沉默改变-以最佳化克隆到表达用质粒或病毒载体内。多核苷酸序列的突变可反映在多肽或加至该多肽以修饰多肽任何部分特性的其它肽域。氨基酸〃取代〃可为以具有相似结构和/或化学特性的另一氨基酸置换一氨基酸的结果，亦即保守的氨基酸置换，或该等可为以具有相异结构和/或化学特性的氨基酸置换一氨基酸的结果，亦即非保守的氨基酸置换。"保守的"氨基酸取代可以涉及残基的极性、电荷、溶解度、疏水性、亲水性、或两性本质之相似性为基础进行。举例来说，非极性(疏水)氨基酸系包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸及甲硫氨酸；极性中性氨基酸系包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、及谷氨酰胺；带正电(碱性)氨基酸系包括精氨酸、离氨酸、及组氨酸；及带负电(酸性)氨基酸系包括天冬氨酸与谷氨酸。或者，"非保守"氨基酸取代可藉由选择任一该等氨基酸的极性、电 荷、溶解度、疏水性、亲水性、或两性本质之相异性进行。〃插入〃或〃删除〃可在重组蛋白结构上或功能上耐受之变化范围内。容许的变化可藉由使用重组DNA技术在多肽分子内系统性地插入、删除、或取代氨基酸并检验所得重组变体的活性而以实验方式决定。〃启动子〃 一词系指能够控制编码序列或功能性RNA表达的DNA序列。一般而言，编码序列位于启动子序列的3’。启动子整体可衍生自原生基因、或由衍生自存在于自然界的不同启动子的不同单元组成、或甚至包含合成DNA片段。本领域技术人员系理解不同启动子可导引位于不同组织或细胞种类、或于不同发展阶段、或响应不同环境或生理条件的基因表达。在大多数时间使基因在大部分细胞种类内表达的启动子通常称作〃构成启动子"。又认知到既然在大部分情况中，调控序列的确切边界并无完整定义，故不同长度的DNA片段可具有相等的启动子活性。〃可操作地连接(operably linked) 〃 一词系指在单一核酸片段上的核酸序列关联性，所以一者的功能系受另一者影响。举例来说，启动子系和编码序列可操作地连接，如果该启动子能够招致该编码序列的表达(譬如该编码序列系受到该启动子的转录控制)。编码序列可以同义或反义方向可操作地连接至调控序列。本案所用〃表达〃 一词系指衍生自本发明核酸片段之有义(mRNA)或反义RNA的转录与稳定聚积。表达亦可指mRNA翻译至多肽。本案所用〃过度表达〃 一词系指高于相同或相关基因内源性表达的表达。倘若异源性基因表达高于相仿内源性基因之表达，则该异源性基因为过度表达。用于本案时，〃转化〃一词系指将核酸或片段送进宿主生物体，产生基因稳定的遗传。含有转化核酸片段的宿主生物体称作〃转基因〃或〃重组〃或〃转化〃生物体。本案所用"质粒"与"载体"用词系指额外的染色体单元，其经常携带不为细胞中央代谢一部分的基因且通常呈环状双链DNA分子形式。该类单元可为自主复制序列、基因组整合序列、噬菌体或核苷酸序列、线形或环状、由单-或双-链DNA或RNA构成、衍生自任何来源，其中众多核苷酸序列已联合或重组至一个能够把启动子片段与选定基因产物的DNA序列连同适当3’未翻译序列引进细胞的独特构型。
用于本案时，"密码子简并性"一词系指基因密码允许核苷酸序列变动而不影响被编码多肽的氨基酸序列的本质。本领域技术人员深知特定宿主细胞在使用核苷酸密码子指定给定的氨基酸时展现的〃密码子-偏倚〃。因此，当为了增进在一宿主细胞中的表达而合成一基因时，所欲的是俾使该基因的密码子使用频率接近该宿主细胞的较佳密码子使用频率来设计基因。〃密码子-最佳化〃 一词一指称供各式宿主转化之基因或核酸分子的编码区一系指更动基因或核酸分子编码区的密码子，以反映宿主生物体的典型密码子使用而无更动该DNA所编码的多肽。该类最佳化包括以该生物体基因中较常使用的一或多个密码子置换至少一个、或不止一个、或相当数量的密码子。包含编码任何多肽链之氨基酸的密码子的核苷酸序列倾向系容许编码该基因的序列中出现变化。由于各密码子由三个核苷酸构成，而包含核苷酸的DNA系限于四个特定碱，所以有64个可能的核苷酸组合，当中61个系编码氨基酸(剩余三个密码子编码结束翻译的信号)。展示哪个密码子编码哪个氨基酸的〃基因密码〃在本案系以表I再现。结果，许多氨基酸系被不止一个密码 子指定。举例来说，氨基酸丙氨酸与脯氨酸被四个三联体编码，丝氨酸与精氨酸被六个，但色氨酸与甲硫氨酸却只被一个三联体编码。此简并性使得DNA碱组合能大幅变动而无更动DNA编码蛋白的氨基酸序列。表1.标准基因密码
权利要求
1.一种基因改造芸薹属(Brassica)植物、其子代、细胞、组织、籽或部位，其包含: (i)编码多不饱和脂肪酸(PUFA)合成酶系统之核酸序列，该系统制造至少一PUFA ;及 (ii)编码磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶(PPTase)之核酸序列，该酶将磷酸泛酰巯基乙胺基辅助因子转移至PUFA合成酶系统ACP域。
2.权利要求1的基因改造芸薹属植物、其子代、细胞、组织、籽或部位，其中该植物、其子代、细胞、组织、籽或部位为油菜(Brassica napus)。
3.权利要求1的基因改造芸薹属植物、其子代、细胞、组织、籽或部位，其中该植物、其子代、细胞、组织、籽或部位为芥菜(Brassica juncea)。
4.权利要求1-3中任一项的基因改造芸薹属植物、其子代、细胞、组织、籽或部位，其中该PUFA合成酶系统包含和SEQ ID NO:1之氨基酸序列至少80%相同的氨基酸序列。
5.权利要求1-3中任一项的基因改造芸薹属植物、其子代、细胞、组织、籽或部位，其中该PUFA合成酶系统包含SEQ ID NO:1之氨基酸序列。
6.权利要求1-3中任一项的基因改造芸薹属植物、其子代、细胞、组织、籽或部位，其中该编码PUFA合成酶系统之核酸序列包含和SEQ ID NO: 6之核酸序列至少80%相同的核酸序列。
7.权利要求1-3中任一项的基因改造芸薹属植物、其子代、细胞、组织、籽或部位，其中该编码PUFA合成酶系统之核酸序列包含SEQ ID NO:6之核酸序列。
8.权利要求1-7中任一项的基因改造芸薹属植物、其子代、细胞、组织、籽或部位，其中该PUFA合成酶系统包含和SEQ ID NO: 2之氨基酸序列至少80%相同的氨基酸序列。
9.权利要求1- 7中任一项的基因改造芸薹属植物、其子代、细胞、组织、籽或部位，其中该PUFA合成酶系统包含SEQ ID NO: 2之氨基酸序列。
10.权利要求1-7中任一项的基因改造芸薹属植物、其子代、细胞、组织、籽或部位，其中该编码PUFA合成酶系统之核酸序列包含和SEQ ID NO: 7之核酸序列至少80%相同的核酸序列。
11.权利要求1-7中任一项的基因改造芸薹属植物、其子代、细胞、组织、籽或部位，其中该编码PUFA合成酶系统之核酸序列包含SEQ ID NO: 7之核酸序列。
12.权利要求1-11中任一项的基因改造芸薹属植物、其子代、细胞、组织、籽或部位，其中该PUFA合成酶系统包含和SEQ ID NO:3之氨基酸序列至少80%相同的氨基酸序列。
13.权利要求1-11中任一项的基因改造芸薹属植物、其子代、细胞、组织、籽或部位，其中该PUFA合成酶系统包含SEQ ID NO: 3之氨基酸序列。
14.权利要求1-11中任一项的基因改造芸薹属植物、其子代、细胞、组织、籽或部位，其中该编码PUFA合成酶系统之核酸序列包含和SEQ ID NO:8之核酸序列至少80%相同的核酸序列。
15.权利要求1-11中任一项的基因改造芸薹属植物、其子代、细胞、组织、籽或部位，其中该编码PUFA合成酶系统之核酸序列包含SEQ ID NO:8之核酸序列。
16.权利要求1-3中任一项的基因改造芸薹属植物、其子代、细胞、组织、籽或部位，其中该PUFA合成酶系统包含SEQ ID NOs: 1-3之氨基酸序列。
17.权利要求1-3中任一项的基因改造芸薹属植物、其子代、细胞、组织、籽或部位，其中该编码PUFA合成酶系统之核酸序列包含SEQ ID NOs: 6-8之核酸序列。
18.权利要求1-17中任一项的基因改造芸薹属植物、其子代、细胞、组织、籽或部位，其中该PPTase包含和SEQ ID NO: 5至少80%相同之氨基酸序列。
19.权利要求1-17中任一项的基因改造芸薹属植物、其子代、细胞、组织、籽或部位，其中该PPTase包含SEQ ID NO: 5之氨基酸序列。
20.权利要求1-17中任一项的基因改造芸薹属植物、其子代、细胞、组织、籽或部位，其中该编码PPTase之核酸序列和SEQ ID NO: 10之核酸序列至少80%相同。
21.权利要求1-17中任一项的基因改造芸薹属植物、其子代、细胞、组织、籽或部位，其中该编码PPTase之核酸序列包含SEQ ID NO: 10之核酸序列。
22.权利要求1-21中任一项的基因改造芸薹属植物、其子代、细胞、组织、籽或部位，其中(i)与(ii)之核酸序列包含于单一重组表达载体。
23.权利要求1-22中任一项的基因改造芸薹属植物、其子代、细胞、组织、籽或部位，其中(i)与(ii)之核酸序列可操作地连接至籽特异性启动子。
24.权利要求1-23中任一项的基因改造芸薹属植物、其子代、细胞、组织、籽或部位，其中(i)与(ii)之核酸序列可操作地连接至选自由下列所构成之群组的启动子:PvDleC2、LfKCS3 及 FAE1。
25.权利要求1-24中任一项的基因改造芸薹属植物、其子代、细胞、组织、籽或部位，其进一步包含: (iii)编码酰基-CoA合成酶(ACoAS)之核酸序列，该酶催化长链PUFA游离脂肪酸(FFA)转换成酰基-CoA。
26.权利要求25的基因改造芸薹属植物、其子代、细胞、组织、籽或部位，其中该ACoAS包含和SEQ ID N0:4至少80%相同之氨基酸序列。
27.权利要求25的基因改造芸薹属植物、其子代、细胞、组织、籽或部位，其中该ACoAS包含SEQ ID NO:4之氨基酸序列。
28.权利要求25的基因改造芸薹属植物、其子代、细胞、组织、籽或部位，其中该编码ACoAS之核酸序列包含和SEQ ID NO: 9之核酸序列至少80%相同的核酸序列。
29.权利要求25的基因改造芸薹属植物、其子代、细胞、组织、籽或部位，其中该编码ACoAS之核酸序列包含SEQ ID NO:9之核酸序列。
30.权利要求25的基因改造芸薹属植物、其子代、细胞、组织、籽或部位，其中该编码ACoAS之核酸序列包含SEQ ID N0:34之核酸序列。
31.权利要求25-30中任一项的基因改造芸薹属植物、其子代、细胞、组织、籽或部位，其中(i)、( )及(iii)之核酸序列包含于单一重组表达载体。
32.权利要求25-31中任一项的基因改造芸薹属植物、其子代、细胞、组织、籽或部位，其中(i)、(ii)及(iii)之核酸序列可操作地连接至籽特异性启动子。
33.权利要求25-32中任一项的基因改造芸薹属植物、其子代、细胞、组织、籽或部位，其中(i)、( )及(iii)之核酸序列可操作地连接至选自由下列所构成之群组的启动子:PvDlec2、LfKCS3 及 FAE1。
34.权利要求1-33中任一项的基因改造芸薹属植物、其子代、细胞、组织、籽或部位，其还包含编码乙酰基CoA羧化酶(ACCase)之核酸序列和/或编码第2型二酰基甘油酯酰基转移酶(DGAT2)之核酸序列。
35.一种分离核酸分子，其包含选自SEQ ID NOs:6-10之核酸序列。
36.一种重组表达载体pDAB7361。
37.一种重组表达载体pDAB7362。
38.一种重组表达载体pDAB7363。
39.权利要求1-34中任一项的基因改造芸薹属植物、其子代、细胞、组织、籽或部位，其中该植物、其子代、细胞、组织、籽或部位包含可检测量的DHA(二十二碳六烯酸(C22: 6，n-3))、DPA (C22: 5，n_6 或 n_3)、或 EPA ( 二十碳五烯酸(C20: 5，n_3))。
40.权利要求1-34与39中任一项的基因改造芸薹属植物、其子代、细胞、组织、籽或部位，其中该植物、其子代、细胞、组织、籽或部位包含0.01%至15%DHA。
41.权利要求1-34、39与40中任一项的基因改造芸薹属植物、其子代、细胞、组织、籽或部位，其中该植物、其子代、细胞、组织、籽或部位包含0.05%至10%DHA。
42.权利要求1-34与39-41中任一项的基因改造芸薹属植物、其子代、细胞、组织、籽或部位，其中该植物、其子代、细胞、组织、籽或部位包含0.05%至5%DHA。
43.权利要求1-34与39-42中任一项的基因改造芸薹属植物、其子代、细胞、组织、籽或部位，其中该植物、其子代、细胞、组织、籽或部位包含0.01%至596EPA。
44.权利要求1-34与39-43中任一项的基因改造芸薹属植物、其子代、细胞、组织、籽或部位，其中该植物、其子代、细胞、组织、籽或部位包含0.05%至596EPA。
45.权利要求1-34与39-44中任一项的基因改造芸薹属植物、其子代、细胞、组织、籽或部位，其中该植物、 其子代、细胞、组织、籽或部位包含0.05%至P/oEPA。
46.权利要求1-34与39-45中任一项的基因改造芸薹属植物、其子代、细胞、组织、籽或部位，其中该植物、其子代、细胞、组织、籽或部位包含0.01%至5%DPA。
47.权利要求1-34与39-46中任一项的基因改造芸薹属植物、其子代、细胞、组织、籽或部位，其中该植物、其子代、细胞、组织、籽或部位包含0.05%至5%DPA。
48.权利要求1-34与39-47中任一项的基因改造芸薹属植物、其子代、细胞、组织、籽或部位，其中该植物、其子代、细胞、组织、籽或部位包含0.05%至1%DPA。
49.一种油，其得自权利要求1-34与39-48中任一项的基因改造芸薹属植物、其子代、细胞、组织、籽或部位。
50.一种籽，其得自权利要求1-34与39-48中任一项的基因改造芸薹属植物、其子代、细胞、组织、籽或部位。
51.一种籽油，其得自权利要求1-34与39-48中任一项的基因改造芸薹属植物、其子代、细胞、组织、籽或部位。
52.—种食品，其包含得自权利要求1-34与39-48中任一项的基因改造芸薹属植物、其子代、细胞、组织、籽或部位之油，或得自权利要求1-34与39-48中任一项的基因改造芸薹属植物、其子代、细胞、组织、籽或部位之籽。
53.一种功能食品，其包含得自权利要求1-34与39-48中任一项的基因改造芸薹属植物、其子代、细胞、组织、籽或部位之油，或得自权利要求1-34与39-48中任一项的基因改造芸薹属植物、其子代、细胞、组织、籽或部位之籽。
54.一种医药产品，其包含得自权利要求1-34与39-45中任一项的基因改造芸薹属植物、其子代、细胞、组织、籽或部位之油，或得自权利要求1-34与39-48中任一项的基因改造芸薹属植物、其子代、细胞、组织、籽或部位之籽。
55.一种制造包含至少一 PUFA之油的方法，该方法包含从权利要求1-34与39-45中任一项的基因改造芸薹属植物、其子代、细胞、组织、籽或部位或从权利要求1-34与39-48中任一项的基因改造芸薹属植物、其子代、细胞、组织或部位之籽回收油。
56.一种制造包含至少一 PUFA之油的方法，该方法包含使权利要求1-34与39-48中任一项的基因改造芸薹属植物、其子代、细胞、组织、籽或部位生长。
57.一种制造在籽油中的至少一 PUFA的方法，该方法包含从权利要求1-34与39-48中任一项的基因改造芸薹属植物、其子代、细胞、组织或部位之籽回收油。
58.一种制造在籽油中的至少一 PUFA的方法，该方法包括使权利要求1-34与39-48中任一项的基因改造芸薹属植物、其子代、细胞、组织、籽或部位生长。
59.一种提供含有至少一 PUFA之补充品或治疗产品给一个体的方法，该方法包含提供权利要求1-34与39-48中任一项的基因改造芸薹属植物、其子代、细胞、组织、籽或部位、权利要求49的油、权利要求50的籽、权利要求51的籽油、权利要求52的食品、权利要求53的功能食品、或权利要求54的医药产品给该个体。
60.权利要求55-59中任一项的方法，其中该PUFA为DHA。
61.权利要求55-59中任一项的方法，其中该PUFA为EPA。
62.一种制造权利要求1-34与39-48中任一项的基因改造芸薹属植物、其子代、细胞、组织、籽或部位的方法，该方法包含以下列核酸序列转化芸薹属植物或植物细胞:(i)编码藻类PUFA合成酶之核酸序列，该酶制造至少一多不饱和脂肪酸(PUFA);及(ii)编码磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶(PPTase)之核酸序列，该酶将磷酸泛酰巯基乙胺基辅助因子转移至藻类PUFA合成酶A CP域。
63.权利要求62的方法，该方法进一步包含以下列核酸序列转化芸薹属植物或植物细胞:(iii)编码酰基-CoA合成酶(ACoAS)之核酸序列，该酶催化长链PUFA游离脂肪酸(FFA)转换成酰基-CoA。
64.一种来自芸薹属植物籽的油组成物，其包含约0.05%至5%DHA。
65.一种来自芸薹属植物籽的油组成物，其包含约0.05%至5%DHA并具有>70%油酸(以重量计)之脂肪酸配置。
66.一种来自芸薹属植物籽的油组成物，其包含约0.05%至5%DHA并具有〈3.5% α -亚麻酸(以重量计)之脂肪酸配置。
67.一种来自芸薹属植物籽的油组成物，其包含约0.05%至5%DHA并具有>70%油酸与<3.5% α -亚麻酸(以重量计)之脂肪酸配置。
68.一种制造权利要求1-34与39-48中任一项的基因改造芸薹属植物、其子代、细胞、组织、籽或部位的方法，该方法包含以包含下列核酸序列之表达盒转化芸薹属植物或植物细胞:(i)编码PUFA合成酶系统之核酸序列，该系统制造至少一多不饱和脂肪酸(PUFA)；( )编码酰基-CoA合成酶(ACoAS)之核酸序列，该酶催化长链PUFA游离脂肪酸(FFA)转换成酰基-CoA ;及(iii)编码磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶(PPTase)之核酸序列，该酶活化PUFA合成酶系统ACP域。
全文摘要
本发明提供重组宿主生物体(譬如植物)，该生物体系以容许和/或增进宿主生物体中PUFAs生产的多不饱和脂肪酸(PUFA)合成酶系统与一或多个辅助蛋白(譬如PPTase和/或ACoAS)之基因修饰。本发明亦关于制造和使用该类生物体(譬如用以获得PUFAs)的方法以及由该类生物体获得的产品(譬如油和/或籽)。
文档编号C12N5/00GK103080319SQ201180035255
公开日2013年5月1日 申请日期2011年5月17日 优先权日2010年5月17日
发明者T.A.沃尔什, A.O.默洛, D.加乔特, P.G.罗斯勒, S.贝万, J.M.库纳, J.G.梅茨 申请人:陶氏益农公司, Dsm Ip资产公司