专利名称：由重组异养微生物生产的特制油的制作方法
技术领域：
本发明涉及由微生物制成的油类、燃料以及油脂化学品的生产。具体来说，本发明涉及产油微藻、对它们进行培育以生产有用的化合物(包括脂质、脂肪酸酯、脂肪酸、醛、醇以及烷烃)的方法，以及用于对它们进行遗传学改变以提高生产效率并且改变由它们生产的油类的类型和组成的方法和试剂。
背景技术：
化石燃料是埋藏的有机材料的可燃地质沉积物的通用术语，由腐烂的植物和动物形成，所述植物和动物通过历经数亿万年暴露于地壳中的热和压力而已经转化成原油、煤、天然气或重油。化石燃料是有限的、不可再生的资源。全球经济带来的能源需求增加还使得烃的成本压力逐渐增加。除了能源以外，很多行业，包括塑料业和化学品制造商，主要依赖于获得烃作为其制造方法的原料。对目前供给来源的具有成本效益的替代品可以帮助减轻能源和这些原材料成本的不断增加的压力。PCT公布第2008/151149号描述了用于培育微藻以生产油类的方法和材料,并且尤其示例了由微藻原始小球藻(Chlorellaprotothecoides)产生的油类生产柴油燃料。仍然需要提供在微藻中生产油类的改良型方法，特别是以较高产率和效率生产链长较短、饱和度较高并且没有色素的油类的方法。本发明满足这种需求。发明概述本发明提供了具有独特的脂质型态的产油微生物细胞，优选地是微藻细胞，并且包括表达编码如脂肪酰基-ACP硫酯酶的 蛋白质的外源性基因的重组细胞。本发明还提供了由所述细胞制备脂质和油基产品(包括燃料，如生物柴油、可再生柴油以及喷气燃料)的方法。在第一方面，本发明提供了产油微生物细胞，优选地是微藻细胞，所述细胞的脂质型态是C8:0占至少I %或至少5%，优选地占至少3%。在一些情况下，脂质型态是C8:0占至少10%或至少15%，优选地占至少12%。在一些实施方案中，所述细胞是重组细胞。在一些情况下，所述重组细胞包含编码酰基-ACP硫酯酶蛋白的外源性基因，所述酰基-ACP硫酯酶蛋白针对链长是CS的脂肪酰基-ACP底物具有水解活性。在一些实施方案中，所述外源性基因编码湿地萼距花(Cupheapalustris)酰基-ACP硫酯酶。在一些情况下，所述细胞是原藻(Prototheca)细胞。在一些情况下，所述细胞属于选自表I中所标示的微藻的微藻属或物种。在第二方面，本发明提供了产油微生物细胞，优选地是微藻细胞，所述细胞的脂质型态是C10:0占至少4%。在一些情况下，脂质型态是C10:0占至少20%、至少25%或至少30%，优选地占至少24%。在一些情况下，C10:0与C12:0的比率是至少6: I。在一些实施方案中，所述细胞是重组细胞。在一些情况下，所述重组细胞包含编码酰基-ACP硫酯酶蛋白的外源性基因，所述酰基-ACP硫酯酶蛋白针对链长是ClO的脂肪酰基-ACP底物具有水解活性。在一些实施方案中，所述外源性基因编码来自以下物种的酰基-ACP硫酯酶蛋白，所述物种选自由细叶萼距花(Cuphea hookeriana)和美国榆(Ulmus americana)组成的组。在一些情况下，所述细胞是原藻细胞。在一些实施方案中，所述细胞属于选自表I中所标不的微藻的微藻属或物种。在第三方面，本发明提供了产油微生物细胞，优选地是微藻细胞，所述细胞的脂质型态是C12:0占至少10%或至少15%，优选地占至少13%。在一些情况下，脂质型态是C12:0占至少30%、至少35%或至少40%，优选地占至少34%。在一些情况下，C12与C14的比率是至少5: I。在一些情况下，所述细胞是重组细胞。在一些实施方案中，所述重组细胞包含编码酰基-ACP硫酯酶蛋白的外源性基因，所述酰基-ACP硫酯酶蛋白针对链长是C12的脂肪酰基-ACP底物具有水解活性。在一些情况下，所述重组细胞包含编码来自加州月桂(Umbellularia californica)和樟树(Cinnamomum camphora)的酸基-ACP 硫酯酶蛋白的至少两种外源性基因，所述酰基-ACP硫酯酶蛋白针对链长是C12的脂肪酰基-ACP底物具有水解活性。在一些实施方案中，所述细胞是原藻细胞。在第四方面，本发明提供了产油微生物细胞，优选地是微藻细胞，所述细胞的脂质型态是C14:0占至少5%或至少15%，优选地占至少10%。在一些情况下，脂质型态是C14:0占至少40%、至少45%或至少50%，优选地占至少43%。在一些情况下，C14:0与C12:0的比率是至少7: I。在一些情况下，所述细胞是重组细胞。在一些实施方案中，所述重组细胞包含编码酰基-ACP硫酯酶蛋白的外源性基因，所述酰基-ACP硫酯酶蛋白针对链长是C14的脂肪酰基-ACP底物具有水解活性。在一些实施方案中，所述酰基-ACP硫酯酶蛋白来自于选自由樟树和美国榆组成的组的物种。在一些情况下，所述细胞是原藻细胞。在一些实施方案中，所述细胞属于选自表I中所标不的微藻的微藻属或物种。在第五方面，本发明提供了产油微生物细胞，优选地是微藻细胞，所述细胞的脂质型态是C16:0占至少10%或至少20%，优选地占至少15%。在一些情况下，脂质型态是C16:0占至少30%、至少35%或至少40%，优选地占至少37%。在一些情况下，所述细胞是重组细胞。在一些实施方案中，所述重组细胞包含编码酰基-ACP硫酯酶蛋白的外源性基因，所述酰基-ACP硫酯酶蛋白针对链长是C16的脂肪酰基-ACP底物具有水解活性。在一些实施方案中，所述重组细胞包含编码来自加州月桂和樟树的酰基-ACP硫酯酶蛋白的至少两种外源性基因，所述酰基-ACP硫酯酶蛋白针对链长是C16的脂肪酰基-ACP底物具有水解活性。在一些情况下，所述细胞是原藻细胞。在第六方面，本发明提供了产油微生物细胞，优选地是微藻细胞，所述细胞的脂质型态是饱和脂肪酸占至少55%或至少65%，优选地占至少60%。在一些情况下，所述细胞的脂质型态是饱和脂肪酸占至少80 %、至少85 %或至少90 %，优选地占至少86 %。在一些情况下，所述细胞是重组细胞。在一些实施方案中，所述重组细胞包含编码酰基-ACP硫酯酶蛋白的外源性基因，所述酰基-ACP硫酯酶蛋白针对链长是C10-C16的脂肪酰基-ACP底物具有水解活性。在一些实施方案中，所述细胞包含编码酮酰基合酶蛋白的外源性基因。在一些情况下，所述细胞是原藻细胞。在第七方面，本发明提供了产油微生物细胞，优选地是微藻细胞，所述细胞包含突变型内源性去饱和酶基因，其中所述突变使得所述基因或去饱和酶无活性。在一些情况下，所述细胞的脂质型态是饱和脂肪酸占至少40%或至少50%，优选地占至少45%。在一些情况下，所述细胞的脂质型态是C18:0占至少15%、至少20%或至少25%，优选地占至少19 %。在一些实施方案中，所述细胞包含突变型内源性去饱和酶基因，所述突变型内源性去饱和酶基因使得与野生型细胞相比C18:0脂肪酸增加到至少2倍。在一些情况下，所述微藻细胞的脂质型态是C 18:2占至多I %或至多5%，优选地占至多2%。在一些实施方案中，所述微藻细胞的脂质型态是18: I占至多5%或至多10%，优选地占至多7%。在本文所述的重组细胞的一些实施方案中，所述细胞包含突变型内源性去饱和酶基因，其中所述突变使得所述基因或去饱和酶无活性。在第八方面，本发明提供了一种制备脂质的方法。在一个实施方案中，所述方法包括(a)培育如上文所述的细胞直到所述细胞中以干重计脂质占至少15%或至少25%，优选地占至少20%为止，以及(b)将脂质与水溶性生物质组分分离。在第九方面，本发明提供了另一种制备脂质的方法。在一个实施方案中，所述方法包括(a)培育产油微生物细胞，优选地培育微藻细胞，所述细胞含有编码两种不同的酰基-ACP硫酯酶的外源性基因，其中所述细胞的脂质型态不同于⑴不含所述外源性基因的细胞的型态和(ii)仅含一种外源性基因的细胞的型态，以及(b)将脂质与水溶性生物质组分分离。在一些情况下，至少一种外源性基因编码选自由表4中所标示的硫酯酶组成的组的脂肪酰基-ACP硫酯酶。在第十方面，本发明提供了一种制备油基产品的方法。在一个实施方案中，所述方法包括(a)培育如上文所述的细胞直到所述细胞中以干重计脂质占至少5%或至少15%，优选地占至少10%为止，(b)将脂质与水溶性生物质组分分离，以及(C)对脂质进行选自由以下组成的组的至少一种化学反应:皂化；复分解；酸水解；碱水解；酶促水解；催化水解；热压水水解；催化水解反应，其中使脂质分解成甘油和脂肪酸；产生脂肪族氮化合物的胺化反应；产生一元酸和二元酸的臭氧分解反应；甘油三酯分解反应，选自由酶促分解和压力分解组成的组；水解反应之后进行缩合反应；加氢处理反应；加氢处理反应以及在加氢处理反应之前或同时进行脱氧反应或缩合反应；除气反应；脱氧反应，选自由氢解反应、氢化、连续氢化-氢解反应、连续氢解-氢化反应以及联合氢化-氢解反应组成的组；脱氧反应后进行缩合反应；酯化反应；酯交换反应；酯基转移反应；羟基化反应；以及羟基化反应后进行缩合反应，借以生产油基产品。在一些情况下，所述油基产品选自肥皂或燃料产品。在一些实施方案中，所述油基产品是选自由生物柴油、可再生柴油以及喷气燃料所组成的组的燃料产品。在一些情况下，所述燃料产品是具有一种或多种下列属性的生物柴油:(i)0.01mcg/g-0.5mcg/g、0.025mcg/g-0.3mcg/g,优选 0.05mcg/g-0.244mcg/g 的总类胡萝卜素；(ii)少于 0.0lmcg/g、少于0.005mcg/g,优选少于0.003mcg/g的番爺红素；(iii)少于0.01mcg/g、少于0.005mcg/g,优选少于 0.003mcg/g 的 β -胡萝卜素；(iv) 0.0lmcg/g-0.5mcg/g、0.025mcg/g-0.3mcg/g,优选 0.045mcg/g-0.268mcg/g 的叶绿素 A ; (v) lmcg/g-500mcg/g、35mcg/g-175mcg/g,优选 38.3mcg/g-164mcg/g 的生育酹；(vi)少于 I %、少于 0.5 %,优选少于0.25%的菜籽甾醇、菜油甾醇、豆甾醇或β -谷甾醇；(vii) IOOmcg/g-500mcg/g>225mcg/g-350mcg/g,优选 249.6mcg/g-325.3mcg/g 的总生育三烯酌.； (viii)0.001mcg/g-0.lmcg/g、0.0025mcg/g-0.05mcg/g,优选 0.003mcg/g_0.039mcg/g 的叶黄素；或(ix) IOmcg/g-500mcg/g、50mcg/g-300mcg/g,优选 60.8mcg/g-261.7mcg/g 的生育酹。在一些情况下，燃料产品是T10-T90为至少20°C、40°C或60°C的可再生柴油。在一些情况下，燃料产品是符合HRJ-5和/或ASTM规范D1655的喷气燃料。在第十一方面，本发明提供了一种甘油三酯油类，所述甘油三酯油类包含(a) CS: O占至少3%、C10:0占至少4%、C12:0占至少13%,C14:0占至少10%和/或饱和脂肪酸占至少60%的脂质型态，以及(b) —种或多种下列属性:(i) 0.0lmcg/g-0.5mcg/g、0.025mcg/g-0.3mcg/g,优选 0.05mcg/g-0.244mcg/g 的总类胡萝卜素；(ii)少于 0.01mcg/g、少于
0.005mcg/g,优选少于 0.003mcg/g 的番爺红素；(iii)少于 0.01mcg/g、少于 0.005mcg/g,优选少于 0.003mcg/g 的 β -胡萝卜素；(iv) 0.01mcg/g-0.5mcg/g、0.025mcg/g-0.3mcg/g，优选 0.045mcg/g-0.268mcg/g 的叶绿素 A ； (v) lmcg/g-300mcg/g、35mcg/g-175mcg/g,优选38.3mcg/g-164mcg/g的Y -生育酹；(vi)少于I %、少于0.5%,优选少于0.25%的菜籽甾醇、菜油留醇、豆留醇或 β -谷留醇；(vii) 100mcg/g-500mcg/g、225mcg/g-350mcg/g,优选 249.6mcg/g-325.3mcg/g 的总生育三烯酌.； (viii)0.00lmcg/g-0.lmcg/g、0.0025mcg/g-0.05mcg/g,优选 0.003mcg/g-0.039mcg/g 的叶黄素；或(ix) IOmcg/g_500mcg/g、50mcg/g-300mcg/g,优选 60.8mcg/g-261.7mcg/g 的生育酹。在第十二方面，本发明提供了一种分离的油，所述油是来自CS: ClO脂肪酸比率是至少5: I的微藻。在一相关方面，本发明提供了一种分离的油，所述油是来自具有至少50%至75%，优选至少60%的饱和脂肪酸的微藻。在另一相关方面，本发明提供了一种分离的油，所述油是来自C16: 14脂肪酸比 率是约2: I的微藻。在再另一相关方面，本发明提供了一种分离的油，所述油是来自C12: C14脂肪酸比率是至少5: I的微藻。在一些实施方案中，所述微藻含有至少一种外源性基因。在一些情况下，所述微藻属于原藻属。在第十三方面，本发明提供了一种甘油三酯油类，所述甘油三酯油类包含(a)如下的脂质型态:< C12占少于5%或少于2%，优选地占少于1% ；C14:0占1% -10%之间，优选地占2% -7%之间；C16:0占20% -35%之间，优选地占23% -30%之间；C18:0占5% -20%之间，优选地占7% -15%之间；C18:1占35% -60%之间，优选地占40% -55%之间；以及C18:2脂肪酸占1% -20%之间，优选地占2% -15%之间；以及(b) —种或多种下列属性:(i) 0.01mcg/g-0.5mcg/g、0.025mcg/g_0.3mcg/g,优选 0.05mcg/g-0.244mcg/g的总类胡萝卜素；(ii)少于0.01mcg/g、少于0.005mcg/g,优选少于0.003mcg/g的番爺红素；(iii)少于0.01mcg/g、少于0.005mcg/g,优选少于0.003mcg/g的β -胡萝卜素；(iv) 0.0lmcg/g-0.5mcg/g、0.025mcg/g_0.3mcg/g,优选 0.045mcg/g_0.268mcg/g 的叶绿素 A ; (V) lmcg/g-300mcg/g、35mcg/g-175mcg/g,优选 38.3mcg/g_164mcg/g 的生育酚；(vi)少于1%、少于0.5%，优选少于0.25%的菜籽甾醇、菜油甾醇、豆甾醇或β-谷留醇；(vii) 100mcg/g-500mcg/g、225mcg/g-350mcg/g,优选 249.6mcg/g_325.3mcg/g 的总生育三烯酌.; (viii)0.0Olmcg/g-0.lmcg/g、0.0025mcg/g-0.05mcg/g,优选 0.003mcg/g-0.039mcg/g 的叶黄素；或(ix) 10mcg/g-500mcg/g、50mcg/g-300mcg/g,优选 60.8mcg/g-261.7mcg/g 的生育酹。在一些情况下，甘油三酯油类是从包含一种或多种外源性基因的微生物中分离的。在一些实施方案中，一种或多种外源性基因编码脂肪酰基-ACP硫酯酶。在一些情况下，所述脂肪酰基-ACP硫酯酶针对链长是C14的脂肪酰基-ACP底物具有水解活性。在一些实施方案中，所述微生物进一步包含突变型内源性去饱和酶基因，其中所述突变使得所述基因或去饱和酶无活性。在第十四方面，本发明提供了一种制备甘油三酯油类的方法，所述甘油三酯油类包含如下的脂质型态:< C12占少于5%或少于2%，优选地占少于1%;C14:0占1% -10%之间，优选地占2% -7%之间；C16:0占20% -35%之间，优选地占23% -30%之间；C18:0占5% -20%之间，优选地占7% -15%之间；C18:1占35% -60%之间，优选地占40% -55%之间；以及C18:2脂肪酸占1% -20%之间，优选地占2% -15%之间，其中从包含一种或多种外源性基因的微生物中分离出所述甘油三酯油类。在一些情况下，所述甘油三酯油类包含如下的脂质型态:C14:0占1% -10%，优选地占3% -5%；C16:0占20% -30%，优选地占25 % -27 % ；C18:0 占 5 % -20 %，优选地占 10 % -15 % ;以及 C18:1 占 35 % -50 %，优选地占40%-45%。在一些实施方案中，一种或多种外源性基因编码脂肪酰基-ACP硫酯酶。在一些情况下，所述脂肪酰基-ACP硫酯酶针对链长是C14的脂肪酰基-ACP底物具有水解活性。在一些情况下，所述微生物进一步包含突变型内源性去饱和酶基因，其中所述突变使得所述基因或去饱和酶无活性。在一些情况下，一种或多种外源性基因是蔗糖转化酶。在一些实施方案中，所述突变型内源性去饱和酶基因是硬脂酰基-酰基载体蛋白去饱和酶(SAD)(例如SEQ ID NO:199-200)。在一些实施方案中，所述突变型内源性去饱和酶基因是脂肪酸去饱和酶(FAD)。在第十五方面，本发明提供了一种产油微生物细胞，优选地是微藻细胞，所述细胞包含甘油三酯油类，其中所述甘油三酯油类的脂肪酸型态选自由以下组成的组:C8:0占至少约1% ；C10:0占至少约1% ；C12:0占至少约1% ；C14:0占至少约2% ；C16:0占至少约30% ；C18:0占至少约5% ；C18:1占至少约60% ；C18:2占少于约7% ;以及饱和脂肪酸占至少约35 %。在一些情况下，产油微生物细胞包含外源性基因，并且任选地包含所述产油微生物细胞的内源性去饱和酶，所述内源性去饱和酶已失活或突变而具有较小的酶活性。在一些情况下，甘油三酯油类的脂肪酸型态类似于天然存在的油的脂肪酸型态。在一些情况下，天然存在的油选自由以下组成的组:可可脂、椰子油、棕榈油、棕榈仁油、牛油树脂、牛脂以及猪油。在一些情况下，甘油三酯油类的脂肪酸型态包含选自由以下组成的组的型态:C8:0与C10:0的组合总量是至少约10% ;C10:0、C12:0与C14:0的组合总量是至少约50% ;C16:0、C18:0与C18:l的组合总量是至少约60% ;C18:0、C18:l与C18:2的组合总量是至少约60% ;C14:0、C16:0、C18:0与C18:l的组合总量是至少约60% ;以及C18:l与C18:2的组合总量少于约30%。在一些情况下，甘油三酯油类的脂肪酸型态包含选自由以下组成的组的脂肪酸比率:C8:0与C10:0的比率是至少约5: I ;C10:0与C12:0的比率是至少约6: I ;C12:0与C1 4:0的比率是至少约5: I ;C14:0与C12:0的比率是至少约7: I ;以及C14:0与C16:0的比率是至少约1: 2。
在一些情况下，内源性去饱和酶选自由硬脂酰基ACP去饱和酶和δ -12脂肪酸去饱和酶组成的组。在一些情况下，外源性基因选自由编码酰基-ACP硫酯酶的基因组成的组。在一些情况下，外源性基因编码选自由表4中所标示的那些酰基-ACP硫酯酶组成的组的酰基-ACP硫酯酶。在一些情况下，产油微生物细胞进一步包含编码蔗糖转化酶的基因。在各种实施方案中，产油微生物细胞是选自以下的微藻属或物种的细胞:东方曲壳藻(Achnanthes orientalis)、阿格藻属(Agmenellum)、透明苗形藻(Amphiprorahyaline)、咖啡形双眉藻(Amphoracoffeiformis)、咖啡形双眉藻线形变种(Amphoracoffeiformis linea)、咖啡形双眉藻点纹变种(Amphora coffeiformis punctata)、咖啡形双眉藻泰勒氏变种(Amphora coffeiformis taylori)、咖啡形双眉藻小型变种(Amphora coffeiformis tenuis)、优美双眉藻(Amphora delicatissima)、优美双眉藻头状变种(Amphora delicatissima capitata)、双眉藻属(Amphora sp.)、项圈藻属(Anabaena)、纤维藻 属(Ankistrodesmus)、德形纤维藻(Ankistrodesmus falcatus)、黄金色藻(Boekelovia hooglandii)、波氏藻属(Borodinella sp.)、布朗葡萄藻(Botryococcus braunii)、苏台德克斯葡萄藻(Botryococcus sudeticus)、卡特藻属(Carteria)、纤细角毛藻(Chaetoceros gracilis)、牟氏角毛藻(Chaetoceros muelleri)、牟氏角毛藻广盐变种(Chaetoceros muelleri subsalsum)、角毛藻属(Chaetocerossp.)、无硝小球藻(Chlorella anitrata)、南极小球藻(Chlorella Antarctica)、金绿小球藻(Chlorella aureoviridis)、卡氏小球藻(Chlorella Candida)、包囊小球藻(Chlorella capsulate)、脱水小球藻(Chlorella desiccate)、捕圆形小球藻(Chlorellaellipsoidea)、浮水小球藻(Chlorella emersonii)、淡褐小球藻(Chlorella fusca)、淡褐小球藻空腔变种(Chlorella fusca var.vacuolata)、谷氏小球藻(Chlorellaglucotropha)、水溪小球藻(Chlorellainfusionum)、水溪小球藻栖海岸变种(Chlorellainfusionum var.actophila)、水溪小球藻增大变种(Chlorella infusionum var.auxenophila)、凯氏小球藻(Chlorella kessleri)、匍扇小球藻(Chlorellalobophora)(藻株SAG 37.88)、黄绿小球藻(Chlorella Iuteoviridis)、黄绿小球藻金绿变种(Chlorella luteoviridis var.aureoviridis)、黄绿小球藻淡黄变种(Chlorellaluteoviridis var.lutescens)、红藻小球藻(Chlorellaminiata)、极微小球藻(Chlorellaminutissima)、突变小球藻(Chlorellamutabilis)、夜间小球藻(Chlorella nocturna)、巴夫氏小球藻(Chlorellaparva)、嗜光小球藻(Chlorella photophila)、普氏小球藻(Chlorellapringsheimii)、原始小球藻(Chlorella protothecoides)(包括 UTEX 藻株 1806、411、264、256、255、250、249、31、29、25 以及 CCAP 藻株 211/17 和 211/8d 中的任一种)、原始小球藻耐酸变种(Chlorellaprotothecoides var.acidicola)、规则小球藻(Chlorella regularis)、规则小球藻小型变种(Chlorella regularis var.minima)、规则小球藻伞状变种(Chlorella regularis var.umbricata)、瑞氏小球藻(Chlorella reisiglii)、嗜糖小球藻(Chlorella saccharophila)、嗜糖小球藻捕圆形变种(Chlorellasaccharophila var.ellipsoidea)、盐生小球藻(Chlorellasalina)、简单小球藻(Chlorella simplex)、耐热性小球藻(Chlorella sorokiniana)、小球藻属(Chlorella sp.)、球形小球藻(Chlorella sphaerica)、斯蒂格小球藻(Chlorella stigmatophora)、万尼氏小球藻(Chlorella vanniellii)、普通小球藻(Chlorella vulgaris)、普通小球藻、普通小球藻粗皮变型(Chlorellavulgarisf.tertia)、普通小球藻自养变种(Chlorella vulgaris var.autotrophica)、普通小球藻绿色变种(Chlorella vulgaris var.viridis)、普通小球藻普通变种(Chlorellavulgaris var.vulgaris)、普通小球藻普通变种粗皮变型(Chlorella vulgaris var.vulgaris f.tertia)、普通小球藻普通变种绿色变型(Chlorella vulgaris var.vulgaris f.viridis)、黄色小球藻(Chlorella xanthella)、左氏小球藻(Chlorellazofingiensis)、他伯氏小球藻(Chlorella trebouxioides)、普通小球藻、水溪绿球藻(Chlorococcuminfusionum)、绿球藻属(Chlorococcum sp.)、绿梭藻属(Chlorogonium)、蓝隐藻属(Chroomonas sp.)、金球藻属(Chrysosphaera sp.)、球I丐板藻属(Cricosphaera sp.)、隐藻属(Cryptomonas sp.)、隐蔽小环藻(Cyclotellacryptica)、梅尼小环藻(Cyclotella meneghiniana)、小环藻属(Cyclotellasp.)、杜氏藻属(Dunaliella sp.)、拜尔代维勒杜氏藻(Dunaliellabardawil)、双眼杜氏藻(Dunaliellabioculata)、颗粒状杜氏藻(Dunaliellagranulate)、海洋杜氏藻(Dunaliellamaritime)、微小杜氏藻(Dunaliellaminuta)、巴夫杜氏藻(Dunaliella parva)、比雷杜氏藻(Dunaliellapeircei)、普林莫杜氏藻(Dunaliella primolecta)、盐生杜氏藻(Dunaliellasalina)、陆生杜氏藻(Dunaliella terricola)、特氏杜氏藻(Dunaliellatertiolecta)、绿色杜氏藻(Dunaliella viridis)、特氏杜氏藻、绿色独球藻(Eremosphaera viridis)、独球藻属(Eremosphaera sp.)、捕圆藻属(Ellipsoidon sp.)、裸藻属(Euglena)、伏氏藻属(Franceia sp.)、克罗脆杆藻(Fragilaria crotonensis)、脆杆藻属(Fragilaria sp.)、粘球藻属(Gleocapsa sp.)、_丝藻属(Gloeothamnion sp.)、膜胞藻属(Hymenomonas sp.)、等鞭金藻球亲近种(Isochrysis aff.galbana)、球等鞭金藻(Isochrysis galbana)、鳞孔藻属(Lepocinclis)、微星藻属(Micractinium)、微星藻属(UTEX LB 2614)、微小单针藻(Monoraphidium minutum)、单针藻属(Monoraphidiumsp.)、微绿球藻属(Nannochloris sp.)、盐生微拟球藻(Nannochloropsis salina)、微拟球藻属(Nannochloropsis sp.)、适意舟形藻(Navicula acceptata)、毕氏舟形藻(Navicula biskanterae)、Navicula pseudotenelloides、薄膜舟形藻(Naviculapelliculosa)、嗜腐舟形藻(Navicula saprophila)、舟形藻属(Navicula sp.)、肾鞭藻属(Nephrochloris sp.)、肾藻属(Nephroselmis sp.)、普通菱形藻(Nitschiacommunis)、亚历山大菱形藻(Nitzschiaalexandrina)、普通菱形藻(Nitzschiacommunis)、分散菱形藻(Nitzschiadissipata)、碎片菱形藻(Nitzschia frustulum)、汉氏菱形藻(Nitzschiahantzschiana)、平庸菱形藻(Nitzschia inconspicua)、中型菱形藻(Nitzschia intermedia)、小头菱形藻(Nitzschia microcephala)、微小菱形藻(Nitzschia pusilla)、微小菱形藻捕圆变种(Nitzschia pusilla elliptica)、微小菱形藻莫纳变种(Nitzschia pusilla monoensis)、四边形菱形藻(Nitzschia quadrangular)、菱形藻属(Nitzschia sp.)、掠鞭藻属(Ochromonas sp.)、小卵胞藻(Oocystis parva)、极小卵胞藻(Oocystispusilla)、卵胞藻属(Oocystis sp.)、湖泊颤藻(OscillatoriaIimnetica)、颤藻属(Oscillatoria sp.)、亚短颤藻(Oscillatoria subbrevis)、嗜酸帕氏藻(Pascheria acidophila )、巴夫藻属(Pavlova sp.)、扁裸藻属(Phagus)、席藻属(Phormidium)、扁藻属(Platymonas sp.)、卡氏颗石藻(Pleurochrysiscarterae)、齿状颗石藻(Pleurochrysis dentate)、颗石藻属(Pleurochrysissp.)、威克海姆原藻(Prototheca wickerhamii)、雍滞原藻(Protothecastagnora)、波多黎各原藻(Prototheca portoricensis)、桑堪形原藻(Prototheca moriformis)、饶氏原藻(Prototheca zopfii)、塔胞藻属(Pyramimonas sp.)、桑椹藻属(Pyrobotrys)、囊状金藻(Sarcinoidchrysophyte)、被甲栅藻(Scenedesmus armatus)、水绵属(Spirogyra)、纯顶螺旋藻(Spirulina platensis)、裂丝藻属(Stichococcus sp.)、聚球藻属(Synechococcussp.)、四角藻属(Tetraedron)、四爿藻属(Tetraselmissp.)、司西四爿藻(Tetraselmissuecica)、威氏海链藻(Thalassiosiraweissflogii)以及 Viridiella fridericiana。在一些情况下，所述产油微生物细胞是原藻属的细胞。在一些情况下，所述产油微生物细胞是桑椹形原藻属的细胞。在一些情况下，所述产油微生物细胞是产油酵母细胞。在一些情况下，所述产油微生物细胞是产油细菌细胞。在一些情况下，天然存在的油是可可脂并且外源性基因包含红花(Carthamustinctorus)硫酯酶基因。在一些情况下，天然存在的油是椰子油。在一些情况下，天然存在的油是棕榈油并且外源性基因包含油棕(Elaeis guiniensis)硫酯酶基因、细叶萼距花硫酯酶基因、细叶萼距花KAS IV基因与赖特氏萼距花(Cuphea wrightii)FATB2基因的组合，或经过设计以破坏内源性KAS II基因的构建体。在一些情况下，天然存在的油是棕榈仁油并且外源性基因包含赖特氏萼距花FATB2基因与经过设计以破坏内源性SAD2B基因的构建体的组合。在一些情况下，天然存在的油是牛油树脂。在一些情况下，天然存在的油是牛脂。在一些情况下，天然存在的油是猪油，并且外源性基因包含加州月桂硫酯酶基因与经过设计以破坏内源性SAD2B基因的构建体的组合、山竹(Garcinia mangostana)硫酯酶基因与经过设计以破坏内源性SAD2B基因的构建体的组合、甘蓝型油菜(Brassica napus)硫酯酶基因，或细叶萼距花硫酯酶基因。在第十六方面， 本发明提供了一种产油微生物甘油三酯油类组合物，其中所述甘油三酯油类的脂肪酸型态选自由以下组成的组:C8:0占至少约1% ；C10:0占至少约1% ；C12:0占至少约1%；C14:0占至少约2%；C16:0占至少约30%；C18:0占至少约5%；C18:1占至少约60% ；C18:2占少于约7% ;以及饱和脂肪酸占至少约35%。在各种实施方案中，通过在培养基中培育产油微生物细胞或重组产油微生物细胞群体来制备甘油三酯油类组合物，其中产油微生物细胞如上文所述，尤其是上文关于本发明的第十五方面所述的那些细胞。在一些情况下，产油微生物甘油三酯油类组合物进一步包含选自由以下组成的组的属性:(i)少于0.3mcg/g的总类胡萝卜素；(ii)少于0.005mcg/g的番爺红素；(iii)少于0.005mcg/g的β -胡萝卜素；(iv)少于0.3mcg/g的叶绿素A ; (v)少于175mcg/g的Y-生育酚；(vi)少于0.25%的菜籽甾醇、菜油甾醇、豆甾醇或β-谷甾醇；(vii)少于350mcg/g的总生育三烯酌.； (viii)少于0.05mcg/g的叶黄素；或(ix)少于275mcg/g的生育酚。在第十七方面，本发明提供了一种制备产油微生物甘油三酯油类组合物的方法，所述组合物的脂肪酸型态选自由以下组成的组:C8:0占至少约1% ；C10:0占至少约1% ；C12:0占至少约1%；C14:0占至少约2%；C16:0占至少约30%；C18:0占至少约5%；C18:1占至少约60% ；C18:2占少于约7% ;以及饱和脂肪酸占至少约35%，其中所述方法包括以下步骤:(a)在培养基中培育产油微生物细胞的群体直到所述产油微生物细胞的细胞干重的至少10%是甘油三酯油类为止；以及(b)从产油微生物细胞中分离出甘油三酯油类组合物。在各种实施方案中，经由培育如上文所述的产油微生物细胞或重组产油微生物细胞(尤其是上文关于本发明的第十五方面所述的那些细胞)群体来制备甘油三酯油类组合物。在第十八方面，本发明提供了一种制备油基产品的方法，其中所述方法包括以下步骤:(a)对如上文关于本发明的第十六方面所述的产油微生物甘油三酯油类组合物进行选自由以下组成的组的至少一种化学反应:皂化；复分解；酸水解；碱水解；酶促水解；催化水解；热压水水解；催化水解反应，其中使脂质分解成甘油和脂肪酸；产生脂肪族氮化合物的胺化反应；产生一元酸和二元酸的臭氧分解反应；甘油三酯分解反应，选自由酶促分解和压力分解组成的组；水解反应之后进行缩合反应；加氢处理反应；加氢处理反应以及在加氢处理反应之前或同时进行脱氧反应或缩合反应；除气反应；脱氧反应，选自由氢解反应、氢化、连续氢化-氢解反应、连续氢解-氢化反应以及联合氢化-氢解反应组成的组；脱氧反应后进行缩合反应；酯化反应；酯交换反应；酯基转移反应；羟基化反应；以及羟基化反应后进行缩合反应；以及(b)将反应产物与其它组分分离。在一些情况下，所述油基产品选自由肥皂、燃料、介电液体、液压液、增塑剂、润滑齐U、传热流体以及金属加工液组成的组。在一些情况下，所述油基产品是选自由以下组成的组的燃料产品:(a)生物柴油；(b)可再生柴油；以及(C)喷气燃料。在一些情况下，所述燃料产品是具有一种或多种下列属性的生物柴油:(i)少于0.3mcg/g的总类胡萝卜素；(ii)少于0.005mcg/g的番爺红素；(iii)少于0.005mcg/g的β -胡萝卜素；(iv)少于0.3mcg/g的叶绿素A ； (V)少于175mcg/g的Y -生育酹；(vi)少于0.25%的菜籽甾醇、菜油甾醇、豆甾醇或β-谷甾醇；(vii)少于350mcg/g的总生育三烯酹；(viii)少于0.05mcg/g的叶黄素；或(ix)少于275mcg/g的生育酹。在一些情况下，燃料产品是T10-T90为至少20°C、40°C或60°C的可再生柴油。在一些情况下，燃料产品是符合HRJ-5和/或ASTM规范D1655的喷气燃料。本发明的这些以及其它方面和实施方案在附图(附图简述紧随其后)和以下的发明详述中得到描述并且示例于以下实施例中。上文以及整个本申请中所论述的任何或所有特征可以在本发明的各种实施方案中组合。附图简述
图1示出了由原藻甘油三酯油类生产的可再生柴油的色谱图。发明详述本发明因发现原藻和某些相关微生物出乎意料地具有可用于以低成本并且大量地生产油类、燃料以及其它烃类或脂质组合物的有利特性以及发现用于对这些微生物进行遗传学改变以改良这些特性的方法和试剂而产生。由这些微生物产生的油类可以被用于运输燃料、油脂化学品和/或食品和化妆品工业以及其它应用中。对脂质进行转酯基作用会产生可用作生物柴油的长链脂肪酸酯。其它酶促和化学方法可适合于产生脂肪酸、醛、醇、烷烃以及烯烃。在 一些应用中，生产可再生柴油、喷气燃料或其它烃类化合物。本发明还提供了培育微藻的方法，用以提高产量和提高脂质产率，和/或更具成本效益地生产本文所述的组合物。为了便于阅读，此发明详述被分为几个部分。第I部分提供了本文所用的术语的定义。第II部分描述了本发明方法中使用的培养条件。第III部分描述了遗传工程改造的方法和材料。第IV部分描述了对微生物(例如原藻)进行遗传工程改造以使其能够利用蔗糖。第V部分描述了对微生物(例如原藻)进行遗传工程改造以调节脂质生物合成。第VI部分描述了制备燃料和化学品的方法。第VII部分公开了本发明的实施例和实施方案。发明详述后面是说明本发明的各个方面和实施方案的实施例。1.定义除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的技术人员通常所了解的含义。下列参考文献为技术人员提供了本发明中使用的许多术语的一般定义:Singleton 等，Dictionaryof Microbiology and Molecular Biology (1994 年第 2 版)；The CambridgeDictionary of Science and Technology (Walker 编著，1988)；TheGlossary of Genetics,第 5 版，R.Rieger 等(编著)，Springer Verlag (1991);以及Hale 和 Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology (1991)。除非另有说明，否则本文所用的下列术语具有归属于它们的含义。“在微藻中具有活性”是指在微藻中具有功能的核酸。举例来说，已被用于驱动抗生素抗性基因赋予转基因微藻以抗生素抗性的启动子在微藻中具有活性。“酰基载体蛋白”或“ACP”是一种如下的蛋白质，所述蛋白质在脂肪酸合成期间在4/ -磷酸泛酰巯基乙胺部分的末端硫醇上与正在增长的酰基链以硫醇酯形式结合并且包含脂肪酸合酶复合物的组分。“酰基-辅酶A分子”或“酰基-辅酶A”是一种如下的分子，所述分子包含在辅酶A的4'-磷酸泛酰巯基乙胺部分的末端硫醇上经由硫醇酯键与辅酶A共价连接的酰基部分。“面积百分比”是指利用FAME GC/FID检测方法所观测到的峰面积，在所述检测方法中，在检测前将样品中的每个脂肪酸均转化成脂肪酸甲酯(FAME)。举例来说，与其它任何脂肪酸(如C14:l)相比，对于具有14个碳原子而无不饱和的脂肪酸(C14:0)观测到单独的峰。各类FAME的峰面积与它在混合物中所占的组成百分比是成正比的，并且是基于样品中存在的所有峰的总和来计算(即[特异峰的面积/所有测量到的峰的总面积]X 100)。当提及本发明的油类和细胞的脂质型态时，“C8-C14占至少4% ”意思是细胞中或所提取的甘油脂组合物中总脂肪酸的至少4%具有包括8个、10个、12个或14个碳原子的链长。“无菌的”是没有受到其它活有机体污染的有机体的培养物。“生物柴油”是利用生物学方法产生的脂肪酸烷基酯，它适于在柴油发动机中用作燃料。“生物质”是通过细胞生长和/或繁殖产生的物质。生物质可能含有细胞和/或细胞内内含物以及细胞外物质，包括但不限于由细胞分泌的化合物。“生物反应器”是一种当中任选地以悬浮液形式培养细胞的封闭罩或局部封闭罩。“催化剂”是一种试剂，如分子 或大分子复合物，它能够促成或促进使反应物形成产物的化学反应而不会成为产物的一部分。催化剂可提高反应速率，之后催化剂可能作用于另一反应物以形成产物。催化剂一般使反应所需的总活化能降低，以使反应更快地或在更低的温度下进行。因此，可能更快速地达到反应平衡。催化剂的实例包括酶，它是生物催化剂；热，它是非生物催化剂；以及用于石油提炼过程中的金属。“纤维素物质”是纤维素的消化产物，包括葡萄糖和木糖，以及任选地另外的化合物，如二糖、寡糖、木质素、糠醛以及其它化合物。纤维素物质的来源的非限制性实例包括甘蔗渣、甜菜废柏、玉米秸、木材碎片、锯末以及柳枝稷。“共培养”和其变体，如“共培育”和“共发酵”指的是在同一生物反应器中存在两种或更多种类型的细胞。两种或更多种类型的细胞可能均是微生物，如微藻，或可能是微藻细胞与不同的细胞类型一起培养。培养条件可以是促进两种或更多种类型的细胞生长和/或繁殖的条件，或是促成两种或更多种细胞中的一种或子集生长和/或繁殖，同时维持其余细胞生长的条件。“辅因子”是除底物以外的为酶发挥其酶活性所需的任何分子。“互补DNA”或“ cDNA”是mRNA的DNA拷贝，通常通过信使RNA (mRNA)的逆转录或扩增(例如经由聚合酶链式反应(“PCR”))获得。“培育”和其变体，如“培养”和“发酵”是指通过使用所选和/或控制的条件有意地促进一种或多种细胞生长(细胞大小、细胞内含物和/或细胞活性增加)和/或繁殖(经由有丝分裂使细胞数目增加)。生长与繁殖的组合可以被称作增殖。所选和/或控制的条件的实例包括利用限定性培养基(具有已知特征，如PH值、离子浓度以及碳源)、指定温度、氧压、二氧化碳水平以及在生物反应器中生长。培育并不指微生物在自然界中或者在无人为干预的情况下的生长或繁殖；例如，有机体自然生长而最终变成化石从而产生地质原油的过程并不是培育。“细胞溶解”是细胞在低渗环境中的溶解。细胞溶解是由过度渗透或水向细胞内侧运动(水分过多)引起。细胞不能承受内侧水的渗透压，且因此发生破裂。
“脱脂粉(Delipidated meal) ”和“脱脂的微生物生物质”是当中油类(包括脂质)已被提取或分离出以后的微生物生物质，所述提取或分离是经由使用机械方式(即通过压榨机实施)或溶剂提取法或同时使用这两种方式来实现的。与从微生物生物质中提取或分离油类/脂质之前相比，脱脂粉中的油类/脂质的量减少，但含有一些残留的油类/脂质。“表达载体”或“表达构建体”或“质粒”或“重组DNA构建体”是指经由人为干预(包括通过重组手段或直接化学合成)产生的核酸，其中一系列指定的核酸元件使得特定核酸能够在宿主细胞中转录和/或翻译。表达载体可以是质粒、病毒或核酸片段的一部分。表达载体通常包括有待转录的核酸，它与启动子可操作地连接。“外源性基因”是被引入(“转化”)到细胞中并且进行编码以使RNA和/或蛋白质表达的核酸。经过转化的细胞可以被称为重组细胞，其中可能引入有另外的外源性基因。相对于所转化的细胞，外源性基因可能来自于不同的物种(且因此是异源的)，或来自于相同的物种(且因此是同源的)。因此，外源性基因可以包括相对于基因的内源性拷贝占据细胞基因组中不同位置或处于不同控制下的同源基因。外源性基因在细胞中可以存在超过一个拷贝。外源性基因可以作为基因组中的插入物或作为游离型分子维持于细胞中。“外源性提供”是指向细胞培养物的培养基中提供的分子。“压榨”是从原材料(如大豆和油菜籽)中提取油类的一种机械方法。压榨机是一种螺旋型机器，它经由笼状桶样空腔压制材料。原材料进入压榨机的一侧，并且废滤饼从另一侧排出，而油类从罐笼的笼条之间漏出并且被收集。所述机器利用由螺杆驱动产生的摩擦力和持续压力来移动并且压缩原材料。油类通过不允许固体通过的小开口漏出。由于原材料受到压制，所以摩擦力通常使它变热。“脂肪酰基-ACP硫酯酶”是在脂质合成期间催化脂肪酸从酰基载体蛋白(ACP)上裂解的酶。“脂肪酰基-辅酶A/醛还原酶”是催化酰基-辅酶A分子还原成伯醇的酶。“脂肪酰基-辅酶A还原酶”是催化酰基-辅酶A分子还原成醛的酶。“脂肪醛脱羰基酶”是催化脂肪醛转化成烷烃的酶。
“脂肪醛还原酶”是催化醛还原成伯醇的酶。“固定碳源”是一种含碳分子，通常是有机分子，它在环境温度和压力下以固体或液体形式存在于培养基中并且可以由培养于培养基中的微生物所利用。“匀浆”是被物理破坏的生物质。“烃”是仅含有氢原子和碳原子的分子，其中碳原子共价连接形成与氢原子连接的直链、支链、环状或部分环状的主链。烃类化合物的分子结构从最简单的甲烷(CH4)(天然气的成分)形式到非常大并且非常复杂的结构(如在原油、石油以及浙青中发现的一些分子，如浙青质)不等。烃可以呈气态、液态或固态形式，或这些形式的任何组合，并且在主链中相邻的碳原子之间可具有一个或多个双键或三键。因此，所述术语包括直链、支链、环状或部分环状的烷烃、烯烃、脂质以及石蜡。实例包括丙烷、丁烷、戊烷、己烷、辛烷以及角鲨烯。“氢:碳比”是分子中以各原子为基础的氢原子与碳原子的比率。所述比率可以被用于指烃分子中碳原子和氢原子的数目。举例来说，具有最高比率的烃是甲烷CH4(4: I)。“疏水性组分”是物质中在疏水相中的可溶性比在水相中高的部分或组分。疏水性组分大致上不溶于水并且通常具非极性。“脂质产率增加”是指微生物培养物的产量增加，例如通过增加每升培养物的细胞干重、增加形成脂质的细胞的百分比或增加每单位时间每升培养物体积的脂质总量。“诱导型启动子”是回应于特定的刺激物而介导可操作连接的基因进行转录的启动子。所述启动子的实例可能是在改变PH值或氮水平的条件下所诱导的启动子序列。“可操作连接”是两个核酸序列之间的功能性连接，所述核酸序列如控制序列(通常是启动子)和所连接序列(通常是编码蛋白质的序列，也被称为编码序列)。如果启动子可以介导外源性基因转录，那么所述启动子与所述外源性基因是可操作连接的。“原位”意思是“在适当位置上”或“在其原始位置上”。“营养素的限制性浓度”是培养物中的化合物限制所培养的有机体繁殖的浓度。“营养素的非限制性浓度”是在给定的培养时间内支持最大程度繁殖的浓度。因此，在限制性浓度的营养素存在下在给定的培养时间内产生的细胞数低于在所述营养素不具限制性时的细胞数。当存在的营养素的浓度大于支持最大程度繁殖的浓度时，所述营养素被称为在培养物中“过量”。“脂酶”是一种水溶性酶，它催化不溶于水的脂质底物的酯键水解。脂酶催化脂质水解成甘油和脂肪酸。“脂质修饰酶”是指一种改变脂质共价结构的酶。脂质修饰酶的实例包括脂酶、月旨肪酰基-ACP硫酯酶、脂肪酰基-辅酶A/醛还原酶、脂肪酰基-辅酶A还原酶、脂肪醛还原酶、去饱和酶(包括硬脂酰基酰基载体蛋白去饱和酶(SAD)和脂肪酰基去饱和酶(FAD))以及脂肪醛脱羰基酶。“脂质通路酶”是在脂质代谢(即脂质合成、修饰或降解)中发挥作用的任何酶，以及对脂质进行化学修饰的任何蛋白质以及载体蛋白。“脂质”是可溶于非极性溶剂(如乙醚和氯仿)中并且相对或完全不溶于水的一类分子。脂质分子因它们大部分由在性质上具疏水性的长烃尾组成而具有这些特性。脂质的实例包括脂肪酸(饱和和不饱和)；甘油酯或甘油脂(如甘油单酯、甘油二酯、甘油三酯或中性脂肪，以及磷酸甘油酯或甘油磷脂)；非甘油酯(鞘脂类、留醇脂质(包括胆留醇和甾类激素)、异戊烯醇脂质(包括萜类)、脂肪醇、蜡以及聚酮化合物)；以及复合脂质衍生物(连接糖的脂质，或糖脂，以及连接蛋白的脂质)。“脂肪”是脂质的亚群，被称为“三酰基甘油酯”。“溶胞物”是含有溶解的细胞的内含物的溶液。“溶解”是生物有机体的质膜以及任选地细胞壁发生破裂而足以释放至少某些细胞内内含物，这常通过机械、病毒或渗透机制损伤其完整性来实现。“溶解”是生物有机体或细胞的细胞膜以及任选地细胞壁遭到破坏而足以释放至少某些细胞内内含物。“微藻”是含有叶绿体或质体并且任选地能够进行光合作用的真核微生物有机体，或是能够进行光合作用的原核微生物有机体。微藻包括不能代谢固定碳源作为能量的专性光能自养生物以及完全依靠固定碳源生存的异养生物。微藻包括细胞分裂后即刻与姐妹细胞分离的单细胞有机体(如衣藻属(Chlamydomonas)),以及如团藻属(Volvox,其是两种不同细胞类型的简单多细胞光合微生物)的微生物。微藻包括如小球藻、杜氏藻以及原藻的细胞。微藻还包括展现细胞间粘附作用的其它微生物光合有机体，如阿格藻属、项圈藻属以及桑椹藻属。微藻还包括丧失进行光合作用的能力的专性异养微生物，如某些双鞭甲藻藻类物种以及原藻属的物种。“微生物(microorganism) ”和“微生物(microbe) ”是微观的单细胞有机体。关于两种蛋白质或基因的“天然共表达”意思是例如因为编码这两种蛋白质的基因处于共同调节序列的控制下或因为它们回应于相同刺激物而表达，所以所述蛋白质或它们的基因天然共表达于产生它们的组织或有机体中。“渗透压休克”是渗透压突然降低后溶液中的细胞破裂。有时会诱导渗透压休克以使所述细胞的细胞组分释放到溶液中。“多糖降解酶”是能够催化任何多糖水解或糖化的任何酶。举例来说，纤维素酶催化纤维素水解。“多糖”或“聚糖”是由通过糖苷键连接到一起的单糖组成的碳水化合物。纤维素是构成某些植物细胞壁的多糖。可以通过酶使纤维素解聚，产生单糖(如木糖和葡萄糖)以及较大的二糖和寡糖。“启动子”是引导核酸转录的核酸控制序列。本文所用的启动子包括转录起始位点附近的必需核酸序列，如在II型聚 合酶启动子的情况下,是TATA元件。启动子还任选地包括末端增强子或阻遏子元件，它们可以位于与转录起始位点相距多达数千个碱基对的位置上。
“重组”是细胞、核酸、蛋白质或载体因引入有外源性核酸或原生核酸发生改变而得到修饰。因此，例如重组细胞表达细胞原生(非重组)形式中不存在的基因或表达与由非重组细胞表达的那些基因不同的原生基因。“重组核酸”是一般通过对核酸进行操作(例如使用聚合酶和核酸内切酶)而最初于体外形成的核酸，或以其它方式呈自然界中通常不存在的形式的核酸。可以产生重组核酸，例如以使两个或更多个核酸可操作连接。因此，为了实现本发明的目的，通过接合在自然界中通常不会连接的DNA分子而在体外形成的分离的核酸或表达载体均被认为是重组的。在重组核酸被制备并且引入到宿主细胞或有机体中后，它可以使用宿主细胞的体内细胞机构进行复制；然而，所述核酸在重组产生后虽然随后在细胞内进行复制，但为了实现本发明的目的仍然被认为是重组的。同样，“重组蛋白”是使用重组技术，即通过使重组核酸表达而制备的蛋白质。“可再生柴油”是经由使脂质进行氢化和脱氧而产生的烷烃(如C10:0、C12:0、C14:0、C16:0以及C18:0)的混合物。“糖化”是使生物质(通常是纤维素或木质纤维生物质)转化成单体糖(如葡萄糖和木糖)的过程。“经过糖化的”或“经过解聚的”纤维素物质或生物质是指已经由糖化作用而转化成单体糖的纤维素物质或生物质。术语“相似”在被用于与天然存在的油类进行比较而没有进一步限定的情况下时意指与天然存在的油类相比较的油类所含的最高两种甘油三酯与天然存在的油类相差约+/-15%或+/-10%。举例来说，牛油树脂(牛油树(B.Parkii)的油类)含有41.2%-56.8%的C18:0和34.0 % -46.9 %的C18:1作为两种最常见的甘油三酯组分(参见表5)。在相差+/-10%以内“相似的”油类应含有约37%至约62%的C18:0和31%至约52%的C18:l作为两种最常见的甘油三酯组分。当被用于这种情况下时，术语“相似”包括相差+/_9%、+/~8 %、+/~7 %、+/-6 %、+/~5 %、+/-4 %、+/~3 %、+/~2 % 或十 /_1 *%，并且可以进一步表不与天然存在的油类的最闻二种或最闻四种甘油二酷，或最闻二种甘油二酷中的两种，或最高四种甘油三酯中的三种进行比较。“声波处 理”是利用声波能量破坏生物材料(如细胞)的过程。“糠醛物质”是保持相同的基本结构特征的2-呋喃甲醛或衍生物。“秸杆”是收获谷物后残留的作物的干燥茎和叶。“蔗糖利用基因”是当表达时帮助细胞能够利用蔗糖作为能量来源的基因。本文由蔗糖利用基因编码的蛋白质被称为“蔗糖利用酶”，并且包括蔗糖转运蛋白、蔗糖转化酶以及己糖激酶(如葡萄糖激酶和果糖激酶)。I1.培育本发明大体涉及培育微生物(例如微藻、产油酵母、真菌以及细菌)，尤其是重组微藻藻株，包括原藻属藻株以生产脂质。为了方便阅读，本部分再分成几个小部分。第I小部分描述了原藻属物种和藻株以及如何通过基因组DNA比较来鉴定新型原藻属物种和藻株以及相关微藻以及其它微生物。第2小部分描述了适用于进行培育的生物反应器。第3小部分描述了用于培育的培养基。第4小部分描述了根据本发明的说明性培育法生产油类。这些描述内容也一般适用于其它微生物。1.原藻属物种和藻株以及其它微生物原藻是用于生产脂质的引人注目的微生物，这是因为它可以产生高水平的脂质，特别是适用于生产燃料的脂质。与由其它微藻产生的脂质相比，由原藻产生的脂质具有链长较短并且饱和度较高的烃链。此外，原藻脂质一般不含色素(叶绿素和某些类胡萝卜素的水平低到不可检测出)，而且在任何情况下，所含的色素比来自其它微藻的脂质少得多。此外，相对于从其它微生物生产脂质，由本发明提供的重组原藻细胞可被用于以较高产率和效率并且以降低的成本生产脂质。用于本发明方法中的说明性原藻属藻株包括另外，这种微藻以异养方式生长并且可以经过遗传工程改造成威克海姆原藻、雍滞原藻(包括UTEX327)、波多黎各原藻、桑椹形原藻(包括UTEX藻株1441、1435)以及饶氏原藻。原藻属的物种是专性异养生物。可以通过扩增基因组的某些目标区来鉴定用于本发明中的原藻属物种。举例来说，可以经由使用引物以及使用基因组任何区域的方法(例如使用Wu等，Bot.Bull.Acad.Sin.(2001)42 =115-121中描述的方法)对核和/或叶绿体DNA进行扩增和测序来鉴定特定的原藻属物种或藻株。使用核糖体DNA序列来鉴定小球藻属的分离株。本领域技术人员可使用公认的种系发生学分析方法，如对核糖体内转录间隔区(ITS1和ITS2rDNA)、23SrRNAUSS rRNA以及其它保守的基因组区域进行扩增和测序，从而不仅可以鉴定原藻属的物种，还可以鉴定具有相似脂质型态和生产能力的其它烃和脂质产生有机体。关于对藻类进行鉴定和分类的方法的实例还参见例如Genetics，2005年8月；170 (4): 1601-10和RNA，2005 年 4 月；11(4):361-4。因此，可以利用基因组DNA比较来鉴定用于本发明中的合适的微藻物种。可以从微藻物种扩增保守的基因组DNA区域(诸如但不限于编码23S rRNA的DNA)，并且与共有序列相比较，以筛选与用于本发明中的优选微藻在分类学上相关的微藻物种。对于原藻属内的物种进行的所述DNA序列比较的实例展示于下文中。基因组DNA比较还可以用于鉴定藻株保藏中心错误鉴定的微藻物种。藻株保藏中心常常基于表型特征和形态特征鉴定微藻物种。使用这些特征可能会导致对微藻物种或微藻属进行错误分类。使用基因组DNA比较是基于种系发生学关系对微藻物种进行分类的较好方法。用于本发明中的微藻通常具有编码23S rRNA并且与SEQ ID NO:11-19中所列的至少一个序列具有至少99%、至少95%、至少90%或至少85%核苷酸一致性的基因组DNA序列。 对于进行序列比较来测定核苷酸或氨基酸一致性百分比，通常一个序列用作参照序列，将测试序列与其进行比较。当使用序列比较算法时，将测试序列和参照序列输入计算机中，必要时指定子序列坐标，并且指定序列算法的程序参数。序列比较算法然后基于指定的程序参数计算测试序列相对于参照序列的序列一致性百分比。可以例如通过局部同源性算法(Smith和Waterman, Adv.App1.Math.2:482(1981))、同源性比对算法(Needleman 和 Wunsch，J.Mol.Biol.48:443 (1970))、相似性搜索方法(Pearson 和 Lipman, Proc.Nat' 1.Acad.Sc1.USA 85:2444 (1988))、计算机实现这些算法(WisconsinGenetics 软件包，Genetics Computer Group, 575 Science Dr.,Madison, WI 中的 GAP、BESTFIT、FASTA 以及 TFASTA)或通过目测检查(一般参见 Ausubel等(同上))来对序列进行最佳比对以进行比较。适用于测定序列一致性百分比和序列相似性百分比的另一种实例算法是BLAST算法，描述于 Altschul 等，J.Mol.Biol.215:403-410(1990)中。用于进行 BLAST 分析的软件可以经由美国国家生物技术信息中心(National Center for BiotechnologyInformation)(网址是www.ncb1.nlm.nih.gov)公开获得。这种算法包括首先通过鉴定查询序列中长度为W的短字来鉴定高得分序列对(HSP)，所述短字在与数据库序列中具有相同长度的字比对时匹配或满足某个正值临限分数T。T被称为相邻字分数临限值(Altschul等(同上))。这些初始相邻字命中用作种子启动搜索，以寻找含有它们的较长HSP。所述字命中然后沿着各序列在两个方向上延伸，直到能够增加累积比对分数为止。对于核苷酸序列，使用参数M( —对匹配残基的奖励分数；始终> O)和N(错配残基的罚分；始终< O)计算累积分数。对于氨基酸序列，使用计分矩阵计算累积分数。各个方向上字命中的延伸在下列情况时停止:累积比对分数相对于其所达到的最大值减少了量X ;由于一个或多个残基比对负值的累积而使累积分数降至O或以下；或到达任一序列的末端。对于鉴定核酸或多肽是否在本发明的范围内，BLAST程序的预设参数是合适的。BLASTN程序(对于核苷酸序列)使用的预设值是字长(W)为11，期望值(E)为10，M = 5,N = -4以及对两条链进行比较。对于氨基酸序列，BLASTP程序使用的预设值是字长(W)为3，期望值(E)为10以及BL0SUM62计分矩阵。TBLATN程序(对于核苷酸序列，使用蛋白质序列)使用的预设值是字长(W)为3，期望值(E)为10以及BLOSUM 62计分矩阵(参见Henikoff和Henikoff，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 89: 10915 (1989))。除了计算序列一致性百分比以外，BLAST算法还对两个序列之间的相似性进行统计分析(参见例如 Karlin 和 Altschul, Proc.Nat ' 1.Acad.Sc1.USA 90:5873-5787 (1993))。由BLAST算法提供的一种相似性量度是最小概率总和(P (N))，指示两个核苷酸或氨基酸序列之间偶然存在匹配的概率。举例来说，如果将测试核酸与参照核酸比较时最小概率总和小于约0.1，更优选地小于约0.01，并且最优选地小于约0.001，那么所述核酸被认为与参照序列相似。除了生产合适的脂质或烃以生产油类、燃料以及油脂化学品之外，影响对用于本发明中的微生物进行选择的其它考虑因素还包括:(1)脂质含量高(占细胞重量的百分比)；(2)易于生长；(3)易于进行遗传工程改造；以及(4)易于对生物质进行加工。在具体实施方案中，野生型或经过遗 传工程改造的微生物产生具有至少40 %、至少45 %、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%或至少70%或更多的脂质的细胞。优选的有机体以异养方式生长(利用糖在避光条件下生长)。可用于实行本发明的藻类的实例包括但不限于表I中所列的下列藻类。表1.藻类的实例。
权利要求
1.一种包含甘油三酯油类的产油微生物细胞，其中所述甘油三酯油类的脂肪酸型态选自由以下组成的组:C8:0占至少约1%;C10:0占至少约1%;C12:0占至少约1%;C14:0占至少约2% ；C16:0占至少约30% ；C18:0占至少约5% ；C18:1占至少约60% ；C18:2占少于约7% ;以及饱和脂肪酸占至少约35%。
2.按权利要求1所述的产油微生物细胞，其中所述产油微生物细胞包含外源性基因，并且其中所述产油微生物细胞的内源性去饱和酶任选地已失活或突变而具有较小的酶活性。
3.按权利要求2所述的产油微生物细胞，其中所述甘油三酯油类的脂肪酸型态类似于天然存在的油类的甘油三酯油类型态。
4.按权利要求3所述的产油微生物细胞，其中所述天然存在的油类选自由可可脂、椰子油、棕榈油、棕榈仁油、牛油树脂、牛脂以及猪油组成的组。
5.按权利要求2所述的产油微生物细胞，其中所述甘油三酯油类的脂肪酸型态包含选自由以下组成的组的型态:C8:0与C10:0的组合总量是至少约10%;C10:0、C12:0与C14:0的组合总量是至少约50% ;C16:0、C18:0与C18:l的组合总量是至少约60% ;C18:0、C18:1与C18:2的组合总量是至少约60% ;C14:0、C16:0、C18:0与C18:l的组合总量是至少约60% ;以及C18:l与C18:2的组合总量少于约30%。
6.按权利要求1所述的产油微生物细胞，其中所述甘油三酯油类的脂肪酸型态包含选自由以下组成的组的脂肪酸比率:C8:0与C10:0的比率是至少约5: I ;C10:0与C12:0的比率是至少约6: I ;C12:0与C14:0的比率是至少约5: I ;C14:0与C12:0的比率是至少约7: I ;以及C14:0与C16:0的比率是至少约1: 2。
7.按权利要求2所述的产油微生物细胞，其中所述内源性去饱和酶选自由硬脂酰基ACP去饱和酶和δ -12脂肪酸去饱和酶组成的组。
8.按权利要求7所述的产油微生物细胞，其中所述外源性基因选自由编码酰基-ACP硫酯酶的基因组成的组。
9.按权利要求8所述的产油微生物细胞，其中所述外源性基因编码酰基-ACP硫酯酶，所述酰基-ACP硫酯酶选自由以下组成的组:加州月桂脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号AAC49001);樟树脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号Q39473);加州月桂脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号Q41635);肉豆蘧脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号ΑΑΒ71729);肉豆蘧脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号ΑΑΒ71730);油棕脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号ABD83939);油棕脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号AAD42220);毛白杨脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号ABC47311);拟南芥脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号ΝΡ_172327)；拟南芥脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号CAA85387);拟南芥脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号CAA85388);陆地棉脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号Q9SQI3);披针叶萼距花脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号CAA54060);细叶萼距花脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号AAC72882);美叶萼距花脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号ΑΒΒ71581);披针叶萼距花脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号CAC19933);油棕脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号AAL15645);细叶萼距花脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号Q39513);陆地棉脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号AAD01982);葡萄脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号CAN81819);山竹脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号ΑΑΒ51525);芥菜脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号ABI18986);长叶马府油树脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号AAX51637);甘蓝型油菜脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号ABH11710);稻(籼稻栽培种)脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号EAY86877);稻(粳稻栽培种)脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号ΝΡ_001068400);稻(籼稻栽培种)脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号EAY99617);细叶萼距花脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号AAC49269);美国榆脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号AAB71731);披针叶萼距花脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号CAB60830);湿地萼距花脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号AAC49180);德国鸢尾脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号AAG43858);德国鸢尾脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号AAG43858.1);湿地萼距花脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号AAC49179);肉豆蘧脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号AAB71729);肉豆蘧脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号AAB717291.1);细叶萼距花脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号U39834);加州月桂脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号M94159);樟树脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号U31813);赖特氏萼距花脂肪酰基-ACOP硫酯酶(基因库编号U56103);以及普通种蓖麻脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号 ABS30422)。
10.按权利要求2所述的产油微生物细胞，其中所述产油微生物细胞进一步包含编码蔗糖转化酶的基因。
11.按权利要求2所述的产油微生物细胞，其中所述产油微生物细胞是选自以下的微藻属或物种的细胞:东方曲壳藻、阿格藻属、透明苗形藻、咖啡形双眉藻、咖啡形双眉藻线形变种、咖啡形双眉藻点纹变种、咖啡形双眉藻泰勒氏变种、咖啡形双眉藻小型变种、优美双眉藻、优美双眉藻头状变种、双眉藻属、项圈`藻属、纤维藻属、镰形纤维藻、黄金色藻、波氏藻属、布朗葡萄藻、苏台德克斯葡萄藻、卡特藻属、纤细角毛藻、牟氏角毛藻、牟氏角毛藻广盐变种、角毛藻属、无硝小球藻、南极小球藻、金绿小球藻、卡氏小球藻、包囊小球藻、脱水小球藻、椭圆形小球藻、浮水小球藻、淡褐小球藻、淡褐小球藻空腔变种、谷氏小球藻、水溪小球藻、水溪小球藻栖海岸变种、水溪小球藻增大变种、凯氏小球藻、匍扇小球藻(藻株SAG 37.88)、黄绿小球藻、黄绿小球藻金绿变种、黄绿小球藻淡黄变种、红藻小球藻、极微小球藻、突变小球藻、夜间小球藻、巴夫氏小球藻、嗜光小球藻、普氏小球藻、原始小球藻(包括 UTEX 藻株 1806、411、264、256、255、250、249、31、29、25 以及 CCAP 藻株 211/17 和211/8d中的任一种)、原始小球藻耐酸变种、规则小球藻、规则小球藻小型变种、规则小球藻伞状变种、瑞氏小球藻、嗜糖小球藻、嗜糖小球藻椭圆形变种、盐生小球藻、简单小球藻、耐热性小球藻、小球藻属、球形小球藻、斯蒂格小球藻、万尼氏小球藻、普通小球藻、普通小球藻、普通小球藻粗皮变型、普通小球藻自养变种、普通小球藻绿色变种、普通小球藻普通变种、普通小球藻普通变种粗皮变型、普通小球藻普通变种绿色变型、黄色小球藻、左氏小球藻、他伯氏小球藻、普通小球藻、水溪绿球藻、绿球藻属、绿梭藻属、蓝隐藻属、金球藻属、球隹丐板藻属、隐藻属、隐蔽小环藻、梅尼小环藻、小环藻属、杜氏藻属、拜尔代维勒杜氏藻、双眼杜氏藻、颗粒状杜氏藻、海洋杜氏藻、微小杜氏藻、巴夫杜氏藻、比雷杜氏藻、普林莫杜氏藻、盐生杜氏藻、陆生杜氏藻、特氏杜氏藻、绿色杜氏藻、特氏杜氏藻、绿色独球藻、独球藻属、椭圆藻属、裸藻属、伏氏藻属、克罗脆杆藻、脆杆藻属、粘球藻属、M丝藻属、膜胞藻属、等鞭金藻球亲近种、球等鞭金藻、鳞孔藻属、微星藻属、微星藻属(UTEX LB 2614)、微小单针藻、单针藻属、微绿球藻属、盐生微拟球藻、微拟球藻属、适意舟形藻、毕氏舟形藻、Naviculapseudotenelloides、薄膜舟形藻、嗜腐舟形藻、舟形藻属、肾鞭藻属、肾藻属、普通菱形藻、亚历山大菱形藻、普通菱形藻、分散菱形藻、碎片菱形藻、汉氏菱形藻、平庸菱形藻、中型菱形藻、小头菱形藻、微小菱形藻、微小菱形藻椭圆变种、微小菱形藻莫纳变种、四边形菱形藻、菱形藻属、棕鞭藻属、小卵胞藻、极小卵胞藻、卵胞藻属、湖泊颤藻、颤藻属、亚短颤藻、嗜酸帕氏藻、巴夫藻属、扁裸藻属、席藻属、扁藻属、卡氏颗石藻、齿状颗石藻、颗石藻属、威克海姆原藻、雍滞原藻、波多黎各原藻、桑椹形原藻、饶氏原藻、塔胞藻属、桑椹藻属、囊状金藻、被甲栅藻、水绵属、钝顶螺旋藻、裂丝藻属、聚球藻属、四角藻属、四月藻属、司西四月藻、威氏海链藻以及 Viridiella fridericiana。
12.按权利要求11所述的产油微生物细胞，其中所述产油微生物细胞是所述原藻属的细胞。
13.按权利要求12所述的产油微生物细胞，其中所述产油微生物细胞是所述桑椹形原藻属的细胞。
14.按权利要求2所述的产油微生物细胞，其中所述产油微生物细胞是产油酵母细胞。
15.按权利要求2所述的产油微生物细胞，其中所述产油微生物细胞是产油细菌细胞。
16.按权利要求4所述的产油微生物细胞，其中所述天然存在的油类是可可脂，并且其中所述外源性基因包含红花硫酯酶基因。
17.按权利要求4所述的产油微生物细胞，其中所述天然存在的油类是椰子油。
18.按权利要求4所述的产油微生物细胞`，其中所述天然存在的油类是棕榈油，并且其中所述外源性基因包含油棕硫酯酶基因、细叶萼距花硫酯酶基因、细叶萼距花KAS IV基因与赖特氏萼距花FATB2基因的组合，或经过设计以破坏内源性KAS II基因的构建体。
19.按权利要求4所述的产油微生物细胞，其中所述天然存在的油类是棕榈仁油，并且其中所述外源性基因包含赖特氏萼距花FATB2基因与经过设计以破坏内源性SAD2B基因的构建体的组合。
20.按权利要求4所述的产油微生物细胞，其中所述天然存在的油类是牛油树脂。
21.按权利要求4所述的产油微生物细胞，其中所述天然存在的油类是牛脂。
22.按权利要求4所述的产油微生物细胞，其中所述天然存在的油类是猪油，并且其中所述外源性基因包含加州月桂硫酯酶基因与经过设计以破坏内源性SAD2B基因的构建体的组合、山竹硫酯酶基因与经过设计以破坏内源性SAD2B基因的构建体的组合、甘蓝型油菜硫酯酶基因，或细叶萼距花硫酯酶基因。
23.一种产油微生物甘油三酯油类组合物，其中所述甘油三酯油类的脂肪酸型态选自由以下组成的组:C8:0占至少约1%;C10:0占至少约1%;C12:0占至少约1%;C14:0占至少约2% ；C16:0占至少约30% ；C18:0占至少约5% ；C18:1占至少约60% ；C18:2占少于约7% ;以及饱和脂肪酸占至少约35%。
24.按权利要求23所述的产油微生物甘油三酯油类组合物，所述组合物是通过在培养基中培育重组产油微生物细胞群体所产生，其中所述产油微生物细胞包含外源性基因，并且其中所述产油微生物细胞的内源性去饱和酶任选地已失活或突变而具有较小的酶活性。
25.按权利要求24所述的产油微生物甘油三酯油类组合物，其中所述甘油三酯油类的脂肪酸型态类似于天然存在的油类的甘油三酯油类型态。
26.按权利要求25所述的产油微生物甘油三酯油类组合物，其中所述天然存在的油类选自由可可脂、椰子油、棕榈油、棕榈仁油、牛油树脂、牛脂以及猪油组成的组。
27.按权利要求24所述的产油微生物甘油三酯油类组合物，其中所述甘油三酯油类的脂肪酸型态包含如下的型态，在所述型态中ClO:O、C12:0与C14:0的组合总量是至少约50% ;C16:0、C18:0与C18:l的组合总量是至少约60% ;C18:0、C18:1与C18:2的组合总量是至少约60% ;C14:0、C16:0、C18:0与C18:l的组合总量是至少约60% ;C8:0与C10:0的组合总量少于约50%。
28.按权利要求24所述的产油微生物甘油三酯油类组合物，其中所述甘油三酯油类的脂肪酸型态包含选自由以下组成的组的脂肪酸比率:C8:0与C10:0的比率是至少约5: I ；C10:0与C12:0的比率是至少约6:1 ;C12:0与C14:0的比率是至少约5: I ;C14:0与C12:0的比率是至少约7: 1;C14:0与C16:0的比率是至少约1: 2。
29.按权利要求24所述的产油微生物甘油三酯油类组合物，所述组合物是通过在培养基中培育重组产油微生物细胞群体所产生，其中所述内源性去饱和酶选自由硬脂酰基ACP去饱和酶和δ-12脂肪酸去饱和酶组成的组。
30.按权利要求29所述的产油微生物甘油三酯油类组合物，所述组合物是通过在培养基中培育重组产油微生物细胞群体所产生，其中所述产油微生物细胞包含编码酰基-ACP硫酯酶的外源性基因。
31.按权利要求30所述的产油微生物甘油三酯油类组合物，所述组合物是通过在培养基中培育重组产油微生物细胞群体所产生，其中所述产油微生物细胞包含编码酰基-ACP硫酯酶的外源性基因，所述酰基-ACP硫酯酶选自由以下组成的组:加州月桂脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号AAC49001);樟树脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号Q39473);加州月桂脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号Q41635);肉豆蘧脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号ΑΑΒ71729);肉豆蘧脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号ΑΑΒ71730);油棕脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号ABD83939);油棕脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号AAD42220);毛白杨脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号ABC47311);拟南芥脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号ΝΡ_172327);拟南芥脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号CAA85387);拟南芥脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号CAA85388);陆地棉脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号Q9SQI3);披针叶萼距花脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号CAA54060);细叶萼距花脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号AAC72882);美叶萼距花脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号ΑΒΒ71581)；披针叶萼距花脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号CAC19933);油棕脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号AAL15645);细叶萼距花脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号Q39513);陆地棉脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号AAD01982);葡萄脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号CAN81819);山竹脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号ΑΑΒ51525);芥菜脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号ΑΒΙ18986);长叶马府油树脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号ΑΑΧ51637);甘蓝型油菜脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号ΑΒΗ11710);稻(籼稻栽培种)脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号ΕΑΥ86877);稻(粳稻栽培种)脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号ΝΡ_001068400);稻(籼稻栽培种)脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号ΕΑΥ99617);细叶萼距花脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号AAC49269);美国榆脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号ΑΑΒ71731);披针叶萼距花脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号CAB60830);湿地萼距花脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号AAC49180);德国鸢尾脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号AAG43858);德国鸢尾脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号AAG43858.1);湿地萼距花脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号AAC49179);肉豆蘧脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号AAB71729);肉豆蘧脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号AAB717291.1);细叶萼距花脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号U39834);加州月桂脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号M94159);樟树脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号U31813);赖特氏萼距花脂肪酰基-ACOP硫酯酶(基因库编号U56103);以及普通种蓖麻脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号 ABS30422)。
32.按权利要求31所述的产油微生物甘油三酯油类组合物，所述组合物是通过在培养基中培育重组产油微生物细胞群体所产生，其中所述产油微生物细胞进一步包含编码蔗糖转化酶的基因。
33.按权利要求32所述的产油微生物甘油三酯油类组合物，所述组合物是通过在培养基中培育重组产油微生物细胞群体所产生，其中所述产油微生物细胞是选自以下的微藻属或物种的细胞:东方曲壳藻、阿格藻属、透明苗形藻、咖啡形双眉藻、咖啡形双眉藻线形变种、咖啡形双眉藻点纹变种、咖啡形双眉藻泰勒氏变种、咖啡形双眉藻小型变种、优美双眉藻、优美双眉藻头状变种、双眉藻属、项圈藻属、纤维藻属、镰形纤维藻、黄金色藻、波氏藻属、布朗葡萄藻、苏台德克斯葡萄藻、卡特藻属、纤细角毛藻、牟氏角毛藻、牟氏角毛藻广盐变种、角毛藻属、无硝小球藻、南极小球藻、金绿小球藻、卡氏小球藻、包囊小球藻、脱水小球藻、椭圆形小球藻、浮水小球藻、淡褐小球藻、淡褐小球藻空腔变种、谷氏小球藻、水溪小球藻、水溪小球藻栖海岸变种、水溪小球藻增大变种、凯氏小球藻、匍扇小球藻(藻株SAG 37.88)、黄绿小球藻、黄绿小球藻金绿变种、黄绿小球藻淡黄变种、红藻小球藻、极微小球藻、突变小球藻、夜间小球藻、巴夫氏小球藻、嗜光小球藻、普氏小球藻、原始小球藻(包括 UTEX 藻株 1806、411、264、256、255、250、249、31、29、25 以及 CCAP 藻株 211/17 和211/8d中的任一种)、原始小球藻耐酸变种、`规则小球藻、规则小球藻小型变种、规则小球藻伞状变种、瑞氏小球藻、嗜糖小球藻、嗜糖小球藻椭圆形变种、盐生小球藻、简单小球藻、耐热性小球藻、小球藻属、球形小球藻、斯蒂格小球藻、万尼氏小球藻、普通小球藻、普通小球藻、普通小球藻粗皮变型、普通小球藻自养变种、普通小球藻绿色变种、普通小球藻普通变种、普通小球藻普通变种粗皮变型、普通小球藻普通变种绿色变型、黄色小球藻、左氏小球藻、他伯氏小球藻、普通小球藻、水溪绿球藻、绿球藻属、绿梭藻属、蓝隐藻属、金球藻属、球隹丐板藻属、隐藻属、隐蔽小环藻、梅尼小环藻、小环藻属、杜氏藻属、拜尔代维勒杜氏藻、双眼杜氏藻、颗粒状杜氏藻、海洋杜氏藻、微小杜氏藻、巴夫杜氏藻、比雷杜氏藻、普林莫杜氏藻、盐生杜氏藻、陆生杜氏藻、特氏杜氏藻、绿色杜氏藻、特氏杜氏藻、绿色独球藻、独球藻属、椭圆藻属、裸藻属、伏氏藻属、克罗脆杆藻、脆杆藻属、粘球藻属、I 丝藻属、膜胞藻属、等鞭金藻球亲近种、球等鞭金藻、鳞孔藻属、微星藻属、微星藻属(UTEXLB 2614)、微小单针藻、单针藻属、微绿球藻属、盐生微拟球藻、微拟球藻属、适意舟形藻、毕氏舟形藻、Naviculapseudotenelloides、薄膜舟形藻、嗜腐舟形藻、舟形藻属、肾鞭藻属、肾藻属、普通菱形藻、亚历山大菱形藻、普通菱形藻、分散菱形藻、碎片菱形藻、汉氏菱形藻、平庸菱形藻、中型菱形藻、小头菱形藻、微小菱形藻、微小菱形藻椭圆变种、微小菱形藻莫纳变种、四边形菱形藻、菱形藻属、棕鞭藻属、小卵胞藻、极小卵胞藻、卵胞藻属、湖泊颤藻、颤藻属、亚短颤藻、嗜酸帕氏藻、巴夫藻属、扁裸藻属、席藻属、扁藻属、卡氏颗石藻、齿状颗石藻、颗石藻属、威克海姆原藻、雍滞原藻、波多黎各原藻、桑椹形原藻、饶氏原藻、塔胞藻属、桑椹藻属、囊状金藻、被甲栅藻、水绵属、钝顶螺旋藻、裂丝藻属、聚球藻属、四角藻属、四月藻属、司西四月藻、威氏海链藻以及 Viridiella fridericiana。
34.按权利要求24所述的产油微生物甘油三酯油类组合物，所述组合物是通过在培养基中培育重组产油微生物细胞群体所产生，其中所述产油微生物细胞是所述原藻属的细胞。
35.按权利要求34所述的产油微生物甘油三酯油类组合物，所述组合物是通过在培养基中培育重组产油微生物细胞群体所产生，其中所述产油微生物细胞是所述桑椹形原藻属的细胞。
36.按权利要求24所述的产油微生物甘油三酯油类，其中所述产油微生物细胞是产油酵母细胞。
37.按权利要求24所述的产油微生物甘油三酯油类，其中所述产油微生物细胞是产油细菌细胞。
38.按权利要求26所述的产油微生物甘油三酯油类组合物，其中所述天然存在的油类是椰子油。
39.按权利要求26所述的产油微生物甘油三酯油类组合物，其中所述天然存在的油类是棕榈油，并且其中所述外源性基因包含油棕硫酯酶基因、细叶萼距花硫酯酶基因、细叶萼距花KAS IV基因与赖特氏萼距花FATB2基因的组合，或经过设计以破坏内源性KAS II基因的构建体。
40.按权利要求26所述的产油微生物甘油三酯油类组合物，其中所述天然存在的油类是棕榈仁油，并且其中所述外源性基因`包含赖特氏萼距花FATB2基因与经过设计以破坏内源性SAD2B基因的构建体的组合。
41.按权利要求26所述的产油微生物甘油三酯油类组合物，其中所述天然存在的油类是牛油树脂。
42.按权利要求26所述的产油微生物甘油三酯油类组合物，其中所述天然存在的油类是牛脂。
43.按权利要求26所述的产油微生物甘油三酯油类组合物，其中所述天然存在的油类是猪油，并且其中所述外源性基因包含加州月桂硫酯酶基因与经过设计以破坏内源性SAD2B基因的构建体的组合、山竹硫酯酶基因与经过设计以破坏内源性SAD2B基因的构建体的组合、甘蓝型油菜硫酯酶基因，或细叶萼距花硫酯酶基因。
44.按权利要求23所述的产油微生物甘油三酯油类组合物，其中所述甘油三酯油类组合物进一步包含选自由以下组成的组的属性:于0.3mcg/g的总类胡萝卜素； .少于0.005mcg/g的番茄红素； ii1.少于0.005mcg/g的β -胡萝卜素； iv.少于0.3mcg/g的叶绿素A ； V.少于175mcg/g的Y-生育酹； v1.少于0.25%的菜籽甾醇、菜油甾醇、豆甾醇或β-谷甾醇； vi1.少于350mcg/g的总生育三烯酹；vii1.少于0.05mcg/g的叶黄素；或 ix.少于275mcg/g的生育酹。
45.一种制备产油微生物甘油三酯油类组合物的方法，所述甘油三酯油类组合物具有选自由以下组成的组的脂肪酸型态:C8:0占至少约1% ；C10:0占至少约1% ；C12:0占至少约1% ；C14:0占至少约2% ；C16:0占至少约30% ；C18:0占至少约5% ；C18:1占至少约60% ；C18:2占少于约 % ;以及饱和脂肪酸占至少约35%，所述方法包括以下步骤: a.在培养基中培育产油微生物细胞的群体直到所述产油微生物细胞的细胞干重的至少10%是甘油三酯油类为止；以及 b.从所述产油微生物细胞中分离出所述甘油三酯油类组合物。
46.按权利要求45所述的方法，其中所述产油微生物细胞包含外源性基因，并且其中所述产油微生物细胞的内源性去饱和酶任选地已失活或突变而具有较小的酶活性。
47.按权利要求46所述的方法，其中所述甘油三酯油类的脂肪酸型态类似于天然存在的油类的甘油三酯油类型态。
48.按权利要求47所述的方法，其中所述天然存在的油类选自由可可脂、椰子油、棕榈油、棕榈仁油、牛油树脂、牛脂以及猪油组成的组。
49.按权利要求46所述的方法，其中所述甘油三酯油类的脂肪酸型态包含如下型态，在所述型态中，C10:0、C12:0与C14:0的组合总量是至少约50% ;C16:0、C18:0与C18:1的组合总量是至少约60% ;C18:0、C18:1与C18:2的组合总量是至少约60% ;C14:0、C16:0、C18:0与C18:l的组合总量是至少约60% ;C8:0与C10:0的组合总量少于约50%。
50.按权利要求45所述的方法，其中所述甘油三酯油类的脂肪酸型态包含选自由以下组成的组的脂肪酸比率:C8:0与C10:0的比率是至少约5: I ;C10:0与C12:0的比率是至少约6: I ;C12:0与C14:0的比率是至少约5: I ;C14:0与C12:0的比率是至少约7: I ；以及C14:0与C16:0的比率是至少约1: 2。
51.按权利要求46所述的方法，所述内源性去饱和酶选自由硬脂酰基ACP去饱和酶和δ -12脂肪酸去饱和酶组成的组。
52.按权利要求46所述的方法，其中所述外源性基因选自由编码酰基-ACP硫酯酶的基因组成的组。
53.按权利要求52所述的方法，其中所述外源性基因编码酰基-ACP硫酯酶，所述酰基-ACP硫酯酶选自由以下组成的组:加州月桂脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号AAC49001);樟树脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号Q39473);加州月桂脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号Q41635);肉豆蘧脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号ΑΑΒ71729);肉豆蘧脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号ΑΑΒ71730);油棕脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号ABD83939);油棕脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号AAD42220);毛白杨脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号ABC47311);拟南芥脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号ΝΡ_172327)；拟南芥脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号CAA85387);拟南芥脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号CAA85388);陆地棉脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号Q9SQI3);披针叶萼距花脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号CAA54060);细叶萼距花脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号AAC72882);美叶萼距花脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号ΑΒΒ71581);披针叶萼距花脂肪酰基-ACP硫酯酶 (基因库编号CAC19933);油棕脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号AAL15645);细叶萼距花脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号Q39513);陆地棉脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号AAD01982);葡萄脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号CAN81819);山竹脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号AAB51525);芥菜脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号ABI18986);长叶马府油树脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号AAX51637);甘蓝型油菜脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号ABH11710);稻(籼稻栽培种)脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号EAY86877);稻(粳稻栽培种)脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号ΝΡ_001068400);稻(籼稻栽培种)脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号EAY99617);细叶萼距花脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号AAC49269);美国榆脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号AAB71731);披针叶萼距花脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号CAB60830);湿地萼距花脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号AAC49180);德国鸢尾脂肪酰基-ACP硫酯酶(基`因库编号AAG43858);德国鸢尾脂肪酰基-ACP`硫酯酶(基因库编号AAG43858.1);湿地萼距花脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号AAC49179);肉豆蘧脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号AAB71729);肉豆蘧脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号AAB717291.1);细叶萼距花脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号U39834);加州月桂脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号M94159);樟树脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号U31813);赖特氏萼距花脂肪酰基-ACOP硫酯酶(基因库编号U56103);以及普通种蓖麻脂肪酰基-ACP硫酯酶(基因库编号 ABS30422)。
54.按权利要求46所述的方法，其中所述产油微生物细胞进一步包含编码蔗糖转化酶的基因。
55.按权利要求46所述的方法，其中所述产油微生物细胞是选自以下的微藻属或物种的细胞:东方曲壳藻、阿格藻属、透明茧形藻、咖啡形双眉藻、咖啡形双眉藻线形变种、咖啡形双眉藻点纹变种、咖啡形双眉藻泰勒氏变种、咖啡形双眉藻小型变种、优美双眉藻、优美双眉藻头状变种、双眉藻属、项圈藻属、纤维藻属、镰形纤维藻、黄金色藻、波氏藻属、布朗葡萄藻、苏台德克斯葡萄藻、卡特藻属、纤`细角毛藻、牟氏角毛藻、牟氏角毛藻广盐变种、角毛藻属、无硝小球藻、南极小球藻、金绿小球藻、卡氏小球藻、包囊小球藻、脱水小球藻、椭圆形小球藻、浮水小球藻、淡褐小球藻、淡`褐小球藻空腔变种、谷氏小球藻、水溪小球藻、水溪小球藻栖海岸变种、水溪小球藻增大变种、凯氏小球藻、匍扇小球藻(藻株SAG 37.88)、黄绿小球藻、黄绿小球藻金绿变种、黄绿小球藻淡黄变种、红藻小球藻、极微小球藻、突变小球藻、夜间小球藻、巴夫氏小球藻、嗜光小球藻、普氏小球藻、原始小球藻(包括UTEX藻株1806、411、264、256、255、250、249、31、29、25 以及 CCAP 藻株 211/17 和 211/8d 中的任一种)、原始小球藻耐酸变种、规则小球藻、规则小球藻小型变种、规则小球藻伞状变种、瑞氏小球藻、嗜糖小球藻、嗜糖小球藻椭圆形变种、盐生小球藻、简单小球藻、耐热性小球藻、小球藻属、球形小球藻、斯蒂格小球藻、万尼氏小球藻、普通小球藻、普通小球藻、普通小球藻粗皮变型、普通小球藻自养变种、普通小球藻绿色变种、普通小球藻普通变种、普通小球藻普通变种粗皮变型、普通小球藻普通变种绿色变型、黄色小球藻、左氏小球藻、他伯氏小球藻、普通小球藻、水溪绿球藻、绿球藻属、绿梭藻属、蓝隐藻属、金球藻属、球钙板藻属、隐藻属、隐蔽小环藻、梅尼小环藻、小环藻属、杜氏藻属、拜尔代维勒杜氏藻、双眼杜氏藻、颗粒状杜氏藻、海洋杜氏藻、微小杜氏藻、巴夫杜氏藻、比`雷杜氏藻、普林莫杜氏藻、盐生杜氏藻、陆生杜氏藻、特氏杜氏藻、绿色杜氏藻、特氏杜氏藻、绿色独球藻、独球藻属、椭圆藻属、裸藻属、伏氏藻属、克罗脆杆藻、脆杆藻属、粘球藻属、丽丝藻属、膜胞藻属、等鞭金藻球亲近种、球等鞭金藻、鳞孔藻属、微星藻属、微星藻属(UTEX LB 2614)、微小单针藻、单针藻属、微绿球藻属、盐生微拟球藻、微拟球藻属、适意舟形藻、毕氏舟形藻、Navicula pseudotenelloides、薄膜舟形藻、嗜腐舟形藻、舟形藻属、肾鞭藻属、肾藻属、普通菱形藻、亚历山大菱形藻、普通菱形藻、分散菱形藻、碎片菱形藻、汉氏菱形藻、平庸菱形藻、中型菱形藻、小头菱形藻、微小菱形藻、微小菱形藻椭圆变种、微小菱形藻莫纳变种、四边形菱形藻、菱形藻属、棕鞭藻属、小卵胞藻、极小卵胞藻、卵胞藻属、湖泊颤藻、颤藻属、亚短颤藻、嗜酸帕氏藻、巴夫藻属、扁裸藻属、席藻属、扁藻属、卡氏颗石藻、齿状颗石藻、颗石藻属、威克海姆原藻、雍滞原藻、波多黎各原藻、桑椹形原藻、饶氏原藻、塔胞藻属、桑椹藻属、囊状金藻、被甲栅藻、水绵属、钝顶螺旋藻、裂丝藻属、聚球藻属、四角藻属、四月藻属、司西四月藻、威氏海链藻以及Viridiellafridericiana。
56.按权利要求55所述的方法,其中所述产油微生物细胞是所述原藻属的细胞。
57.按权利要求56所述的方法，其中所述产油微生物细胞是所述桑椹形原藻属的细胞。
58.按权利要求48所述的方法，其中所述天然存在的油类是椰子油。
59.按权利要求48所述的方法，其中所述天然存在的油类是棕榈油，并且其中所述外源性基因包含油棕硫酯酶基因、细叶萼距花硫酯酶基因、细叶萼距花KAS IV基因与赖特氏萼距花FATB2基因的组合，或经过设计以破坏内源性KAS II基因的构建体。
60.按权利要求48所述的方法，其中所述天然存在的油类是棕榈仁油，并且其中所述外源性基因包含赖特氏萼距花FATB2基因与经过设计以破坏内源性SAD2B基因的构建体的组合。
61.按权利要求48所述的方法，其中所述天然存在的油类是牛油树脂。
62.按权利要求48所述的方法，其中所述天然存在的油类是牛脂。
63.按权利要求48所述的方法，其中所述天然存在的油类是猪油，并且其中所述外源性基因包含加州月桂硫酯酶基因与经过设计以破坏内源性SAD2B基因的构建体的组合、山竹硫酯酶基因与经过设计以破坏内源性SAD2B基因的构建体的组合、甘蓝型油菜硫酯酶基因，或细叶萼距花硫酯酶基因。
64.一种制造油基产品的方法，所述方法包括以下步骤: a.对如权利要求21所述的产油微生物甘油三酯油类组合物进行选自由以下组成的组的至少一种化学反应:皂化；复分解；酸水解；碱水解；酶促水解；催化水解；热压水水解；催化水解反应，其中使脂质分解成甘油和脂肪酸；产生脂肪族氮化合物的胺化反应 ’产生一元酸和二元酸的臭氧分解反应；甘油三酯分解反应，选自由酶促分解和压力分解组成的组；水解反应之后进行缩合反应；加氢处理反应；加氢处理反应以及在加氢处理反应之前或同时进行脱氧反应或缩合反应；除气反应；脱氧反应，选自由氢解反应、氢化、连续氢化-氢解反应、连续氢解-氢化反应以及联合氢化-氢解反应组成的组；脱氧反应后进行缩合反应；酯化反应；酯交换反应；酯基转移反应；羟基化反应；以及羟基化反应后进行缩合反应；以及 b.分离所述反应的产物与其它组分。
65.按权利要求64所述的方法，其中所述油基产品选自由肥皂、燃料、介电液体、液压液、增塑剂、润滑剂、传热流体以及金属加工液组成的组。
66.按权利要求65所述的方法，其中所述油基产品是燃料产品，所述燃料产品选自由以下组成的组: a.生物柴油； b.可再生柴油；以及 c.喷气燃料。
67.按权利要求66所述的方法，其中所述燃料产品是生物柴油，所述生物柴油具有下列一种或多种属性:于0.3mcg/g的总类胡萝卜素； .少于0.005mcg/g的番茄红素； ii1.少于0.005mcg/g的β -胡萝卜素； iv.少于0.3mcg/g的 叶绿素A ； V.少于175mcg/g的Y-生育酹； v1.少于0.25%的菜籽甾醇、菜油甾醇、豆甾醇或β-谷甾醇； vi1.少于350mcg/g的总生育三烯酹；vii1.少于0.05mcg/g的叶黄素；或 ix.少于275mcg/g的生育酹。
68.按权利要求66所述的方法，其中所述燃料产品是可再生柴油，所述可再生柴油的T10-T90 是至少 20°C、40°C或 60°C。
69.按权利要求66所述的方法，其中所述燃料产品是符合HRJ-5和/或ASTM规范D1655的喷气燃料。
全文摘要
本发明提供了用于在重组微生物(包括产油微生物)中生产油类、燃料、油脂化学品以及其它化合物的方法和组合物，以及低成本培育所述微生物的方法。含有外源性基因的微藻细胞可用于制造运输燃料(如可再生柴油、生物柴油以及可再生喷气燃料)以及油脂化学品(如官能流体、表面活性剂、肥皂以及润滑剂)，所述外源性基因编码例如脂酶、蔗糖转运蛋白、蔗糖转化酶、果糖激酶、多糖降解酶、酮酰基-ACP合酶、脂肪酰基-ACP硫酯酶、脂肪酰基-辅酶A/醛还原酶、脂肪酰基-辅酶A还原酶、脂肪醛还原酶、脂肪醛脱羰基酶和/或酰基载体蛋白。
文档编号C12N15/74GK103097540SQ201180036870
公开日2013年5月8日 申请日期2011年5月27日 优先权日2010年5月28日
发明者S·富兰克林, A·索曼奇, J·维, G·鲁登科, J·L·莫瑟利, W·莱基特斯基 申请人:索拉兹米公司