Rna提取用溶液的制作方法
专利名称：Rna提取用溶液的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于从生物样品提取实质上纯粹的RNA的溶液。
背景技术：
写在DNA中的遗传信息以多种多样的组合被转录成RNA，从而生物显示复杂的表型。已经明确RNA通过种类、表达量而对生物的表型起作用，为了进行基因表达分析，从各种生物材料提取纯度高的RNA是重要的。为了实现该目标，到目前为止开发了大量的RNA提取方法。频繁被使用的RNA的分离方法有酚提取、从离液盐(chaotropic salt)溶液的沉淀、和对二氧化硅膜的吸附等。专利文献I记载了用于RNA的提取的包含2 5M的胍和40 60%的酚的溶液。通过使用该溶液，可以将这以前使用超速离心机且需要2天以上的操作以3小时有效地进行RNA提取。该方法被称为单步法。专利文献2中作为上述专利文献I所记载的方法的进一步改良，公开了用于从包含RNA、DNA和蛋白质的样品中将这些各成分同时提取而分离的提取溶液。具体地，记载了使用包含0. 5 2M的胍的浓度30 50%的酚溶液将RNA提取至水层而分离。专利文献1和2所记载的溶液，其组成不同，但均可以使用各溶液以同样的操作提取RNA。即，可以通过在各溶液中将生物组织均质化，使用氯仿等疏水性有机溶剂，将该匀浆离心而进行层分离。离心分离后，回收含RNA的最上部的水层，使用醇使RNA沉淀，并洗涤，从而提取RNA。但是,使用专利文献1和2所记载的溶液和方法分离的RNA中,额外混入(残存)有能通过逆转录-聚合酶链反应分析(RT-PCR)检出的程度的量的基因组DNA，因此存在例如在RT-PCR的情况下丧失RNA的定量性等问题(专利文献3，例如0005段)。因此，为了除去混入的DNA必须将通过这些方法分离的RNA进一步纯化。用于除去在提取的RNA样品中作为杂质而混入的DNA的一种一般方法是，将RNA样品用脱氧核糖核酸酶(DNase)处理。但是，利用DNase的处理在液层进行的情况下，处理后为了除去DNase，必须再次进行酚/氯仿提取和/或蛋白质的变性。另外，在组合二氧化硅膜柱进行提取的情况下，必须反复进行柱的洗涤操作。通过该利用DNase的处理，DNA的混入减少，但这些劳动增加，而且存在产生RNA的损失，从而RNA的提取量减少这样的问题。专利文献3中作为不进行DNase处理而避免DNA向RNA样品中混入的方法，公开了在PH值小于4的条件下使用RNA提取试剂的方法。但是，一般已知核酸在酸性下脱嘌呤化而分解，实质上分离未分解的RNA是困难的。另外，酸性下DNA对水层/有机层的溶解平衡偏向于向有机层分配，因此通过在PH值小于4的条件下使用RNA提取试剂可以期待某种程度的抑制基因组DNA混入水相的效果，但完全抑制碱基数小的DNA片段的混入是不可能的。现有技术文献专利文献
专利文献1:美国专利第4843155号专利文献2 :日本特开平5-344886号公报专利文献3 :日本特表2007-532140号公报
发明内容
发明要解决的课题如上，用于从生物样品提取RNA的现有溶液，在要求定量性的情况下，存在不能提取未混入DNA的实质上纯粹的RNA这样的课题。并且，为了除去混入的DNA，需要DNase处理等附加工序。本发明要解决这些课题，提供用于从生物样品提取实质上纯粹的RNA的溶液。用于解决课题的方法本发明者们此次对于现有的RNA提取用溶液的组成进行了研究，特别地发现了酚浓度与防止DNA的混入的效果相关，从而完成了本发明。SP，本发明提供以下[1] [9]。[1] 一种溶液，是用于从包含RNA并且至少还包含DNA的生物样品中提取RNA的溶液，其中，包含(a)相对于溶液的总量超过50体积％的酚、(b)相对于溶液的总量为3 10体积％的多元醇、(c)相对于溶液的总量为0. 5 2. 0M浓度的胍盐、(d)相对于溶液的总量为0.1 0. 5M浓度的硫氰酸盐、和(e)用于将溶液的pH值维持在4 6的缓冲剂。[2]根据[1]所述的溶液，其中，酚浓度相对于溶液的总量为55 65体积％。[3]根据[1]或[2]所述的溶液，其中，进一步包含用于分离水层的有机溶剂。[4]根据[1] [3]的任一项所述的溶液，其中，生物样品是培养细胞的培养液。[5]根据[1] [3]的任一项所述的溶液，其中，生物样品是生物的体液成分。[6]根据[1] [3]的任一项所述的溶液，其中，生物样品是生物的血液成分。[7]从生物样品中提取RNA的方法，所述生物样品包含RNA并且至少还包含DNA，该方法包括以下工序将所述生物样品与包含下述(a) (e)的溶液一起进行均质化的工序，(a)相对于溶液的总量超过50体积％的酚、(b)相对于溶液的总量为3 10体积％的多元醇、(c)相对于溶液的总量为0. 5 2. 0M浓度的胍盐、(d)相对于溶液的总量为0.1 0. 5M浓度的硫氰酸盐、和(e)用于将溶液的pH值维持在4 6的缓冲剂；将所得的匀浆与用于分离水层的有机溶剂混合的工序；将所得的混合物进行离心分离的工序；以及回收离心分离所生成的、含RNA的水层的工序。[8]从生物样品中提取RNA的方法，所述生物样品包含RNA并且至少还包含DNA，该方法包括以下工序
将所述生物样品与包含下述(a) (f)的溶液一起进行均质化的工序，(a)相对于溶液的总量超过50体积％的酚、(b)相对于溶液的总量为3 10体积％的多元醇、(c)相对于溶液的总量为0. 5 2. OM浓度的胍盐、(d)相对于溶液的总量为0.1 0. 5M浓度的硫氰酸盐、和(e)用于将溶液的pH值维持在4 6的缓冲剂、(f)用于分离水层的有机溶剂；将所得的匀浆进行离心分离的工序；以及回收离心分离所生成的、含RNA的水层的工序。[9]根据权利要求7或8所述的方法，其中，酚浓度相对于(a) (e)的溶液的总量为55 65体积。发明的效果通过使用本发明的溶液，可以从生物样品中简便地提取没有混入DNA的实质上纯粹的RNA。另外，根据本发明，不需要可造 成回收损失的DNase处理等附加处理，就可以获得在要求定量性的用途中也能够直接使用的纯度的RNA。特别是生物样品中，即使在包含非常多的RNA分解酶和/或其他夹杂物的血液等体液中，也可以高纯度地提取目的RNA。
图1是在实施例1中使用本发明的溶液从血清提取的核酸的电泳图。图2是在比较例I中使用专利文献2所记载的溶液从血清提取的核酸的电泳图。图3是在比较例2中使用专利文献I所记载的溶液从血清提取的核酸的电泳图。图4是在实施例2 5中使用本发明的溶液从血清提取的核酸的电泳图。图5是在实施例6 12中使用本发明的溶液从血清提取的核酸的电泳图。图6是在实施例13、比较例3中使用本发明的溶液、专利文献3所记载的溶液从血清提取的核酸的电泳图。图7是在实施例14中使用本发明的溶液从培养细胞提取的核酸的电泳图。图8是在实施例15、16中使用本发明的溶液从血清提取的核酸的电泳图。图9是在比较例4中使用专利文献3所记载的溶液从血清提取的核酸的电泳图。图10是在实施例17、18中使用本发明的溶液从血清提取的核酸的电泳图。
具体实施例方式本发明涉及用于从生物样品中提取RNA的溶液，其中，包含以下的(a) (e)作为其成分，(a)相对于溶液的总量超过50体积0A的酚、(b)相对于溶液的总量为3 10体积％ (3体积％以上且10体积％以下)的多元醇、(c)相对于溶液的总量为0. 5 2. OM(0. 5M以上且2. OM以下)浓度的胍盐、(d)相对于溶液的总量为0.1 0. 5M(0.1M以上且0. 5M以下)浓度的硫氰酸盐、和
(e)用于将溶液的pH值维持在4 6的缓冲剂。本发明中使用的生物样品包含RNA并且至少还包含DNA。另外，通过使用本发明的溶液，可以从上述生物样品提取实质上纯粹的RNA。这里，“实质上纯粹的RNA”是指，生物样品中当初所含的DNA被分离，实质上没有该DNA混入的RNA。RNA是否实质上纯粹，可以通过能否由电泳检出DNA来判断。例如，7 >卜 f夕7 口 -7'—株式会社制“AgilentRNA6000PicoKit” (型号 5067-1513)能够检出推荐 50pg/ u L ~ 5000pg/ u L 的核酸，因而可以使用该试剂盒来评价有无DNA混入。具体地，在将提取的核酸进行RNase处理，然后使用“Agilent RNA6000PicoKit ”进行电泳的情况下，未检测到峰时可以判断充分地抑制了 DNA混入，得到了实质上纯粹的RNA。另外，可以通过定量PCR来分析混入的DNA量，从而评价RNA的纯度。例如，使用实时PCR装置和“SYBR Green” (荧光色素)可以检出60pg的双链DNA，所以可以以此进行评价。具体地，在包含引物、DNA合成酶和“SYBR Green”的PCR反应溶液中加入提取的核酸进行PCR扩增，与预先制成的标准曲线比较，从而可以定量地分析混入的DNA量。本发明中，溶液的总量是指包含上述(a) (e)的全部的溶液的总体积。例如，相对于溶液的总量超过50体积％的酚，是指在将全成分混合之后的溶液IL中含有超过500mL的酚。另外，例如，相对于溶液的总量为0. 5 2. OM浓度的胍盐，是指溶液的终浓度为0. 5M 2. 0M,即，将各成分全部混合后的溶液IL中含有0. 5mol 2mol的胍盐。本发明的溶液包含(a)相对于溶液的总量超过50体积％的酚。明确了如果使酚浓度为与现有技术不同地超过50体积％，则具有在RNA被提取的水层作为杂质的DNA的混入减少的效果。本发明的溶液包含例如51体积％以上、52体积％以上、53体积％以上、54体积％以上或55体积％以上的酚。优选包含53体积％以上、更优选为55体积％以上的酚。另外,从在将作为本发明的溶液的其他成分的(b)多元醇、(c)0. 5 2. OM胍盐、(d)0.1
0.5M硫氰酸盐以各规定浓度均匀混和的状态下调制本发明的溶液的情况考虑，酚的浓度优选为75体积％以下，另外为了减少酚被氧化造成的影响，酚的浓度更优选为65体积％以下。优选的酚浓度的范围是将这些上限和下限任意组合而得的范围，更优选为52体积％ 65体积％、53体积％ 65体积％，特别优选为55体积％ 65体积％。本发明的溶液包含(b)相对于溶液的总量为3 10体积％的多元醇。本发明中的多元醇是具有多个羟基的脂肪族醇，可以使用能够使本发明的溶液中的(a)酚成分和(C)、
(d)的水溶液混合而作为均匀的溶液维持的多元醇。作为多元醇，优选具有2 4个羟基的碳数2 6个的脂肪族醇。可列举例如，甘油、乙二醇、丙二醇、赤藓醇等，更优选为甘油。为了将本发明的溶液作为均匀的溶液维持、使酚成分不过度分配到水层，相对于本发明的溶液的总量可以使用3 10体积％的多元醇。本发明的溶液包含(C)相对于溶液的总量为0. 5 2. OM浓度的胍盐。作为胍盐，具体优选硫氰酸胍和/或盐酸胍。胍盐具有保护RNA免受分解、在水性的溶液中使酚维持溶液状态的效果。本发明的溶液包含(d)相对于溶液的总量为0.1 0. 5M浓度的硫氰酸盐。作为硫氰酸盐，可以优选使用硫氰酸的无机盐，更优选使用硫氰酸铵、硫氰酸钠。另外，可以是多种不同硫氰酸的无机盐的混合物，例如可以优选使用硫氰酸铵与硫氰酸钠的混合物。认为硫氰酸盐增强从生物样品的RNA的提取。此外，在本发明的溶液含有硫氰酸胍的情况下，该硫氰酸胍的浓度包含在上述的胍盐的浓度中，不包含在硫氰酸盐的浓度中。本发明的溶液包含(e)用于将溶液的pH值维持在4 6的缓冲剂。作为缓冲剂，可以使用为了将PH值维持在所需的范围而通常使用的显示缓冲性的有机盐和/或无机盐。具体包含钠、钾、锂或铵的磷酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、邻苯二甲酸盐、酒石酸盐或乳酸盐等有机盐和无机盐。在这些组合中，更优选使用乙酸钠和/或柠檬酸钠。另外，也可以组合使用多种这些有机盐和/或无机盐。该缓冲剂的浓度只要对于将本发明的溶液维持在目的PH值4 6充分，就不特别限定，优选相对于本发明的溶液的总量为0. 02 0. 2M的浓度。为了调整本发明的溶液的PH值，除了缓冲剂之外，还可以适宜添加适当的酸或碱水溶液，例如盐酸或氢氧化钠溶液。为了使生物样品中的蛋白质变性而辅助目的RNA的纯化，本发明的溶液中还可以含有聚氧乙烯失水山梨糖醇、十二烷基硫酸钠、肌氨酸等表面活性剂。另外，为了防止酚的氧化，本发明的溶液中还可以含有受阻胺酚、喹啉等抗氧化剂。例如在生物样品是液体状态的情况下提取目的RNA时，本发明的溶液优选使用生物样品的I倍体积以上、优选为3倍体积以上。以下显示使用本发明的溶液提取目的RNA的步骤的例子。首先，将生物样品在本发明的溶液中均质化而形成匀浆。对均质化的方法不特别限定，除了利用涡流混合器等的搅拌、利用注射针的破碎之外，可以使用一般的匀浆器。接下来，将用于分离水层的有机溶剂加入到该匀浆中，然后将其进行离心分离。这里加入的有机溶剂优选使用匀浆的2体积％ 40体积％左右。另外离心分离通常可以在6，000 X G 20，000 X G进行3分钟 30分钟，例如在速度12，000XG的条件下在室温进行10分钟，但只要液层分离即可，对速度、温度、时间不特别限制。进行离心分离 ，作为目的的实质上纯粹的RNA被提取至水层。另一方面，DNA、蛋白质等被分离到有机层中，或在生成中间层的情况下被分离到有机层和中间层。用于分离水层的有机溶剂，是用于分离成含有使用本发明的溶液提取的目的RNA的水层、和含有DNA等的有机层和/或中间层(在生成的情况下)的液体的有机化合物。作为该有机溶剂，可以使用亲水性的程度与酚相同，或者更加疏水性的有机溶剂。例如，只要是作为显示亲水性的指标一般使用的水/辛醇分配系数CLogP的值为1. 4(酚的CLogP值)以上的有机化合物就可以使用，可以优选使用CLogP的值为1. 4 5的范围的化合物。这里，CLogP值可以使用例如“Chem Draw”(注册商标)等程序求出推算值。作为在本发明中使用的有机溶剂，可列举例如，氯仿(1. 952)、对溴苯甲醚(3. 064)、1-溴-3-氯丙烷(1. 847)、4_ 溴藜芦醚(2. 7345)、6_ 溴-1,4-苯并二wS 院(3. 0005)、1-溴-4-三氟甲氧基苯(4. 173)、1-溴-2，4-二甲氧基苯(2. 8545)、4_ 氟苯甲醚(2. 344)、4_ 溴甲苯(3. 504)、4-溴丁酸乙酯(1.772)等，但不限于此。这里，上述各有机溶剂的0中的数值是用“ChemDraw”求出的CLogP的值。用于分离上述的水层的有机溶剂添加到如上所述使用包含(a) (e)的本发明的溶液形成的匀浆中使用，但也可以预先包含在上述包含(a) (e)的本发明的溶液中。在现有的酚浓度为50%以下的溶液的情况下，如果想要预先含有该有机溶剂，则在与生物样品混和之前溶液就分离成水层和有机层2层，因此难以作为提取溶液使用，但在本发明的溶液的酚浓度下有机溶剂与本发明的溶液均匀地混和，可以作为单一的溶液保存。预先含有该有机溶剂的本发明的溶液通过在加入生物样品均质化而制成匀浆之后，立即进行离心分离，从而可以使包含RNA的水层分离。因此，与之后将有机溶剂加入匀浆的情况相比，可以使步骤非常单纯化，所以是优选的。在用于分离水层的有机溶剂预先包含在上述包含(a) (e)的本发明的溶液中的情况下，该有机溶剂的含量可以根据加入的有机溶剂的种类和溶液的酚浓度，在有机溶剂在本发明的溶液中均匀混和的范围内选定。例如，在本发明的溶液的酚浓度为65%时选择氯仿作为有机溶剂的情况下，优选含有相对于上述包含(a) (e)的溶液的总量100%为27体积％以下的任意体积。具体地，优选在上述包含(a) (e)的溶液100mL加入27mL以下的任意体积的氯仿。相对于上述包含(a) (e)的溶液的总量100%，更优选包含5 25体积％的氯仿，进一步优选包含10 20体积％的氯仿。另外，当酚浓度为58%时，氯仿相对于上述包含(a) (e)的溶液的总量100%优选包含14%以下的任意体积，更优选包含6 13体积％，进一步优选包含8 12体积％。另外，在溶液的酚浓度为65%时选择对溴苯甲醚作为有机溶剂的情况下，相对于上述包含(a) (e)的溶液的总量100%，优选包含22体积％以下的任意体积，更优选包含5 20体积％，进一步优选包含10 18体积％。另夕卜，同样地酚浓度为58%时，对溴苯甲醚相对于上述包含(a) (e)的溶液的总量100%，优选包含13体积％以下的任意体积，更优选包含3 11体积％，进一步优选包含5 9体积％。为了将使用本发明的溶液被提取至水层的RNA进一步纯化、浓缩，可以在包含RNA的水层中加入低级醇使RNA沉淀，从而回收沉淀的RNA。或者，还可以使在包含RNA的水层中加入低级醇沉淀而得的RNA吸附于能吸附RNA的担载体、例如二氧化硅膜柱，然后从担载体(柱)溶出而回收。作为这里所用的低级醇，可列举乙醇、异丙醇等。其浓度可以依据一般的核酸的乙醇沉淀、异丙醇沉淀的方法或二氧化硅膜柱等的担载体的标志物推荐浓度来确定。本发明的溶液可以通过将上述的(a) (e)以各浓度混和来制造。作为其混和的步骤不特别限制。可以根据溶液的组成预先调制高浓度的各溶液然后将它们混和。例如，预先准备6M的硫氰酸胍水溶液、6M的硫氰酸铵水溶液、IM的乙酸钠，混合至目的浓度，然后进一步加入甘油、酚和不足部分的水来调制。关于预先在上述包含(a) (e)的溶液中包含了用于分离水层的有机溶剂本发明的溶液，也可以同样地通过混合(a) (e)和该有机溶剂至所需的浓度来制造。本发明中使用的生物样品只要包含RNA并且至少还包含DNA即可，不特别限制。例如，作为要从目的RNA中分离出的杂质成分，除了 DNA以外还可以包含蛋白质。具体可列举培养细胞、培养细胞的培养液、手术切片和/或活检样品等生物体组织、生物体细胞、血液、血液成分(血清、血浆)、尿、唾液、眼泪等体液等，但不限于这些，可以使用含有RNA的任意样品。在对这些生物样品应用本发明的溶液时，在生物样品是体液等液体样品的情况下，既可以采取后直接与本发明的溶液混和，也可以用PBS和/或水稀释后与本发明的溶液混和。在生物样品是细胞团(cell pellet)和/或组织片的情况下，既可以采取后直接与本发明的溶液混和，也可以用PBS和/或水稀释后与本发明的溶液混和，但为了避免RNA的分解，在稀释的情况下更优选制成生物样品的匀浆然后用水和/或PBS稀释。生物样品中的体液、特别是血液中有时含有非常多的RNA的分解酶和/或其他夹杂物，此时通过现有的方法提取实质上纯粹的RNA是非常困难的。本发明的溶液通过使酚超过50体积％，可以有效地将蛋白质等夹杂物提取到有机层，因此可以获得纯度高的目的RNA。另外，离心分离后出现的中间层减少，可以进行明确的层分离，所以包含目的RNA的水层的分离是容易的。使用本发明的溶液提取的RNA是多个核糖核苷酸通过磷酸二酯键结合而成的核糖核酸，不受其分子量、碱基数和/或来源限定。一般地，RNA在功能分类上被分类为mRNA(信使 RNA)、tRNA(转运 RNA)、rRNA(核糖体 RNA)、ncRNA(非编码 RNA)、snRNA(核内低分子RNA)、snoRNA(核小体低分子RNA)等多个种类，但化学结构上除了分子量(碱基数)以外不知道其他差异，均包含在本发明中的RNA中。一般被称为smalI RNA (小RNA)的碱基数为15 500个碱基左右的RNA、以及一般碱基数为18 25个碱基程度的miRNA (微RNA)也包含在本发明中的RNA中。一般地，RNA与DNA的一级化学结构的主要差异是作为构成糖的核糖2’ -位的羟基(-0H)的有无，各自的碱基数越小则RNA与DNA的结构差异越小，因而通过提取来分离两者越难。但是，如果使用本发明的溶液，则即使对于被称为small RNA的碱基数比较小的RNA,也可以高纯度地进行提取。通常在DNA与RNA混合存在的状态下，使用吸光光度计或发光光度计各自区别地定量是困难的，但因为通过使用本发明的溶液可以得到实质上纯粹的RNA，所以可以使用它们进行RNA的定量。另外，通过使用本发明的溶液，在使用qRT-PCR和/或微阵列的RNA的分析中，不需要利用DNase的处理，可以在不存在由DNA的混合存在造成的噪声的状态下简便地进行分析。
实施例通过以下实施例更具体地说明本发明，但本发明的范围不限于这些实施例。〈实施例1>(I) RNA提取用溶液的调制以溶液的各成分的终浓度为以下的方式将各成分混合而调制RNA提取用的溶液。 58体积％酹*5体积％甘油 0. 8M硫氰酸胍(以水溶液混合) 0. 4M硫氰酸铵(以水溶液混合) 0.1M乙酸钠缓冲液(以水溶液混合)，调节至pH值为5。(2)从生物样品中的RNA提取使用血清作为包含RNA和DNA以及蛋白质的生物样品来进行RNA提取。将上述(I)中调制的溶液900 u L与血清300 u L进行涡流混和,从而均质化。在匀衆中加入60 y L的对溴苯甲醚进行混和，在室温下以12，000XG离心10分钟。通过离心，形成了含有RNA的水层、含有DNA和蛋白质的有机层和中间层。其中，将水层400 ii L分离至其他管中。(3a)水层的RNA的纯化、浓缩-无酶处理-在(2)所分离的含有RNA的水层中加入1. 5倍体积的100%乙醇，在作为核酸的纯化柱的“miRNeasy mini kit”(株式会社3f 了 ^ >制)的“RNeasy Mini Spin Column”中加入700 ii L，以8000XG离心15秒使核酸吸附于柱上，将通过柱的液体丢弃。重复相同操作直至乙醇混和RNA样品用完，从而使水层所含的核酸全部吸附于柱上。然后按照“miRNeasymini kit”的方案用Buffer RWT700 u L,Buffer RPE500 u L将柱洗涤2次，使柱干燥之后，用30 ii L的无RNase水溶出，从而得到纯化、浓缩的RNA样品。(3b)从水层的RNA的纯化、浓缩-有RNase处理-为了确认提取的核酸是RNAjf⑵所分离的样品进行RNase处理。在⑵所分离的含有RNA的水层中加入1. 5倍体积的100%乙醇，与(3a)同样地使核酸吸附于柱。用Buffer RWT350 u L洗涤之后，加入稀释的RNase将吸附于柱的核酸进行RNase处理，用Buffer RWT350 u L、Buffer RPE500 u L将柱洗涤2次，使柱干燥之后，用30 y L的无RNase水溶出，从而得到纯化、浓缩的RNA样品。(4)利用电泳的纯度评价将(3a)、(3b)所得的各RNA样品I y L在70°C热变性2分钟之后骤冷。使用7夕>> 卜 r 夕 7 口 '7'—株式会社制“Agilent RNA6000PicoKit” (型号 5067-1513)进行电泳。其结果不于图1。另外，通过“Bioanalyzer2100”的Smear Analysis功能计算出25_500nt的峰区域的面积，确认被检测为峰的大小的核酸量(浓度)。在(3a)的无酶处理样品中，仅确认了 1个小于200个碱基的大小的峰(道I)。另外，此时算出的核酸量为816pg/iiL。另一方面，确认(3b)的RNase处理后的样品的电泳图谱，则完全没有检测到峰(道2)。另外，计算此时的核酸量为eipg/yL。使用不含核酸的PBS代替血清，与实施例1同样地操作来确认检测系统的噪声(道3 :空白)，则此时的核酸量为63pg/i!L，由此可知道2中算出的核酸量为噪声。由以上确认，提取的核酸仅为不含DNA的RNA。此外，将其他途径合成的22 25个碱基的RNA进行电泳而得的泳动距离与本实施例所得的峰的泳动距离同等，因此认为道I所确认的RNA为22 25个碱基。将以上的结果归纳于表I。<比较例1>(1) RNA提取用溶液的调制溶液的终浓度为酚浓度50体积％，除此以外以与实施例1相同的组成调制，从而调制专利文献2所述的溶液。(2)从生物样品中的RNA提取与实施例1同样地使用血清作为生物样品来进行。(3a)水层的RNA的纯化、浓缩-无酶处理-与实施例1同样地进行。(3b)从水层的RNA的纯化、浓缩-有RNase处理-与实施例1同样地进行。(3c)从水层的RNA的纯化、浓缩-有DNase处理-在实施例1的(3b)中，用DNase代替(3b)的RNase来处理含有RNA的水层，从而得到纯化、浓缩的样品。除了以上之外，与实施例1同样地进行。(4)利用电泳的纯度评价与实施例1同样地进行。其结果示于图2。从未进行酶处理的样品检测到2个强峰(碱基数为200个碱基左右和500个碱基左右)和I个弱峰(与实施例1相同碱基数)(道I)。在有RNase处理样品中，200个碱基和500个碱基的峰基本无变化，由此明确2个峰不是RNA (道2)。另一方面，由道I所见的I个弱峰消失可与实施例1同样地确认，该峰是RNA。在DNase处理后的样品中，2个强峰消失，检测到被分解得非常短的片段(道3)，由此可知这2个强峰是混入的DNA片段。如上，在使用酚浓度为50体积％的溶液的情况下，确认了 DNA的混入，未提取到纯粹的RNA。以上的结果归纳于表3。<比较例2>(I) RNA提取用溶液的调制调制除了酚浓度为60体积％以外，与专利文献I所述的提取用溶液同样的溶液。即，终浓度为60体积％酚、2M硫氰酸胍、0.1M乙酸钠、0. 2体积％ 2-巯基乙醇，pH值为4。(2)从生物样品中的RNA提取与实施例1同样地使用血清作为生物样品来进行。(3a)水层的RNA的纯化、浓缩-无酶处理-与实施例1同样地进行。 (4)利用电泳的纯度评价与实施例1同样地进行。其结果示于图3。确认了与比较例I同样的3个峰。由此确认混入了 DNA片段。将以上的结果归纳于表3。<实施例2>(I) RNA提取用溶液的调制溶液的终浓度为酚浓度55体积％，除此以外以与实施例1相同的组成调制溶液。(2)从生物样品中的RNA提取与实施例1同样地使用血清作为生物样品来进行。(3a)水层的RNA的纯化、浓缩-无酶处理-与实施例1同样地进行。(3b)从水层的RNA的纯化、浓缩-有RNase处理-与实施例1同样地进行。(4)利用电泳的纯度评价与实施例1同样地进行。其结果示于图4。检测出与实施例1同样的峰(道I)，确认了仅高纯度的RNA被提取出。在进行了RNase处理的样品(道5 ;RNase ( + ))中减少到与空白相同的水平，由此可以确认提取的核酸仅为RNA。以上的结果归纳于表I。<实施例3 >(I)RNA提取用溶液的调制溶液的终浓度为酚浓度65体积％，除此以外以与实施例1相同的组成调制溶液。(2)从生物样品中的RNA提取与实施例1同样地使用血清作为生物样品来进行。(3a)水层的RNA的纯化、浓缩-无酶处理-
与实施例1同样地进行。(4)利用电泳的纯度评价与实施例1同样地进行。其结果示于图4的道2。检测出与实施例1同样的峰，确认了仅高纯度的RNA被提取出。以上的结果归纳于表I。<实施例4>(I) RNA提取用溶液的调制溶液的终浓度为酚浓度53体积％，除此以外以与实施例1相同的组成调制溶液。(2)从生物样品中的RNA提取与实施例1同样地使用血清作为生物样品来进行。(3a)水层的RNA的纯化、浓缩-无酶处理-与实施例1同样地进行。(4)利用电泳的纯度评价
与实施例1同样地进行。其结果示于图4的道3。检测出与实施例1同样的峰，确认了仅高纯度的RNA被提取出。以上的结果归纳于表I。<实施例5>(I) RNA提取用溶液的调制调制与实施例1相同组成的溶液。(2)从生物样品中的RNA提取在匀浆中加入240 ii L的氯仿代替60 ii L的对溴苯甲醚，除此以外与实施例1同样地使用血清作为生物样品来进行。(3a)水层的RNA的纯化、浓缩-无酶处理-与实施例1同样地进行。(4)利用电泳的纯度评价与实施例1同样地进行。其结果示于图4的道4。检测出与实施例1同样的峰，确认了仅高纯度的RNA被提取出。以上的结果归纳于表I。<实施例6>(I) RNA提取用溶液的调制调制与实施例1相同组成的溶液。(2)从生物样品中的RNA提取在匀浆中加入100 L的4-溴藜芦醚代替60 L的对溴苯甲醚，除此以外与实施例I同样地使用血清作为生物样品来进行。(3a)水层的RNA的纯化、浓缩-无酶处理-与实施例1同样地进行。(4)利用电泳的纯度评价与实施例1同样地进行。其结果示于图5的道I。检测出与实施例1同样的峰，确认了仅高纯度的RNA被提取出。
以上的结果归纳于表I。<实施例7>(I)RNA提取用溶液的调制调制与实施例1相同组成的溶液。(2)从生物样品中的RNA提取在匀浆中加入100 ii L的6-溴-1，4-苯并二'^恶烷代替60 ii L的对溴苯甲醚，除此
以外与实施例1同样地使用血清作为生物样品来进行。(3a)水层的RNA的纯化、浓缩-无酶处理-与实施例1同样地进行。(4)利用电泳的纯度评价与实施例1同样地进行。其结果示于图5的道2。检测出与实施例1同样的峰，确认了仅高纯度的RNA被提取出。以上的结果归纳于表I。
<实施例8>(I) RNA提取用溶液的调制调制与实施例1相同组成的溶液。(2)从生物样品中的RNA提取在匀浆中加入IOOiiL的1-溴-4-三氟甲氧基苯代替60 ii L的对溴苯甲醚，除此以外与实施例1同样地使用血清作为生物样品来进行。(3a)水层的RNA的纯化、浓缩-无酶处理-与实施例1同样地进行。(4)利用电泳的纯度评价与实施例1同样地进行。其结果示于图5的道3。检测出与实施例1同样的峰，确认了仅高纯度的RNA被提取出。以上的结果归纳于表I。<实施例9>(I) RNA提取用溶液的调制调制与实施例1相同组成的溶液。(2)从生物样品中的RNA提取在匀浆中加入IOOii L的1-溴_2，4-二甲氧基苯代替60 ii L的对溴苯甲醚，除此以外与实施例1同样地使用血清作为生物样品来进行。(3a)水层的RNA的纯化、浓缩-无酶处理-与实施例1同样地进行。(4)利用电泳的纯度评价与实施例1同样地进行。其结果示于图5的道4。检测出与实施例1同样的峰，确认了仅高纯度的RNA被提取出。以上的结果归纳于表I。< 实施例 10 >(I) RNA提取用溶液的调制
调制与实施例1相同组成的溶液。(2)从生物样品中的RNA提取在匀浆中加入IOOiiL的4-氟苯甲醚代替60 ii L的对溴苯甲醚，除此以外与实施例I同样地使用血清作为生物样品来进行。(3a)水层的RNA的纯化、浓缩-无酶处理-与实施例1同样地进行。(4)利用电泳的纯度评价与实施例1同样地进行。其结果示于图5的道5。检测出与实施例1同样的峰，确认了仅高纯度的RNA被提取出。以上的结果归纳于表2。< 实施例 11 >(I) RNA提取用溶液的调制调制与实施例1相同组成的溶液。(2)从生物样品中的RNA提取
在匀浆中加入IOOii L的4-溴甲苯代替60ii L的对溴苯甲醚，除此以外与实施例1同样地使用血清作为生物样品来进行。(3a)水层的RNA的纯化、浓缩-无酶处理-与实施例1同样地进行。(4)利用电泳的纯度评价与实施例1同样地进行。其结果示于图5的道6。检测出与实施例1同样的峰，确认了仅高纯度的RNA被提取出。以上的结果归纳于表2。< 实施例 12 >(I) RNA提取用溶液的调制调制与实施例1相同组成的溶液。(2)从生物样品中的RNA提取在匀浆中加入IOOii L的4-溴丁酸乙酯代替60ii L的对溴苯甲醚，除此以外与实施例I同样地使用血清作为生物样品来进行。(3a)水层的RNA的纯化、浓缩-无酶处理-与实施例1同样地进行。(4)利用电泳的纯度评价与实施例1同样地进行。其结果示于图5的道7。检测出与实施例1同样的峰，确认了仅高纯度的RNA被提取出。以上的结果归纳于表2。< 实施例 13 >(I) RNA提取用溶液的调制调制在实施例1所调制的溶液中加入盐酸，从而将溶液的pH值调整为4. 2而得的溶液。(2)从生物样品中的RNA提取
与实施例1同样地使用血清作为生物样品来进行。(3a)水层的RNA的纯化、浓缩-无酶处理-与实施例1同样地进行。(4)利用电泳的纯度评价与实施例1同样地进行。其结果示于图6的道I。即使溶液的pH值为4. 2也检测出与实施例1同样的峰，可知仅RNA被高纯度地提取出。以上的结果归纳于表2。<比较例3 >(I) RNA提取用溶液的调制调制在比较例I所调制的溶液中加入盐酸，从而将溶液的pH值调整为3. 6而得的溶液。(2)从生物样品中的RNA提取
与实施例1同样地使用血清作为生物样品来进行。(3a)水层的RNA的纯化、浓缩-无酶处理-与实施例1同样地进行。(4)利用电泳的纯度评价与实施例1同样地进行。其结果确认了与图6的道2所示的比较例I同样的3个峰。由此确认，在使用酚浓度为50体积％的溶液的情况下，即使pH值为3. 6，也混入DNA片段。以上的结果归纳于表3。< 实施例 14 >(I) RNA提取用溶液的调制调制与实施例1相同组成的溶液。(2)从生物样品中的RNA提取作为生物样品，使用悬浮在PBS300 U L中的培养细胞(HE K 293细胞)来代替实施例I的300 u L的血清，除此以外与实施例1同样地进行。(3a)水层的RNA的纯化、浓缩-无酶处理-除了加入水层的乙醇量不是1. 5倍体积、而是1. 25倍体积以外，与实施例1同样地进行。(3b)从水层的RNA的纯化、浓缩-有RNase处理-除了加入水层的乙醇量不是1. 5倍体积、而是1. 25倍体积以外，与实施例1同样地进行。(4)利用电泳的纯度评价作为所使用的试剂盒使用“AgilentRNA6000NanoKit”(型号 5067-1511) ( 7 >>卜 f夕7 口夕一社制)代替“Agilent RNA6000PicoKit”，除此以外与实施例1同样地
进行。其结果示于图7。确认了在(3a)的无酶处理样品中，18S、28S核糖体RNA几乎不被分解(RIN值2.3)地被提取出(道I)。计算此时的核酸量为79ng/iiL。另外，(3b)的用RNase处理后的样品的结果与实施例1同样完全未检测到峰(道2)。计算此时的核酸量为4ng/iiL。另夕卜，确认完全不流入样品时的检测系统的噪声(道3)，则这时的核酸量为2ng/ii L，由此认为道2的核酸量为噪声。由以上确认，提取的核酸全部是RNA。以上的结果归纳于表2。〈实施例15 >(I) RNA提取用溶液的调制以溶液的各成分的终浓度为以下那样，将各成分混合而调制RNA提取用的溶液。即，相对于与实施例1相同组成的溶液900 y L，进一步加入60 y L的对溴苯甲醚调制溶液。*58 体积 ％酹*5体积％甘油 0. 8M硫氰酸胍(以水溶液混合) 0. 4M硫氰酸铵(以水溶液混合) 0.1M乙酸钠缓冲液(以水溶液混合)、调整至pH值为5 相对于上述的总量100%为6. 6体积％的对溴苯甲醚(2)从生物样品中的RNA提取 将上述(I)所调制的溶液900 U L和血清300 U L进行涡流混和从而均质化。在室温以12，000XG离心10分钟。通过离心形成了含有RNA的水层、含有DNA和蛋白质的有机层和中间层。其中，将水层350 ii L分离至其他管中。(3a)水层的RNA的纯化、浓缩-无酶处理-与实施例1同样地进行。(3b)从水层的RNA的纯化、浓缩-有RNase处理-与实施例1同样地进行。(4)利用电泳的纯度评价与实施例1同样地进行。其结果示于图8的道1、3、5。检测出与实施例1同样的峰，可知仅RNA被高纯度地提取出(道I)。有RNase处理(道3;RNase( + ))时减少到与空白(道5)相同的水平，由此可以确认提取的核酸仅为RNA。以上的结果归纳于表2。< 实施例 16 >(I) RNA提取用溶液的调制以溶液的各成分的终浓度为以下那样，将各成分混合而调制RNA提取用的溶液。即，对与实施例1相同组成的溶液900 u L进一步加入90 ii L的氯仿来调制溶液。.58 体积 ％酚*5体积％甘油 0. SM硫氰酸胍(以水溶液混合) 0. 4M硫氰酸铵(以水溶液混合) 0.1M乙酸钠缓冲液(以水溶液混合)、调整至pH值为5 相对于上述的总量100 %为10体积％的氯仿
(2)从生物样品中的RNA提取
将上述(I)所调制的溶液900 U L和血清300 U L进行涡流混和从而均质化。在室温以12，000XG离心10分钟。通过离心，形成了含有RNA的水层、含有DNA和蛋白质的有机层和中间层。其中，将水层350 u L分离到其他的管中。(3a)水层的RNA的纯化、浓缩-无酶处理-与实施例1同样地进行。(3b)从水层的RNA的纯化、浓缩-有RNase处理-与实施例1同样地进行。(4)利用电泳的纯度评价与实施例1同样地进行。其结果示于图8的道2、4、5。检测出与实施例1同样的峰，可知仅RNA被高纯度地提取出(道2)。有RNase处理(道4;RNase( + ))时减少到与空白(道5)相同的水平，由此可以确认提取的核酸仅为RNA。以上的结果归纳于表2。<比较例4>(I) RNA提取用溶液的调制
除了酚浓度为55体积％以外，调制与比较例3相同组成的溶液。(2)从生物样品中的RNA提取与实施例1同样地使用血清作为生物样品来进行。(3a)水层的RNA的纯化、浓缩-无酶处理-与实施例1同样地进行。(3b)从水层的RNA的纯化、浓缩-有RNase处理-与实施例1同样地进行。(4)利用电泳的纯度评价与实施例1同样地进行。其结果示于图9。(3a)的无酶处理样品中检测到与实施例1相比略宽阔的峰(道I)，另外在(3b)的RNase处理的样品中也检测到峰(道2)。由有RNase处理(RNase ( + ))时也可到大于空白(道2)的峰可以确认除RNA以外的核酸(DNA)的混入。以上的结果归纳于表3。< 实施例 17 >(I) RNA提取用溶液的调制溶液的终浓度为pH值4，除此以外以与实施例1相同的组成调制溶液。(2)从生物样品中的RNA提取与实施例1同样地使用血清作为生物样品来进行。(3a)水层的RNA的纯化、浓缩-无酶处理-与实施例1同样地进行。(3b)从水层的RNA的纯化、浓缩-有RNase处理-与实施例1同样地进行。(4)利用电泳的纯度评价与实施例1同样地进行。其结果示于图10(道1、2、5)。
检测出与实施例1同样的峰，确认了仅高纯度的RNA被提取出(道I)。有RNase处理(道2 ;RNase( + ))时减少到与空白(道5)相同的水平，由此可以确认提取的核酸仅为 RNA。以上的结果归纳于表2。< 实施例 18 >(I) RNA提取用溶液的调制溶液的终浓度为pH值6，除此以外以与实施例1相同的组成调制溶液。(2)从生物样品中的RNA提取与实施例1同样地使用血清作为生物样品来进行。(3a)水层的RNA的纯化、浓缩-无酶处理-与实施例1同样地进行。(3b)从水层的RNA的纯化、浓缩-有RNase处理-与实施例1同样地进行。
(4)利用电泳的纯度评价与实施例1同样地进行。其结果示于图10(道3、4、5)。检测出与实施例1同样的峰，确认了仅高纯度的RNA被提取出(道3)。有RNase处理(道4;RNase( + ))时减少到与空白(道5)相同的水平，由此可以确认提取的核酸仅为 RNA。以上的结果归纳于表2。表I
权利要求
1.一种溶液，是用于从包含RNA并且至少还包含DNA的生物样品中提取RNA的溶液，其中，包含 (a)相对于溶液的总量超过50体积％的酚、 (b)相对于溶液的总量为3 10体积％的多元醇、 (c)相对于溶液的总量为0.5 2. OM浓度的胍盐、 (d)相对于溶液的总量为0.1 0. 5M浓度的硫氰酸盐、和 (e)用于将溶液的pH值维持在4 6的缓冲剂。
2.根据权利要求1所述的溶液，其中，酚浓度相对于溶液的总量为55 65体积％。
3.根据权利要求1或2所述的溶液，其中，进一步包含用于分离水层的有机溶剂。
4.根据权利要求1 3的任一项所述的溶液，其中，生物样品是培养细胞的培养液。
5.根据权利要求1 3的任一项所述的溶液，其中，生物样品是生物的体液成分。
6.根据权利要求1 3的任一项所述的溶液，其中，生物样品是生物的血液成分。
7.从生物样品中提取RNA的方法，所述生物样品包含RNA并且至少还包含DNA，该方法包括以下工序 将所述生物样品与包含下述(a) (e)的溶液一起进行均质化的工序， (a)相对于溶液的总量超过50体积％的酚、 (b)相对于溶液的总量为3 10体积％的多元醇、 (c)相对于溶液的总量为0.5 2. OM浓度的胍盐、 (d)相对于溶液的总量为0.1 0. 5M浓度的硫氰酸盐、和 (e)用于将溶液的pH值维持在4 6的缓冲剂； 将所得的匀浆与用于分离水层的有机溶剂混合的工序； 将所得的混合物进行离心分离的工序；以及 回收离心分离所生成的、含RNA的水层的工序。
8.从生物样品中提取RNA的方法，所述生物样品包含RNA并且至少还包含DNA，该方法包括以下工序 将所述生物样品与包含下述(a) (f)的溶液一起进行均质化的工序， (a)相对于溶液的总量超过50体积％的酚、 (b)相对于溶液的总量为3 10体积％的多元醇、 (c)相对于溶液的总量为0.5 2. OM浓度的胍盐、 (d)相对于溶液的总量为0.1 0. 5M浓度的硫氰酸盐、和 (e)用于将溶液的pH值维持在4 6的缓冲剂、 (f)用于分离水层的有机溶剂； 将所得的匀浆进行离心分离的工序；以及 回收离心分离所生成的、含RNA的水层的工序。
9.根据权利要求7或8所述的方法，其中，酚浓度相对于(a) (e)的溶液的总量为55 65体积。
全文摘要
本发明公开了用于从生物样品中提取实质上纯粹的RNA的溶液。用于从包含RNA并且至少还包含DNA的生物样品中提取RNA的溶液包含(a)相对于溶液的总量超过50体积％的酚、(b)相对于溶液的总量为3～10体积％的多元醇、(c)相对于溶液的总量为0.5～2.0M浓度的胍盐、(d)相对于溶液的总量为0.1～0.5M浓度的硫氰酸盐、和(e)用于将溶液的pH值维持在4～6的缓冲剂。
文档编号C12N15/09GK103068979SQ20118003882
公开日2013年4月24日 申请日期2011年8月17日 优先权日2010年8月18日
发明者吉本真纪子, 秋山英雄, 信正均 申请人:东丽株式会社
技术领域：
本发明涉及用于从生物样品提取实质上纯粹的RNA的溶液。
背景技术：
写在DNA中的遗传信息以多种多样的组合被转录成RNA，从而生物显示复杂的表型。已经明确RNA通过种类、表达量而对生物的表型起作用，为了进行基因表达分析，从各种生物材料提取纯度高的RNA是重要的。为了实现该目标，到目前为止开发了大量的RNA提取方法。频繁被使用的RNA的分离方法有酚提取、从离液盐(chaotropic salt)溶液的沉淀、和对二氧化硅膜的吸附等。专利文献I记载了用于RNA的提取的包含2 5M的胍和40 60%的酚的溶液。通过使用该溶液，可以将这以前使用超速离心机且需要2天以上的操作以3小时有效地进行RNA提取。该方法被称为单步法。专利文献2中作为上述专利文献I所记载的方法的进一步改良，公开了用于从包含RNA、DNA和蛋白质的样品中将这些各成分同时提取而分离的提取溶液。具体地，记载了使用包含0. 5 2M的胍的浓度30 50%的酚溶液将RNA提取至水层而分离。专利文献1和2所记载的溶液，其组成不同，但均可以使用各溶液以同样的操作提取RNA。即，可以通过在各溶液中将生物组织均质化，使用氯仿等疏水性有机溶剂，将该匀浆离心而进行层分离。离心分离后，回收含RNA的最上部的水层，使用醇使RNA沉淀，并洗涤，从而提取RNA。但是,使用专利文献1和2所记载的溶液和方法分离的RNA中,额外混入(残存)有能通过逆转录-聚合酶链反应分析(RT-PCR)检出的程度的量的基因组DNA，因此存在例如在RT-PCR的情况下丧失RNA的定量性等问题(专利文献3，例如0005段)。因此，为了除去混入的DNA必须将通过这些方法分离的RNA进一步纯化。用于除去在提取的RNA样品中作为杂质而混入的DNA的一种一般方法是，将RNA样品用脱氧核糖核酸酶(DNase)处理。但是，利用DNase的处理在液层进行的情况下，处理后为了除去DNase，必须再次进行酚/氯仿提取和/或蛋白质的变性。另外，在组合二氧化硅膜柱进行提取的情况下，必须反复进行柱的洗涤操作。通过该利用DNase的处理，DNA的混入减少，但这些劳动增加，而且存在产生RNA的损失，从而RNA的提取量减少这样的问题。专利文献3中作为不进行DNase处理而避免DNA向RNA样品中混入的方法，公开了在PH值小于4的条件下使用RNA提取试剂的方法。但是，一般已知核酸在酸性下脱嘌呤化而分解，实质上分离未分解的RNA是困难的。另外，酸性下DNA对水层/有机层的溶解平衡偏向于向有机层分配，因此通过在PH值小于4的条件下使用RNA提取试剂可以期待某种程度的抑制基因组DNA混入水相的效果，但完全抑制碱基数小的DNA片段的混入是不可能的。现有技术文献专利文献
专利文献1:美国专利第4843155号专利文献2 :日本特开平5-344886号公报专利文献3 :日本特表2007-532140号公报
发明内容
发明要解决的课题如上，用于从生物样品提取RNA的现有溶液，在要求定量性的情况下，存在不能提取未混入DNA的实质上纯粹的RNA这样的课题。并且，为了除去混入的DNA，需要DNase处理等附加工序。本发明要解决这些课题，提供用于从生物样品提取实质上纯粹的RNA的溶液。用于解决课题的方法本发明者们此次对于现有的RNA提取用溶液的组成进行了研究，特别地发现了酚浓度与防止DNA的混入的效果相关，从而完成了本发明。SP，本发明提供以下[1] [9]。[1] 一种溶液，是用于从包含RNA并且至少还包含DNA的生物样品中提取RNA的溶液，其中，包含(a)相对于溶液的总量超过50体积％的酚、(b)相对于溶液的总量为3 10体积％的多元醇、(c)相对于溶液的总量为0. 5 2. 0M浓度的胍盐、(d)相对于溶液的总量为0.1 0. 5M浓度的硫氰酸盐、和(e)用于将溶液的pH值维持在4 6的缓冲剂。[2]根据[1]所述的溶液，其中，酚浓度相对于溶液的总量为55 65体积％。[3]根据[1]或[2]所述的溶液，其中，进一步包含用于分离水层的有机溶剂。[4]根据[1] [3]的任一项所述的溶液，其中，生物样品是培养细胞的培养液。[5]根据[1] [3]的任一项所述的溶液，其中，生物样品是生物的体液成分。[6]根据[1] [3]的任一项所述的溶液，其中，生物样品是生物的血液成分。[7]从生物样品中提取RNA的方法，所述生物样品包含RNA并且至少还包含DNA，该方法包括以下工序将所述生物样品与包含下述(a) (e)的溶液一起进行均质化的工序，(a)相对于溶液的总量超过50体积％的酚、(b)相对于溶液的总量为3 10体积％的多元醇、(c)相对于溶液的总量为0. 5 2. 0M浓度的胍盐、(d)相对于溶液的总量为0.1 0. 5M浓度的硫氰酸盐、和(e)用于将溶液的pH值维持在4 6的缓冲剂；将所得的匀浆与用于分离水层的有机溶剂混合的工序；将所得的混合物进行离心分离的工序；以及回收离心分离所生成的、含RNA的水层的工序。[8]从生物样品中提取RNA的方法，所述生物样品包含RNA并且至少还包含DNA，该方法包括以下工序
将所述生物样品与包含下述(a) (f)的溶液一起进行均质化的工序，(a)相对于溶液的总量超过50体积％的酚、(b)相对于溶液的总量为3 10体积％的多元醇、(c)相对于溶液的总量为0. 5 2. OM浓度的胍盐、(d)相对于溶液的总量为0.1 0. 5M浓度的硫氰酸盐、和(e)用于将溶液的pH值维持在4 6的缓冲剂、(f)用于分离水层的有机溶剂；将所得的匀浆进行离心分离的工序；以及回收离心分离所生成的、含RNA的水层的工序。[9]根据权利要求7或8所述的方法，其中，酚浓度相对于(a) (e)的溶液的总量为55 65体积。发明的效果通过使用本发明的溶液，可以从生物样品中简便地提取没有混入DNA的实质上纯粹的RNA。另外，根据本发明，不需要可造 成回收损失的DNase处理等附加处理，就可以获得在要求定量性的用途中也能够直接使用的纯度的RNA。特别是生物样品中，即使在包含非常多的RNA分解酶和/或其他夹杂物的血液等体液中，也可以高纯度地提取目的RNA。
图1是在实施例1中使用本发明的溶液从血清提取的核酸的电泳图。图2是在比较例I中使用专利文献2所记载的溶液从血清提取的核酸的电泳图。图3是在比较例2中使用专利文献I所记载的溶液从血清提取的核酸的电泳图。图4是在实施例2 5中使用本发明的溶液从血清提取的核酸的电泳图。图5是在实施例6 12中使用本发明的溶液从血清提取的核酸的电泳图。图6是在实施例13、比较例3中使用本发明的溶液、专利文献3所记载的溶液从血清提取的核酸的电泳图。图7是在实施例14中使用本发明的溶液从培养细胞提取的核酸的电泳图。图8是在实施例15、16中使用本发明的溶液从血清提取的核酸的电泳图。图9是在比较例4中使用专利文献3所记载的溶液从血清提取的核酸的电泳图。图10是在实施例17、18中使用本发明的溶液从血清提取的核酸的电泳图。
具体实施例方式本发明涉及用于从生物样品中提取RNA的溶液，其中，包含以下的(a) (e)作为其成分，(a)相对于溶液的总量超过50体积0A的酚、(b)相对于溶液的总量为3 10体积％ (3体积％以上且10体积％以下)的多元醇、(c)相对于溶液的总量为0. 5 2. OM(0. 5M以上且2. OM以下)浓度的胍盐、(d)相对于溶液的总量为0.1 0. 5M(0.1M以上且0. 5M以下)浓度的硫氰酸盐、和
(e)用于将溶液的pH值维持在4 6的缓冲剂。本发明中使用的生物样品包含RNA并且至少还包含DNA。另外，通过使用本发明的溶液，可以从上述生物样品提取实质上纯粹的RNA。这里，“实质上纯粹的RNA”是指，生物样品中当初所含的DNA被分离，实质上没有该DNA混入的RNA。RNA是否实质上纯粹，可以通过能否由电泳检出DNA来判断。例如，7 >卜 f夕7 口 -7'—株式会社制“AgilentRNA6000PicoKit” (型号 5067-1513)能够检出推荐 50pg/ u L ~ 5000pg/ u L 的核酸，因而可以使用该试剂盒来评价有无DNA混入。具体地，在将提取的核酸进行RNase处理，然后使用“Agilent RNA6000PicoKit ”进行电泳的情况下，未检测到峰时可以判断充分地抑制了 DNA混入，得到了实质上纯粹的RNA。另外，可以通过定量PCR来分析混入的DNA量，从而评价RNA的纯度。例如，使用实时PCR装置和“SYBR Green” (荧光色素)可以检出60pg的双链DNA，所以可以以此进行评价。具体地，在包含引物、DNA合成酶和“SYBR Green”的PCR反应溶液中加入提取的核酸进行PCR扩增，与预先制成的标准曲线比较，从而可以定量地分析混入的DNA量。本发明中，溶液的总量是指包含上述(a) (e)的全部的溶液的总体积。例如，相对于溶液的总量超过50体积％的酚，是指在将全成分混合之后的溶液IL中含有超过500mL的酚。另外，例如，相对于溶液的总量为0. 5 2. OM浓度的胍盐，是指溶液的终浓度为0. 5M 2. 0M,即，将各成分全部混合后的溶液IL中含有0. 5mol 2mol的胍盐。本发明的溶液包含(a)相对于溶液的总量超过50体积％的酚。明确了如果使酚浓度为与现有技术不同地超过50体积％，则具有在RNA被提取的水层作为杂质的DNA的混入减少的效果。本发明的溶液包含例如51体积％以上、52体积％以上、53体积％以上、54体积％以上或55体积％以上的酚。优选包含53体积％以上、更优选为55体积％以上的酚。另外,从在将作为本发明的溶液的其他成分的(b)多元醇、(c)0. 5 2. OM胍盐、(d)0.1
0.5M硫氰酸盐以各规定浓度均匀混和的状态下调制本发明的溶液的情况考虑，酚的浓度优选为75体积％以下，另外为了减少酚被氧化造成的影响，酚的浓度更优选为65体积％以下。优选的酚浓度的范围是将这些上限和下限任意组合而得的范围，更优选为52体积％ 65体积％、53体积％ 65体积％，特别优选为55体积％ 65体积％。本发明的溶液包含(b)相对于溶液的总量为3 10体积％的多元醇。本发明中的多元醇是具有多个羟基的脂肪族醇，可以使用能够使本发明的溶液中的(a)酚成分和(C)、
(d)的水溶液混合而作为均匀的溶液维持的多元醇。作为多元醇，优选具有2 4个羟基的碳数2 6个的脂肪族醇。可列举例如，甘油、乙二醇、丙二醇、赤藓醇等，更优选为甘油。为了将本发明的溶液作为均匀的溶液维持、使酚成分不过度分配到水层，相对于本发明的溶液的总量可以使用3 10体积％的多元醇。本发明的溶液包含(C)相对于溶液的总量为0. 5 2. OM浓度的胍盐。作为胍盐，具体优选硫氰酸胍和/或盐酸胍。胍盐具有保护RNA免受分解、在水性的溶液中使酚维持溶液状态的效果。本发明的溶液包含(d)相对于溶液的总量为0.1 0. 5M浓度的硫氰酸盐。作为硫氰酸盐，可以优选使用硫氰酸的无机盐，更优选使用硫氰酸铵、硫氰酸钠。另外，可以是多种不同硫氰酸的无机盐的混合物，例如可以优选使用硫氰酸铵与硫氰酸钠的混合物。认为硫氰酸盐增强从生物样品的RNA的提取。此外，在本发明的溶液含有硫氰酸胍的情况下，该硫氰酸胍的浓度包含在上述的胍盐的浓度中，不包含在硫氰酸盐的浓度中。本发明的溶液包含(e)用于将溶液的pH值维持在4 6的缓冲剂。作为缓冲剂，可以使用为了将PH值维持在所需的范围而通常使用的显示缓冲性的有机盐和/或无机盐。具体包含钠、钾、锂或铵的磷酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、邻苯二甲酸盐、酒石酸盐或乳酸盐等有机盐和无机盐。在这些组合中，更优选使用乙酸钠和/或柠檬酸钠。另外，也可以组合使用多种这些有机盐和/或无机盐。该缓冲剂的浓度只要对于将本发明的溶液维持在目的PH值4 6充分，就不特别限定，优选相对于本发明的溶液的总量为0. 02 0. 2M的浓度。为了调整本发明的溶液的PH值，除了缓冲剂之外，还可以适宜添加适当的酸或碱水溶液，例如盐酸或氢氧化钠溶液。为了使生物样品中的蛋白质变性而辅助目的RNA的纯化，本发明的溶液中还可以含有聚氧乙烯失水山梨糖醇、十二烷基硫酸钠、肌氨酸等表面活性剂。另外，为了防止酚的氧化，本发明的溶液中还可以含有受阻胺酚、喹啉等抗氧化剂。例如在生物样品是液体状态的情况下提取目的RNA时，本发明的溶液优选使用生物样品的I倍体积以上、优选为3倍体积以上。以下显示使用本发明的溶液提取目的RNA的步骤的例子。首先，将生物样品在本发明的溶液中均质化而形成匀浆。对均质化的方法不特别限定，除了利用涡流混合器等的搅拌、利用注射针的破碎之外，可以使用一般的匀浆器。接下来，将用于分离水层的有机溶剂加入到该匀浆中，然后将其进行离心分离。这里加入的有机溶剂优选使用匀浆的2体积％ 40体积％左右。另外离心分离通常可以在6，000 X G 20，000 X G进行3分钟 30分钟，例如在速度12，000XG的条件下在室温进行10分钟，但只要液层分离即可，对速度、温度、时间不特别限制。进行离心分离 ，作为目的的实质上纯粹的RNA被提取至水层。另一方面，DNA、蛋白质等被分离到有机层中，或在生成中间层的情况下被分离到有机层和中间层。用于分离水层的有机溶剂，是用于分离成含有使用本发明的溶液提取的目的RNA的水层、和含有DNA等的有机层和/或中间层(在生成的情况下)的液体的有机化合物。作为该有机溶剂，可以使用亲水性的程度与酚相同，或者更加疏水性的有机溶剂。例如，只要是作为显示亲水性的指标一般使用的水/辛醇分配系数CLogP的值为1. 4(酚的CLogP值)以上的有机化合物就可以使用，可以优选使用CLogP的值为1. 4 5的范围的化合物。这里，CLogP值可以使用例如“Chem Draw”(注册商标)等程序求出推算值。作为在本发明中使用的有机溶剂，可列举例如，氯仿(1. 952)、对溴苯甲醚(3. 064)、1-溴-3-氯丙烷(1. 847)、4_ 溴藜芦醚(2. 7345)、6_ 溴-1,4-苯并二wS 院(3. 0005)、1-溴-4-三氟甲氧基苯(4. 173)、1-溴-2，4-二甲氧基苯(2. 8545)、4_ 氟苯甲醚(2. 344)、4_ 溴甲苯(3. 504)、4-溴丁酸乙酯(1.772)等，但不限于此。这里，上述各有机溶剂的0中的数值是用“ChemDraw”求出的CLogP的值。用于分离上述的水层的有机溶剂添加到如上所述使用包含(a) (e)的本发明的溶液形成的匀浆中使用，但也可以预先包含在上述包含(a) (e)的本发明的溶液中。在现有的酚浓度为50%以下的溶液的情况下，如果想要预先含有该有机溶剂，则在与生物样品混和之前溶液就分离成水层和有机层2层，因此难以作为提取溶液使用，但在本发明的溶液的酚浓度下有机溶剂与本发明的溶液均匀地混和，可以作为单一的溶液保存。预先含有该有机溶剂的本发明的溶液通过在加入生物样品均质化而制成匀浆之后，立即进行离心分离，从而可以使包含RNA的水层分离。因此，与之后将有机溶剂加入匀浆的情况相比，可以使步骤非常单纯化，所以是优选的。在用于分离水层的有机溶剂预先包含在上述包含(a) (e)的本发明的溶液中的情况下，该有机溶剂的含量可以根据加入的有机溶剂的种类和溶液的酚浓度，在有机溶剂在本发明的溶液中均匀混和的范围内选定。例如，在本发明的溶液的酚浓度为65%时选择氯仿作为有机溶剂的情况下，优选含有相对于上述包含(a) (e)的溶液的总量100%为27体积％以下的任意体积。具体地，优选在上述包含(a) (e)的溶液100mL加入27mL以下的任意体积的氯仿。相对于上述包含(a) (e)的溶液的总量100%，更优选包含5 25体积％的氯仿，进一步优选包含10 20体积％的氯仿。另外，当酚浓度为58%时，氯仿相对于上述包含(a) (e)的溶液的总量100%优选包含14%以下的任意体积，更优选包含6 13体积％，进一步优选包含8 12体积％。另外，在溶液的酚浓度为65%时选择对溴苯甲醚作为有机溶剂的情况下，相对于上述包含(a) (e)的溶液的总量100%，优选包含22体积％以下的任意体积，更优选包含5 20体积％，进一步优选包含10 18体积％。另夕卜，同样地酚浓度为58%时，对溴苯甲醚相对于上述包含(a) (e)的溶液的总量100%，优选包含13体积％以下的任意体积，更优选包含3 11体积％，进一步优选包含5 9体积％。为了将使用本发明的溶液被提取至水层的RNA进一步纯化、浓缩，可以在包含RNA的水层中加入低级醇使RNA沉淀，从而回收沉淀的RNA。或者，还可以使在包含RNA的水层中加入低级醇沉淀而得的RNA吸附于能吸附RNA的担载体、例如二氧化硅膜柱，然后从担载体(柱)溶出而回收。作为这里所用的低级醇，可列举乙醇、异丙醇等。其浓度可以依据一般的核酸的乙醇沉淀、异丙醇沉淀的方法或二氧化硅膜柱等的担载体的标志物推荐浓度来确定。本发明的溶液可以通过将上述的(a) (e)以各浓度混和来制造。作为其混和的步骤不特别限制。可以根据溶液的组成预先调制高浓度的各溶液然后将它们混和。例如，预先准备6M的硫氰酸胍水溶液、6M的硫氰酸铵水溶液、IM的乙酸钠，混合至目的浓度，然后进一步加入甘油、酚和不足部分的水来调制。关于预先在上述包含(a) (e)的溶液中包含了用于分离水层的有机溶剂本发明的溶液，也可以同样地通过混合(a) (e)和该有机溶剂至所需的浓度来制造。本发明中使用的生物样品只要包含RNA并且至少还包含DNA即可，不特别限制。例如，作为要从目的RNA中分离出的杂质成分，除了 DNA以外还可以包含蛋白质。具体可列举培养细胞、培养细胞的培养液、手术切片和/或活检样品等生物体组织、生物体细胞、血液、血液成分(血清、血浆)、尿、唾液、眼泪等体液等，但不限于这些，可以使用含有RNA的任意样品。在对这些生物样品应用本发明的溶液时，在生物样品是体液等液体样品的情况下，既可以采取后直接与本发明的溶液混和，也可以用PBS和/或水稀释后与本发明的溶液混和。在生物样品是细胞团(cell pellet)和/或组织片的情况下，既可以采取后直接与本发明的溶液混和，也可以用PBS和/或水稀释后与本发明的溶液混和，但为了避免RNA的分解，在稀释的情况下更优选制成生物样品的匀浆然后用水和/或PBS稀释。生物样品中的体液、特别是血液中有时含有非常多的RNA的分解酶和/或其他夹杂物，此时通过现有的方法提取实质上纯粹的RNA是非常困难的。本发明的溶液通过使酚超过50体积％，可以有效地将蛋白质等夹杂物提取到有机层，因此可以获得纯度高的目的RNA。另外，离心分离后出现的中间层减少，可以进行明确的层分离，所以包含目的RNA的水层的分离是容易的。使用本发明的溶液提取的RNA是多个核糖核苷酸通过磷酸二酯键结合而成的核糖核酸，不受其分子量、碱基数和/或来源限定。一般地，RNA在功能分类上被分类为mRNA(信使 RNA)、tRNA(转运 RNA)、rRNA(核糖体 RNA)、ncRNA(非编码 RNA)、snRNA(核内低分子RNA)、snoRNA(核小体低分子RNA)等多个种类，但化学结构上除了分子量(碱基数)以外不知道其他差异，均包含在本发明中的RNA中。一般被称为smalI RNA (小RNA)的碱基数为15 500个碱基左右的RNA、以及一般碱基数为18 25个碱基程度的miRNA (微RNA)也包含在本发明中的RNA中。一般地，RNA与DNA的一级化学结构的主要差异是作为构成糖的核糖2’ -位的羟基(-0H)的有无，各自的碱基数越小则RNA与DNA的结构差异越小，因而通过提取来分离两者越难。但是，如果使用本发明的溶液，则即使对于被称为small RNA的碱基数比较小的RNA,也可以高纯度地进行提取。通常在DNA与RNA混合存在的状态下，使用吸光光度计或发光光度计各自区别地定量是困难的，但因为通过使用本发明的溶液可以得到实质上纯粹的RNA，所以可以使用它们进行RNA的定量。另外，通过使用本发明的溶液，在使用qRT-PCR和/或微阵列的RNA的分析中，不需要利用DNase的处理，可以在不存在由DNA的混合存在造成的噪声的状态下简便地进行分析。
实施例通过以下实施例更具体地说明本发明，但本发明的范围不限于这些实施例。〈实施例1>(I) RNA提取用溶液的调制以溶液的各成分的终浓度为以下的方式将各成分混合而调制RNA提取用的溶液。 58体积％酹*5体积％甘油 0. 8M硫氰酸胍(以水溶液混合) 0. 4M硫氰酸铵(以水溶液混合) 0.1M乙酸钠缓冲液(以水溶液混合)，调节至pH值为5。(2)从生物样品中的RNA提取使用血清作为包含RNA和DNA以及蛋白质的生物样品来进行RNA提取。将上述(I)中调制的溶液900 u L与血清300 u L进行涡流混和,从而均质化。在匀衆中加入60 y L的对溴苯甲醚进行混和，在室温下以12，000XG离心10分钟。通过离心，形成了含有RNA的水层、含有DNA和蛋白质的有机层和中间层。其中，将水层400 ii L分离至其他管中。(3a)水层的RNA的纯化、浓缩-无酶处理-在(2)所分离的含有RNA的水层中加入1. 5倍体积的100%乙醇，在作为核酸的纯化柱的“miRNeasy mini kit”(株式会社3f 了 ^ >制)的“RNeasy Mini Spin Column”中加入700 ii L，以8000XG离心15秒使核酸吸附于柱上，将通过柱的液体丢弃。重复相同操作直至乙醇混和RNA样品用完，从而使水层所含的核酸全部吸附于柱上。然后按照“miRNeasymini kit”的方案用Buffer RWT700 u L,Buffer RPE500 u L将柱洗涤2次，使柱干燥之后，用30 ii L的无RNase水溶出，从而得到纯化、浓缩的RNA样品。(3b)从水层的RNA的纯化、浓缩-有RNase处理-为了确认提取的核酸是RNAjf⑵所分离的样品进行RNase处理。在⑵所分离的含有RNA的水层中加入1. 5倍体积的100%乙醇，与(3a)同样地使核酸吸附于柱。用Buffer RWT350 u L洗涤之后，加入稀释的RNase将吸附于柱的核酸进行RNase处理，用Buffer RWT350 u L、Buffer RPE500 u L将柱洗涤2次，使柱干燥之后，用30 y L的无RNase水溶出，从而得到纯化、浓缩的RNA样品。(4)利用电泳的纯度评价将(3a)、(3b)所得的各RNA样品I y L在70°C热变性2分钟之后骤冷。使用7夕>> 卜 r 夕 7 口 '7'—株式会社制“Agilent RNA6000PicoKit” (型号 5067-1513)进行电泳。其结果不于图1。另外，通过“Bioanalyzer2100”的Smear Analysis功能计算出25_500nt的峰区域的面积，确认被检测为峰的大小的核酸量(浓度)。在(3a)的无酶处理样品中，仅确认了 1个小于200个碱基的大小的峰(道I)。另外，此时算出的核酸量为816pg/iiL。另一方面，确认(3b)的RNase处理后的样品的电泳图谱，则完全没有检测到峰(道2)。另外，计算此时的核酸量为eipg/yL。使用不含核酸的PBS代替血清，与实施例1同样地操作来确认检测系统的噪声(道3 :空白)，则此时的核酸量为63pg/i!L，由此可知道2中算出的核酸量为噪声。由以上确认，提取的核酸仅为不含DNA的RNA。此外，将其他途径合成的22 25个碱基的RNA进行电泳而得的泳动距离与本实施例所得的峰的泳动距离同等，因此认为道I所确认的RNA为22 25个碱基。将以上的结果归纳于表I。<比较例1>(1) RNA提取用溶液的调制溶液的终浓度为酚浓度50体积％，除此以外以与实施例1相同的组成调制，从而调制专利文献2所述的溶液。(2)从生物样品中的RNA提取与实施例1同样地使用血清作为生物样品来进行。(3a)水层的RNA的纯化、浓缩-无酶处理-与实施例1同样地进行。(3b)从水层的RNA的纯化、浓缩-有RNase处理-与实施例1同样地进行。(3c)从水层的RNA的纯化、浓缩-有DNase处理-在实施例1的(3b)中，用DNase代替(3b)的RNase来处理含有RNA的水层，从而得到纯化、浓缩的样品。除了以上之外，与实施例1同样地进行。(4)利用电泳的纯度评价与实施例1同样地进行。其结果示于图2。从未进行酶处理的样品检测到2个强峰(碱基数为200个碱基左右和500个碱基左右)和I个弱峰(与实施例1相同碱基数)(道I)。在有RNase处理样品中，200个碱基和500个碱基的峰基本无变化，由此明确2个峰不是RNA (道2)。另一方面，由道I所见的I个弱峰消失可与实施例1同样地确认，该峰是RNA。在DNase处理后的样品中，2个强峰消失，检测到被分解得非常短的片段(道3)，由此可知这2个强峰是混入的DNA片段。如上，在使用酚浓度为50体积％的溶液的情况下，确认了 DNA的混入，未提取到纯粹的RNA。以上的结果归纳于表3。<比较例2>(I) RNA提取用溶液的调制调制除了酚浓度为60体积％以外，与专利文献I所述的提取用溶液同样的溶液。即，终浓度为60体积％酚、2M硫氰酸胍、0.1M乙酸钠、0. 2体积％ 2-巯基乙醇，pH值为4。(2)从生物样品中的RNA提取与实施例1同样地使用血清作为生物样品来进行。(3a)水层的RNA的纯化、浓缩-无酶处理-与实施例1同样地进行。 (4)利用电泳的纯度评价与实施例1同样地进行。其结果示于图3。确认了与比较例I同样的3个峰。由此确认混入了 DNA片段。将以上的结果归纳于表3。<实施例2>(I) RNA提取用溶液的调制溶液的终浓度为酚浓度55体积％，除此以外以与实施例1相同的组成调制溶液。(2)从生物样品中的RNA提取与实施例1同样地使用血清作为生物样品来进行。(3a)水层的RNA的纯化、浓缩-无酶处理-与实施例1同样地进行。(3b)从水层的RNA的纯化、浓缩-有RNase处理-与实施例1同样地进行。(4)利用电泳的纯度评价与实施例1同样地进行。其结果示于图4。检测出与实施例1同样的峰(道I)，确认了仅高纯度的RNA被提取出。在进行了RNase处理的样品(道5 ;RNase ( + ))中减少到与空白相同的水平，由此可以确认提取的核酸仅为RNA。以上的结果归纳于表I。<实施例3 >(I)RNA提取用溶液的调制溶液的终浓度为酚浓度65体积％，除此以外以与实施例1相同的组成调制溶液。(2)从生物样品中的RNA提取与实施例1同样地使用血清作为生物样品来进行。(3a)水层的RNA的纯化、浓缩-无酶处理-
与实施例1同样地进行。(4)利用电泳的纯度评价与实施例1同样地进行。其结果示于图4的道2。检测出与实施例1同样的峰，确认了仅高纯度的RNA被提取出。以上的结果归纳于表I。<实施例4>(I) RNA提取用溶液的调制溶液的终浓度为酚浓度53体积％，除此以外以与实施例1相同的组成调制溶液。(2)从生物样品中的RNA提取与实施例1同样地使用血清作为生物样品来进行。(3a)水层的RNA的纯化、浓缩-无酶处理-与实施例1同样地进行。(4)利用电泳的纯度评价
与实施例1同样地进行。其结果示于图4的道3。检测出与实施例1同样的峰，确认了仅高纯度的RNA被提取出。以上的结果归纳于表I。<实施例5>(I) RNA提取用溶液的调制调制与实施例1相同组成的溶液。(2)从生物样品中的RNA提取在匀浆中加入240 ii L的氯仿代替60 ii L的对溴苯甲醚，除此以外与实施例1同样地使用血清作为生物样品来进行。(3a)水层的RNA的纯化、浓缩-无酶处理-与实施例1同样地进行。(4)利用电泳的纯度评价与实施例1同样地进行。其结果示于图4的道4。检测出与实施例1同样的峰，确认了仅高纯度的RNA被提取出。以上的结果归纳于表I。<实施例6>(I) RNA提取用溶液的调制调制与实施例1相同组成的溶液。(2)从生物样品中的RNA提取在匀浆中加入100 L的4-溴藜芦醚代替60 L的对溴苯甲醚，除此以外与实施例I同样地使用血清作为生物样品来进行。(3a)水层的RNA的纯化、浓缩-无酶处理-与实施例1同样地进行。(4)利用电泳的纯度评价与实施例1同样地进行。其结果示于图5的道I。检测出与实施例1同样的峰，确认了仅高纯度的RNA被提取出。
以上的结果归纳于表I。<实施例7>(I)RNA提取用溶液的调制调制与实施例1相同组成的溶液。(2)从生物样品中的RNA提取在匀浆中加入100 ii L的6-溴-1，4-苯并二'^恶烷代替60 ii L的对溴苯甲醚，除此
以外与实施例1同样地使用血清作为生物样品来进行。(3a)水层的RNA的纯化、浓缩-无酶处理-与实施例1同样地进行。(4)利用电泳的纯度评价与实施例1同样地进行。其结果示于图5的道2。检测出与实施例1同样的峰，确认了仅高纯度的RNA被提取出。以上的结果归纳于表I。
<实施例8>(I) RNA提取用溶液的调制调制与实施例1相同组成的溶液。(2)从生物样品中的RNA提取在匀浆中加入IOOiiL的1-溴-4-三氟甲氧基苯代替60 ii L的对溴苯甲醚，除此以外与实施例1同样地使用血清作为生物样品来进行。(3a)水层的RNA的纯化、浓缩-无酶处理-与实施例1同样地进行。(4)利用电泳的纯度评价与实施例1同样地进行。其结果示于图5的道3。检测出与实施例1同样的峰，确认了仅高纯度的RNA被提取出。以上的结果归纳于表I。<实施例9>(I) RNA提取用溶液的调制调制与实施例1相同组成的溶液。(2)从生物样品中的RNA提取在匀浆中加入IOOii L的1-溴_2，4-二甲氧基苯代替60 ii L的对溴苯甲醚，除此以外与实施例1同样地使用血清作为生物样品来进行。(3a)水层的RNA的纯化、浓缩-无酶处理-与实施例1同样地进行。(4)利用电泳的纯度评价与实施例1同样地进行。其结果示于图5的道4。检测出与实施例1同样的峰，确认了仅高纯度的RNA被提取出。以上的结果归纳于表I。< 实施例 10 >(I) RNA提取用溶液的调制
调制与实施例1相同组成的溶液。(2)从生物样品中的RNA提取在匀浆中加入IOOiiL的4-氟苯甲醚代替60 ii L的对溴苯甲醚，除此以外与实施例I同样地使用血清作为生物样品来进行。(3a)水层的RNA的纯化、浓缩-无酶处理-与实施例1同样地进行。(4)利用电泳的纯度评价与实施例1同样地进行。其结果示于图5的道5。检测出与实施例1同样的峰，确认了仅高纯度的RNA被提取出。以上的结果归纳于表2。< 实施例 11 >(I) RNA提取用溶液的调制调制与实施例1相同组成的溶液。(2)从生物样品中的RNA提取
在匀浆中加入IOOii L的4-溴甲苯代替60ii L的对溴苯甲醚，除此以外与实施例1同样地使用血清作为生物样品来进行。(3a)水层的RNA的纯化、浓缩-无酶处理-与实施例1同样地进行。(4)利用电泳的纯度评价与实施例1同样地进行。其结果示于图5的道6。检测出与实施例1同样的峰，确认了仅高纯度的RNA被提取出。以上的结果归纳于表2。< 实施例 12 >(I) RNA提取用溶液的调制调制与实施例1相同组成的溶液。(2)从生物样品中的RNA提取在匀浆中加入IOOii L的4-溴丁酸乙酯代替60ii L的对溴苯甲醚，除此以外与实施例I同样地使用血清作为生物样品来进行。(3a)水层的RNA的纯化、浓缩-无酶处理-与实施例1同样地进行。(4)利用电泳的纯度评价与实施例1同样地进行。其结果示于图5的道7。检测出与实施例1同样的峰，确认了仅高纯度的RNA被提取出。以上的结果归纳于表2。< 实施例 13 >(I) RNA提取用溶液的调制调制在实施例1所调制的溶液中加入盐酸，从而将溶液的pH值调整为4. 2而得的溶液。(2)从生物样品中的RNA提取
与实施例1同样地使用血清作为生物样品来进行。(3a)水层的RNA的纯化、浓缩-无酶处理-与实施例1同样地进行。(4)利用电泳的纯度评价与实施例1同样地进行。其结果示于图6的道I。即使溶液的pH值为4. 2也检测出与实施例1同样的峰，可知仅RNA被高纯度地提取出。以上的结果归纳于表2。<比较例3 >(I) RNA提取用溶液的调制调制在比较例I所调制的溶液中加入盐酸，从而将溶液的pH值调整为3. 6而得的溶液。(2)从生物样品中的RNA提取
与实施例1同样地使用血清作为生物样品来进行。(3a)水层的RNA的纯化、浓缩-无酶处理-与实施例1同样地进行。(4)利用电泳的纯度评价与实施例1同样地进行。其结果确认了与图6的道2所示的比较例I同样的3个峰。由此确认，在使用酚浓度为50体积％的溶液的情况下，即使pH值为3. 6，也混入DNA片段。以上的结果归纳于表3。< 实施例 14 >(I) RNA提取用溶液的调制调制与实施例1相同组成的溶液。(2)从生物样品中的RNA提取作为生物样品，使用悬浮在PBS300 U L中的培养细胞(HE K 293细胞)来代替实施例I的300 u L的血清，除此以外与实施例1同样地进行。(3a)水层的RNA的纯化、浓缩-无酶处理-除了加入水层的乙醇量不是1. 5倍体积、而是1. 25倍体积以外，与实施例1同样地进行。(3b)从水层的RNA的纯化、浓缩-有RNase处理-除了加入水层的乙醇量不是1. 5倍体积、而是1. 25倍体积以外，与实施例1同样地进行。(4)利用电泳的纯度评价作为所使用的试剂盒使用“AgilentRNA6000NanoKit”(型号 5067-1511) ( 7 >>卜 f夕7 口夕一社制)代替“Agilent RNA6000PicoKit”，除此以外与实施例1同样地
进行。其结果示于图7。确认了在(3a)的无酶处理样品中，18S、28S核糖体RNA几乎不被分解(RIN值2.3)地被提取出(道I)。计算此时的核酸量为79ng/iiL。另外，(3b)的用RNase处理后的样品的结果与实施例1同样完全未检测到峰(道2)。计算此时的核酸量为4ng/iiL。另夕卜，确认完全不流入样品时的检测系统的噪声(道3)，则这时的核酸量为2ng/ii L，由此认为道2的核酸量为噪声。由以上确认，提取的核酸全部是RNA。以上的结果归纳于表2。〈实施例15 >(I) RNA提取用溶液的调制以溶液的各成分的终浓度为以下那样，将各成分混合而调制RNA提取用的溶液。即，相对于与实施例1相同组成的溶液900 y L，进一步加入60 y L的对溴苯甲醚调制溶液。*58 体积 ％酹*5体积％甘油 0. 8M硫氰酸胍(以水溶液混合) 0. 4M硫氰酸铵(以水溶液混合) 0.1M乙酸钠缓冲液(以水溶液混合)、调整至pH值为5 相对于上述的总量100%为6. 6体积％的对溴苯甲醚(2)从生物样品中的RNA提取 将上述(I)所调制的溶液900 U L和血清300 U L进行涡流混和从而均质化。在室温以12，000XG离心10分钟。通过离心形成了含有RNA的水层、含有DNA和蛋白质的有机层和中间层。其中，将水层350 ii L分离至其他管中。(3a)水层的RNA的纯化、浓缩-无酶处理-与实施例1同样地进行。(3b)从水层的RNA的纯化、浓缩-有RNase处理-与实施例1同样地进行。(4)利用电泳的纯度评价与实施例1同样地进行。其结果示于图8的道1、3、5。检测出与实施例1同样的峰，可知仅RNA被高纯度地提取出(道I)。有RNase处理(道3;RNase( + ))时减少到与空白(道5)相同的水平，由此可以确认提取的核酸仅为RNA。以上的结果归纳于表2。< 实施例 16 >(I) RNA提取用溶液的调制以溶液的各成分的终浓度为以下那样，将各成分混合而调制RNA提取用的溶液。即，对与实施例1相同组成的溶液900 u L进一步加入90 ii L的氯仿来调制溶液。.58 体积 ％酚*5体积％甘油 0. SM硫氰酸胍(以水溶液混合) 0. 4M硫氰酸铵(以水溶液混合) 0.1M乙酸钠缓冲液(以水溶液混合)、调整至pH值为5 相对于上述的总量100 %为10体积％的氯仿
(2)从生物样品中的RNA提取
将上述(I)所调制的溶液900 U L和血清300 U L进行涡流混和从而均质化。在室温以12，000XG离心10分钟。通过离心，形成了含有RNA的水层、含有DNA和蛋白质的有机层和中间层。其中，将水层350 u L分离到其他的管中。(3a)水层的RNA的纯化、浓缩-无酶处理-与实施例1同样地进行。(3b)从水层的RNA的纯化、浓缩-有RNase处理-与实施例1同样地进行。(4)利用电泳的纯度评价与实施例1同样地进行。其结果示于图8的道2、4、5。检测出与实施例1同样的峰，可知仅RNA被高纯度地提取出(道2)。有RNase处理(道4;RNase( + ))时减少到与空白(道5)相同的水平，由此可以确认提取的核酸仅为RNA。以上的结果归纳于表2。<比较例4>(I) RNA提取用溶液的调制
除了酚浓度为55体积％以外，调制与比较例3相同组成的溶液。(2)从生物样品中的RNA提取与实施例1同样地使用血清作为生物样品来进行。(3a)水层的RNA的纯化、浓缩-无酶处理-与实施例1同样地进行。(3b)从水层的RNA的纯化、浓缩-有RNase处理-与实施例1同样地进行。(4)利用电泳的纯度评价与实施例1同样地进行。其结果示于图9。(3a)的无酶处理样品中检测到与实施例1相比略宽阔的峰(道I)，另外在(3b)的RNase处理的样品中也检测到峰(道2)。由有RNase处理(RNase ( + ))时也可到大于空白(道2)的峰可以确认除RNA以外的核酸(DNA)的混入。以上的结果归纳于表3。< 实施例 17 >(I) RNA提取用溶液的调制溶液的终浓度为pH值4，除此以外以与实施例1相同的组成调制溶液。(2)从生物样品中的RNA提取与实施例1同样地使用血清作为生物样品来进行。(3a)水层的RNA的纯化、浓缩-无酶处理-与实施例1同样地进行。(3b)从水层的RNA的纯化、浓缩-有RNase处理-与实施例1同样地进行。(4)利用电泳的纯度评价与实施例1同样地进行。其结果示于图10(道1、2、5)。
检测出与实施例1同样的峰，确认了仅高纯度的RNA被提取出(道I)。有RNase处理(道2 ;RNase( + ))时减少到与空白(道5)相同的水平，由此可以确认提取的核酸仅为 RNA。以上的结果归纳于表2。< 实施例 18 >(I) RNA提取用溶液的调制溶液的终浓度为pH值6，除此以外以与实施例1相同的组成调制溶液。(2)从生物样品中的RNA提取与实施例1同样地使用血清作为生物样品来进行。(3a)水层的RNA的纯化、浓缩-无酶处理-与实施例1同样地进行。(3b)从水层的RNA的纯化、浓缩-有RNase处理-与实施例1同样地进行。
(4)利用电泳的纯度评价与实施例1同样地进行。其结果示于图10(道3、4、5)。检测出与实施例1同样的峰，确认了仅高纯度的RNA被提取出(道3)。有RNase处理(道4;RNase( + ))时减少到与空白(道5)相同的水平，由此可以确认提取的核酸仅为 RNA。以上的结果归纳于表2。表I
权利要求
1.一种溶液，是用于从包含RNA并且至少还包含DNA的生物样品中提取RNA的溶液，其中，包含 (a)相对于溶液的总量超过50体积％的酚、 (b)相对于溶液的总量为3 10体积％的多元醇、 (c)相对于溶液的总量为0.5 2. OM浓度的胍盐、 (d)相对于溶液的总量为0.1 0. 5M浓度的硫氰酸盐、和 (e)用于将溶液的pH值维持在4 6的缓冲剂。
2.根据权利要求1所述的溶液，其中，酚浓度相对于溶液的总量为55 65体积％。
3.根据权利要求1或2所述的溶液，其中，进一步包含用于分离水层的有机溶剂。
4.根据权利要求1 3的任一项所述的溶液，其中，生物样品是培养细胞的培养液。
5.根据权利要求1 3的任一项所述的溶液，其中，生物样品是生物的体液成分。
6.根据权利要求1 3的任一项所述的溶液，其中，生物样品是生物的血液成分。
7.从生物样品中提取RNA的方法，所述生物样品包含RNA并且至少还包含DNA，该方法包括以下工序 将所述生物样品与包含下述(a) (e)的溶液一起进行均质化的工序， (a)相对于溶液的总量超过50体积％的酚、 (b)相对于溶液的总量为3 10体积％的多元醇、 (c)相对于溶液的总量为0.5 2. OM浓度的胍盐、 (d)相对于溶液的总量为0.1 0. 5M浓度的硫氰酸盐、和 (e)用于将溶液的pH值维持在4 6的缓冲剂； 将所得的匀浆与用于分离水层的有机溶剂混合的工序； 将所得的混合物进行离心分离的工序；以及 回收离心分离所生成的、含RNA的水层的工序。
8.从生物样品中提取RNA的方法，所述生物样品包含RNA并且至少还包含DNA，该方法包括以下工序 将所述生物样品与包含下述(a) (f)的溶液一起进行均质化的工序， (a)相对于溶液的总量超过50体积％的酚、 (b)相对于溶液的总量为3 10体积％的多元醇、 (c)相对于溶液的总量为0.5 2. OM浓度的胍盐、 (d)相对于溶液的总量为0.1 0. 5M浓度的硫氰酸盐、和 (e)用于将溶液的pH值维持在4 6的缓冲剂、 (f)用于分离水层的有机溶剂； 将所得的匀浆进行离心分离的工序；以及 回收离心分离所生成的、含RNA的水层的工序。
9.根据权利要求7或8所述的方法，其中，酚浓度相对于(a) (e)的溶液的总量为55 65体积。
全文摘要
本发明公开了用于从生物样品中提取实质上纯粹的RNA的溶液。用于从包含RNA并且至少还包含DNA的生物样品中提取RNA的溶液包含(a)相对于溶液的总量超过50体积％的酚、(b)相对于溶液的总量为3～10体积％的多元醇、(c)相对于溶液的总量为0.5～2.0M浓度的胍盐、(d)相对于溶液的总量为0.1～0.5M浓度的硫氰酸盐、和(e)用于将溶液的pH值维持在4～6的缓冲剂。
文档编号C12N15/09GK103068979SQ20118003882
公开日2013年4月24日 申请日期2011年8月17日 优先权日2010年8月18日
发明者吉本真纪子, 秋山英雄, 信正均 申请人:东丽株式会社
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1访客 来自[江苏省常州市电信] 2018年12月06日 08:41现在我们做提取实验，一般都是使用试剂盒提取，比较方便，简单，凯杰，biog都用过，biog要比凯杰提取时间上早半个小时。
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