专利名称：抗狂犬病的广谱狂犬病病毒属病毒疫苗的制作方法
技术领域：
本公开涉及重组狂犬病病毒及其用作广谱狂犬病病毒属病毒疫苗来防止狂犬病病毒属病毒感染的用途。
背景技术：
狂犬病病毒属(Lyssavirus)是单分子负链RNA病毒目(Mononegavirales)(具有单链、反义基因组的病毒)中弹状病毒科(Rhabdoviridae)的成员。在恒温动物和人类中，狂犬病病毒属病毒是狂犬病脑炎的病原(Tordo et al. , “Lyssaviruses” In Fauquetet al. eds. Virus taxonomy: the classification and nomenclature of viruses. The8thReport of the International Committee on Taxonomy of Viruses. San Diego: OxfordAcademic，2006，pages623_629;World Health Organization Expert Consultation onRabies，5_80ctober2004，first report, World Health Organization Technical reportseries931, Geneva:World Health Organization, 2005，pagesl5_19)。狂犬病病毒属的种包括狂犬病病毒(RABV，基因型I)、拉各斯蝙蝠病毒(Lagos bat viioisXLBV，基因型2)、莫可拉病毒(Mokola virus) (M0KV，基因型 3)、杜文海格病毒(Duvenhage virus) (DUVV，基因型4)、欧洲蝙蝠狂犬病病毒-1 (European bat lyssavirus-1) (EBLV-1，基因型5)、欧洲蝙幅狂犬病病毒-2 (European bat lyssavirus-2) (EBLV-2，基因型6)、澳大利亚蝙幅狂犬病病毒(Australian bat lyssavirus) (ABLV，基因型7)和从中亚和俄罗斯蝙蝠中分离出的4个其他种(Aravan病毒-ARAV、Khujand病毒-KHUV、Irkut病毒-1RKV和西高加索蝙幅病毒(West Caucasian bat virus)-WCBV) (Kuzmin et al. , Emerg.1nfect. Dis. 14(12) :1887-1889, 2008;Weyer et al.，Epidemiol.1nfect. 136:670-678，2007;Kuzmin andRupprechtj iiBat rabies，，In Rabies, 2nd Edition, New York，Academic Press，2007，pages259-307，Jackson and Wunnerj eds.)。基于狂犬病病毒属病毒分离株的系统发生、免疫原性和毒力，已提出狂犬病病毒属病毒的两个遗传谱系(Bactane et al.，J. Virol. 75:3268-3276，2001 )。遗传谱系的划分一般与对狂犬病病毒属病毒观察到的疫苗交叉保护模式相关狂犬病病毒属病毒(Badraneet al.，J. Virol. 75: 3268-3276，2001; Hanlon et al.，Virus Res.1ll:44-54，2005;Nelet al.，Expert Rev. Vaccines4:553-540，2005)。遗传谱系 I 包括基因型 1、4、5、6 和 7 以及 ARAV、KHUV 和 IRKV (Kuzmin et al. ,Virus Res. 97:65-79, 2003;Kuzmin et al. ,VirusRes. 111:28-43, 2005; Hanlon et al. ,Virus Res.1ll :44_54，2005)。目前可用的商业疫苗和生物制品被认为可有效抗这个谱系中的病毒感染(Nel et al.，Expert Rev.Vaccines4:553-540, 2005)。然而，这些用于狂犬病的疫苗和生物制品不能提供抗狂犬病病毒属病毒谱系I之外的病毒(即，基因型2和3)感染的完全保护。此外，WCBV是公认的最不同的狂犬病病毒属病毒并呈现有限的与基因型2和3病毒的关联性。先前的研究已表明，抗RABV的血清与WCBV没有或几乎没有交叉中和反应(Botvinkin et al. , Emerg.1nfect.Dis. 9:1623-1625, 2003;Hanlon et al. , Virus Res.1ll :44-54, 2005)。因此，需要开发狂犬病疫苗，这种疫苗可以抗广谱的狂犬病病毒属病毒，尤其是WCBV和狂犬病病毒属基因型2和3，以提供保护。
发明内容
本文公开了具有来自至少两种不同狂犬病病毒属病毒的糖蛋白基因的重组狂犬病病毒。所公开的病毒可以用作广谱狂犬病病毒属病毒疫苗以提供抗多种基因型的狂犬病病毒属病毒感染的保护。本文提供了重组狂犬病病毒。在一些实施方案中，所述重组狂犬病病毒的基因组包括狂犬病病毒核蛋白(N)、磷蛋白(P)、基质蛋白(M)、RNA依赖性RNA聚合酶(L)和糖蛋白(G)的基因和至少一个、至少两个或至少三个不同的异源狂犬病病毒属病毒糖蛋白基因。在一些实施方案中，所述狂犬病病毒属病毒选自LBV、MOKV、DUVV、EBLV-1、EBLV-2、ABLV、ARAV、KHUV、IRKV和WCBV。在具体的实施方案中，所述狂犬病病毒属病毒选自LBV、MOKV和WCBV0还提供了一种包括全长的狂犬病病毒基因组反义DNA的载体。在一些实施方案中，所述基因组反义DNA包括狂犬病病毒N基因、P基因、M基因、L基因和G基因，并且所述载体还包括至少一个、至少两个或至少三个不同的异源狂犬病病毒属病毒G基因。还提供了包含本文描述的狂犬病病毒载体的细胞。还提供了包括一种或多种本文描述的重组狂犬病病毒和可药用载体的组合物。还提供了通过给予受试者一种或多种本文公开的重组狂犬病病毒在所述受试者中诱发抗狂犬病病毒属病毒的免疫应答的 方法。从下面参照附图的具体实施方式
，本发明的上述以及其他目的、特征和优点将变得更加明显。
图1A :ERA转录质粒的示意图。图示了锤头状核酶和ERA反义基因组的位置。沿5’至3’方向示出了N蛋白、P蛋白、M蛋白、G蛋白和L蛋白的相对位置。图1B :构建全长ERA狂犬病病毒基因组cDNA质粒pTMF的示意图。示出了 RT-PCR产物Fl和F2片段，以及限制性内切酶识别位点(Nhel，Kpnl，Blpl，Pstl和Notl)。标出了RdRz-锤头状核酶和HDVRz- 丁型肝炎病毒核酶。菱形符号表示Kpnl或Pstl位点被删除，垂直箭头表示Nhel或Notl被完整保留。图2 :示意性图示的提出的机制是PNLST7质粒的NLST7RNA聚合酶自身基因作用。DNA转染试剂复合物通过内吞作用被摄入细胞。从溶酶体和内涵体释放的大部分DNA保留在细胞质中。有限量的质粒被转运到细胞核1)通过CMV极早期启动子，NLST7基因由细胞RNA聚合酶II转录；2)成熟的NLST7mRNA被从细胞核运送到细胞质，用于NLST7RNA聚合酶合成；3)新合成的NLST7RNA聚合酶被转运到细胞核中，而微量的NLST7被保留在细胞质中；4)NLST7RNA聚合酶通过PT7启动子起始转录。通过转录后修饰，产生用于蛋白合成的另外的NLST7mRNA，因而提高病毒恢复效率。图3:10个衍生ERA病毒基因组的示意图。每个基因的大小不是按比例绘制的。符号表示第333位氨基酸残基(本文中称为G333)处G的突变，“ Ψ ”标出Psi区域。图4 :构建ERA-3G的示意图。将G333突变引入至ERA的主链并加入两个转录(trans)单元。将这些转录单元引入至P基因和M基因之间以及G基因和L基因之间。将MOKV G基因和WCBV G基因克隆至这些转录单元内以形成具有三个糖蛋白基因的重组ERA狂犬病病毒(ERA-3G)。图5 :构建ERA-4G的示意图。将G333突变引入至ERA主链并加入三个转录(trans)单元。将这些转录单元引入至N基因和P基因之间、P基因和M基因之间以及G基因和L基因之间。将LBV G基因、MOKV G基因和WCBV G基因克隆至这些转录单元内以形成具有四个糖蛋白基因的重组ERA狂犬病病毒(ERA-4G)。序列表使用标准核苷酸碱基字母缩写和氨基酸的三字母代码(如在37C. F. R.1. 822中所定义的)显示所附序列表中列出的核酸序列和氨基酸序列。只显示每个核酸序列的一条链，但应理解互补链通过提及所示链而被包括在内。在所附序列表中SEQ ID NO:1是通过反向遗传学复原的重组狂犬病病毒ERA的核苷酸序列。所述重组病毒的第4370-4372位核苷酸已从aga变为gag (相对于野生型病毒)，这在G蛋白第333位残基上引入了从Arg到 Glu的氨基酸改变。 SEQ ID NO: 2是狂犬病病毒ERA N蛋白的氨基酸序列。SEQ ID NO: 3是狂犬病病毒ERA P蛋白的氨基酸序列。SEQ ID NO: 4是狂犬病病毒ERA M蛋白的氨基酸序列。SEQ ID NO: 5是第333位氨基酸突变(从Arg至Glu)的狂犬病病毒ERA G蛋白的
氨基酸序列。SEQ ID NO: 6是狂犬病病毒ERA L蛋白的氨基酸序列。SEQ ID NO:7是野生型狂犬病病毒ERA G蛋白的氨基酸序列。SEQ ID NO: 8_11是用于扩增全长狂犬病病毒基因组cDNA的RT-PCR引物的核苷酸序列。SEQ ID NO: 12_15是用于合成锤头状核酶和丁型肝炎病毒核酶的寡核苷酸序列。SEQ ID NO: 16-40是PCR引物的核苷酸序列。SEQ ID NO:41和42是用于整合异源ORF的转录单元的核苷酸序列。SEQ ID NO:43和44是用于扩增MOKV G基因的RT-PCR引物的核苷酸序列。SEQ ID NO:45和46是用于扩增WCBV G基因的RT-PCR引物的核苷酸序列。SEQ ID NO:47和48分别是MOKV G的核苷酸和氨基酸序列。SEQ ID NO:49和50分别是WCBV G的核苷酸和氨基酸序列。SEQ ID N0:51和52是用于扩增LBV G基因的RT-PCR引物的核苷酸序列。SEQ ID NO:53和54分别是LBV G的核苷酸和氨基酸序列。
具体实施方式
1.缩写ABLV 澳大利亚蝙蝠狂犬病病毒ARAV Aravan 病毒CMV巨细胞病毒DFA直接荧光抗体DUVV 杜文海格病毒EBLV-1 欧洲編fe狂犬病病毒_1EBLV-2 欧洲蝙蝠狂犬病病毒_2ERAEvelyn-Rokitnick1-AbelsethFFU蚀斑形成单位G糖蛋白1.m.肌肉注射IRES内部核糖体进入位点IRKVIrkut 病毒KHUV Khujand 病毒LRNA依赖性RNA聚合酶LBV拉各斯蝙蝠病毒M基质蛋白MOKV 莫克拉病毒N核蛋白NLS核定位信号ORF开放阅读框P磷蛋白PAGE 聚丙烯酰胺凝胶电泳RABV 狂犬病病毒RNP核糖核蛋白RABV 狂犬病病毒WCBV 西高加索蝙蝠病毒I1.术语和方法除非另有说明，技术术语依其常规用法使用。分子生物学中的常用术语的定义可见于 Benjamin Lewin, Gene V,由 Oxford University Press 出版，1994(ISBN0-19-854287-9) ；Kendrew 等(eds.) ,The Encyclopedia of Molecular Biology,由 Blackwell Science Ltd.出版，1994 (ISBN0-632-02182-9)和 Robert A. Meyers(ed. ) , Molecular Biology and Biotechnology:a Comprehensive Desk Reference,由VCH Publishers, Inc.出版，1995 (ISBN1-56081-569-8)。为了有助于阅读本公开的各个实施方案，提供了对具体术语的如下解释佐剂可非特异增强对抗原的免疫应答的物质或载体。佐剂可包括吸附了抗原的矿物质(如明矾、氢氧化铝或磷酸盐)悬浮物；或油包水乳剂，其中抗原溶液乳化在矿物油(例如弗氏不完全佐剂)中，有时包含灭活的分支杆菌(弗氏完全佐剂)以进一步增强抗原性。免疫刺激寡核苷酸(如包含CpG基序的那些)也可被用作佐剂(例如，参见美国专利 No. 6，194，388,6, 207，646,6, 214，806,6, 218，371,6, 239，116,6, 339，068,6, 406，705 和6，429，199)。佐剂还包括生物分子，如共刺激分子。示例性的生物佐剂包括IL-2、RANTES、GM-CSF, TNF- a、IFN- y、G-CSF, LFA-3、CD72、B7-1、B7-2、0X-40L 和 41BBL。给予本文所用的向受试者给予组合物例如疫苗是指给予、施用或使组合物与所述受试者接触。给药可通过很多途径中的任一种来完成，例如，局部的、口服的、皮下的、肌肉的、腹膜内的、静脉内的、鞘内的和肌肉的。动物有生命的多细胞脊椎生物，种类包括例如哺乳动物和鸟类。术语哺乳动物包括人和非人哺乳动物。术语“动物”包括人受试者和兽受试者。例如，人、非人灵长类、狗、猫、马、浣熊、蝙蝠、大鼠、小鼠，狐狸、松鼠、负鼠、土狼、狼和牛。抗体包括一种或多种多肽的蛋白(或蛋白复合体)，所述多肽基本上由免疫球蛋白基因或免疫球蛋白基因片段编码。已知的免疫球蛋白基因包括K、λ、α、Υ、δ、ε和μ恒定区基因以及大量的免疫球蛋白可变区基因。轻链分类为K或λ。重链分类为Υ、μ、α、δ或ε，这些重链又反过来分别定义免疫球蛋白的种类IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。基本免疫球蛋白(抗体)结构单元通常是四聚体。每个四聚体由两对相同的多肽链组成，每对具有一个“轻链”(约25kDa)和一个“重链”(约50-70kDa)。每条链的N-端限定了约100至110或更多个氨基酸的可变区域，所述可变区域主要负责抗原识别。术语“可变轻链(' )”和“可变重链(Vh ) ”分别是指这些轻链和重链。本文所用的术语“抗体”包括完整的免疫球蛋白以及许多很好表征的片段。例如，结合目标蛋白(蛋白或融合蛋白内表位)的Fab、Fv和单链Fv (scFvs)也可以是所述目标蛋白(或表位)的特异性结合物质。这些抗体片段如下所示(I) Fab，包含抗体分子的单价抗原结合片段的片段，其是通过用木瓜蛋白酶消化完整抗体以产生完整轻链和一条重链的一部分而产生的；(2) Fab’，通过用胃蛋白酶处理完整抗体，之后还原以产生完整轻链和部分重链而得到的抗体分子片段；每个`抗体分子得到两个Fab’片段；(3) (Fab’)2，将完整的抗体用胃蛋白酶处理后未经之后的还原得到的抗体片段；(4) F (ab’)2，是两个Fab’片段通过两个二硫键连接在一起的二聚体；(5)Fv，含有表达为2条链的轻链可变区和重链可变区的基因工程片段；(6)单链抗体，含有由合适的多肽接头连接在一起的轻链可变区、重链可变区的基因工程分子，其为基因融合的单链分子形式。制备这些抗体片段的方法是常规的方法(参见，例如，Harlow 和 Lane, Using Antibodies:A Laboratory Manual, CSHL, NewYork, 1999)。抗体结合亲和力是指单个抗体结合位点与配体(例如，抗原或表位)之间的结合强度。抗体结合位点X对配体Y的亲合力由解离常数(Kd)表示，解离常数是指占据溶液中存在的一半结合位点X所需要的Y的浓度。Kd越小表示X与Y之间的亲和相互作用越强或越高，也表示占据所述位点所需的配体浓度越低。通常，抗体互补位所识别的表位中，一个或多个氨基酸的改变、修饰和/或替代会影响抗体结合亲和力。结合亲和力可以使用本领域已知的任何技术来测量，例如Ag-ELISA测定中的终点滴定。抗原能够在动物体内刺激抗体产生或T细胞应答的化合物、组合物或物质，包括被注射或吸收进入动物体内的组合物。抗原与特异性体液免疫或细胞免疫的产物反应，所述产物包括由异源免疫原诱导的那些。
反义基因组在具有负链RNA基因组(如狂犬病病毒属病毒的基因组)病毒的情形中，“反义基因组”是指负链基因组的互补链(正链)。减毒的在活病毒例如狂犬病病毒的情形中，如果它感染细胞或受试者的能力和/或产生疾病的能力降低(例如，被消除)，则所述病毒是减毒的。通常，减毒病毒保留至少一些在给予有免疫能力的受试者后诱发免疫应答的能力。在一些情况下，减毒病毒能够诱发保护性免疫应答而不引起任何的感染迹象或症状。表位抗原决定簇。它们是分子上具有抗原性(即诱发特异性免疫应答)的特定化学基团，如连续或不连续的肽序列。基于抗体的三维结构和表位的匹配(或同源)三维结构，抗体可结合特定的抗原性表位。Evelyn-Rokitnick1-Abelseth (ERA):狂犬病病毒 ERA 株衍生自Street-Alabama-Dufferin (SAD)株，SAD株是1935年在阿拉巴马州(美国)从一只疯狗中首次分离出来的。ERA株衍生自在小鼠大脑、幼仓鼠肾(BHK)细胞和鸡胚胎中多次传代之后的SAD狂犬病病毒。融合蛋白通过表达由编码两个不同(异源)蛋白的至少一部分的核酸序列经基因工程得到的核酸序列而产生的蛋白。为形成融合蛋白，所述核酸序列必须在相同的阅读框内并且在所述阅读框内无终止密码子。异源的本文所用的“异源核酸序列”是来自不同来源、种或株的核酸序列。在本文所描述的一些实施方案中，所述异源核酸序列是编码狂犬病病毒ERA以外的狂犬病病毒属病毒的糖蛋白的核酸序列狂犬病病毒属病毒。在重组ERA狂犬病病毒的情形中，异源核酸序列是非来自ERA狂犬病病毒的任何核酸序列。免疫应答免疫系统的 细胞例如B细胞、T细胞、巨噬细胞和多形核白细胞对刺激(如抗原)的应答。免疫应答可以包括参与宿主防御反应的任何身体细胞，包括例如，分泌干扰素或细胞因子的上皮细胞。免疫应答包括但并不限于先天免疫应答或炎症。本文所用的保护性免疫应答是指可保护受试者不受感染(防止感染或防止感染相关疾病的发生)的免疫应答。免疫保护受试者免受疾病(例如，感染性疾病)，例如通过接种疫苗。免疫原在适合条件下能够刺激在动物体内免疫应答(如抗体产生或T细胞应答)的化合物、组合物或物质，包括被注射或吸收进入动物体内的组合物。本文所用的“免疫原性组合物”是包括免疫原的组合物。免疫原性组合物可用于刺激或诱发脊椎动物特异性免疫应答(或免疫原性应答)的组合物。在一些实施方案中，免疫原性组合物包括重组狂犬病病毒，例如表达一种或多种异源糖蛋白(如来自MOKV、LBV或WCBV的糖蛋白)的重组狂犬病病毒。在一些实施方案中，免疫原性应答是保护性的，或者可提供保护性免疫，因为它使动物更好地抗所述免疫原性组合物所针对的病原体(例如，狂犬病病毒和其他狂犬病病毒属病毒)的感染和/或所述病原体所致疾病的发展。一种类型的免疫原性组合物的一个具体实例是疫苗。在一些实施方案中，免疫原性组合物的“有效量”或“免疫刺激量”是当给予受试者时足以产生可检测的免疫应答的量。这样的应答可以包括例如产生对所述免疫原性组合物中提供的一个或多个表位特异的抗体。或者，所述应答可以包括对所述免疫原性组合物中提供的一个或多个表位的辅助性T细胞应答或基于CTL的应答。在其他实施方案中，免疫原性组合物的“保护性有效量”是当给予动物时足以赋予所述动物保护性免疫的量。抑制或治疗疾病抑制疾病或病症的充分发展，例如在处于疾病风险的受试者中。疾病的一个具体实例是狂犬病。“治疗”是指在疾病或病理状态开始出现之后改善其征兆或症状的治疗性介入。本文所用的术语“改善”当述及疾病、病理状态或症状时是指所述治疗的任何可观察到的有益效果。有益效果可例如被以下方面所证实在易感受试者中所述疾病临床症状的推迟发生、所述疾病的一些或全部临床症状严重程度的减轻、所述疾病发展趋缓、所述疾病复发次数的减少、所述受试者整体健康状况改善或者所述具体疾病特异性的本领域熟知的其他参数。分离的“分离的”或“纯化的”生物组分(如核酸、肽、蛋白质、蛋白复合体或颗粒)已基本上从所述组分天然产生的生物体的细胞的其他生物组分中(B卩，其他的染色体DNA和RNA、染色体外DNA和RNA以及蛋白质)分离、分开而产生或纯化出来。已被“分离的”或“纯化的”核酸、肽和蛋白质因此包括通过常规的纯化方法纯化的核酸和蛋白质。所述术语还包括通过在宿主细胞内重组表达而制备的核酸、肽和蛋白质，以及化学合成的核酸或蛋白质。术语“分离的”或“纯化的”不要求绝对的纯度，而是意在作为一个相对术语。因此，举例来说，分离的生物组分是其生物组分比其细胞内天然环境或其他生产容器中的生物组分更富集。优选地，对制剂进行纯化，使得所述生物组分占所述制剂的总生物组分含量的至少50%，如至少70%、至少90%、至少95%或更高。标签可检测的化合物或组合物，所述化合物或组合物是直接或间接地与另一分子缀合以方便检测所述分子。标签的具体非限制性施例包括荧光标记、酶联物和放射性同位素。狂犬病病毒属(Lyssavirus):单分子负链RNA病毒目(Mononegavirales)(具有单链、反义基因组的病毒)内弹状病毒科(Rhabdoviridae)中的病毒属。狂犬病病毒属病毒是温血动物和人的狂犬病脑炎的病原。狂犬病病毒属病毒的种包括狂犬病病毒(RABV，基因型I)、拉各斯蝙蝠病毒(LBV，基因型2)、莫可拉病毒(M0KV，基因型3)、杜文海格病毒(DUVV，基因型4)、欧洲蝙蝠狂犬病病毒-1 (EBLV-1，基因型5)、欧洲蝙蝠狂犬病病毒-2 (EBLV-2,基因型6)、澳大利亚蝙蝠狂犬病病毒(ABLV，基因型7)和从中亚和俄罗斯蝙蝠中分离出的4个其他物种(Aravan病毒-ARAV、Khujand病毒-KHUV、Irkut病毒-1RKV和西高加索蝙 fe病毒-WCBV) (Kuzmin et al. , Emerg.1nfect. Dis. 14 (12) : 1887-1889，2008; Weyeret al. , Epidemiol.1nfect. 136:670-678, 2007;Kuzmin and Rupprecht, “Bat rabies，，InRabies, 2nd Edition, New York, Academic Press, 2007, pages 259-307, Jackson andffunner, eds. XORF (开放阅读框):编码氨基酸的没有任何终止密码子的一系列核苷酸三联体(密码子)。这些序列通常可被翻译成肽。可操作连接当第一核酸序列与第二核酸序列以有功能关系放置时，第一核酸序列就与第二核酸序列可操作连接。例如，如果启动子影响编码序列的转录或表达，那么启动子可操作连接到编码序列。通常，可操作连接的DNA序列是连续的，并在必要时将两个蛋白编码区在相同的阅读框内连接。如果存在内含子，可操作连接的DNA序列可以是不连续的。可药用载体 可用于本公开的可药用载体是常规的。Remington’sPharmaceuticalSciences, by E. ff. Martin, Mack Publishing Co. , Easton, PA,第 15 版(1975 年)描述了适用于药物递送一种或多种治疗性化合物或分子、蛋白或结合这些蛋白的抗体、病毒或载体和其他药剂的组合物和制剂。通常，所述载体的性质将依赖于所采用的具体给药方式。例如，肠胃外制剂通常包括可注射的流体，所述流体包括药学上和生理上可用的流体，例如水、生理盐水、平衡盐溶液、葡萄糖水溶液、甘油或类似载体。对于固体组合物(例如，粉剂、丸剂、片剂或胶囊形式)，常规的非毒性的固体载体可以包括例如药物级的甘露糖醇、乳糖、淀粉或硬脂酸镁。除了生物中性载体之外，用于给药的药物组合物可以含有少量无毒的辅助物质，如润湿剂或乳化齐U、防腐剂、pH缓冲剂等，例如乙酸钠或脱水山梨糖醇单月桂酸酯。质粒能够在宿主细胞中自主复制的环形核酸分子。多肽其中单体是通过酰胺键连接在一起的氨基酸残基的聚合物。当氨基酸是α -氨基酸时，不论L-光学异构体还是D-光学异构体都可以使用，对于许多生物用途优选L-异构体。本文所用的术语“多肽”或“蛋白质”意在包括任何氨基酸分子并包括修饰的氨基酸分子。术语“多肽”特别地意在包括天然存在的蛋白质，以及重组或合成产生的蛋白质。保守氨基酸置换是发生时对原始蛋白性质影响最小的氨基酸置换，也就是说，所述蛋白的结构，特别是功能，是保守的，不会被这样的置换显著改变。保守置换的实例显示如下。
权利要求
1.一种重组狂犬病病毒，其中，所述狂犬病病毒的基因组包括狂犬病病毒核蛋白(N)、磷蛋白(P)、基质蛋白(M)、RNA依赖性RNA聚合酶(L)和糖蛋白(G)的基因以及至少两个不同的异源狂犬病病毒属病毒糖蛋白基因，其中所述狂犬病病毒属病毒选自拉各斯蝙蝠病毒(LBV)、莫克拉病毒(MOKV)、杜文海格病毒(DUVV)、欧洲蝙蝠狂犬病病毒-1 (EBLV-1)、欧洲蝙蝠狂犬病病毒-2 (EBLV-2)、澳大利亚蝙蝠狂犬病病毒(ABLV)、Aravan病毒(ARAV)、Khujand病毒(KHUV), Irkut病毒(IRKV)和西高加索蝙蝠病毒(WCBV)。
2.权利要求1的重组狂犬病病毒，其中所述狂犬病病毒属病毒选自LBV、MOKV和WCBV。
3.权利要求1的重组狂犬病病毒，所述狂犬病病毒包括两个不同的异源狂犬病病毒属病毒G基因。
4.权利要求3的重组狂犬病病毒，其中所述两个异源G基因是MOKVG基因和WCBV G基因。
5.权利要求4的重组狂犬病病毒，其中所述MOKVG基因的核苷酸序列与SEQ ID NO:47的核苷酸序列至少95%相同，所述WCBV G基因的核苷酸序列与SEQ ID NO:49的核苷酸序列至少95%相同。
6.权利要求4的重组狂犬病病毒，其中所述MOKVG基因包括SEQ ID NO:47的核苷酸序列，所述WCBV G基因包括SEQ ID NO:49的核苷酸序列。
7.权利要求1的重组狂犬病病毒，所述重组狂犬病病毒包括三个不同的异源狂犬病病毒属病毒G基因ο
8.权利要求7的重组狂犬病病毒，其中所述三个异源G基因是LBVG基因、MOKV G基因和WCBV G基因。
9.权利要求8的重组狂犬病病毒，其中所述MOKVG基因的核苷酸序列与SEQ ID NO:47的核苷酸序列至少95%相同；WCBV G基因的核苷酸序列与SEQ ID NO:49的核苷酸序列至少95%相同；LBV G基因的核苷酸序列与SEQ ID NO:53的核苷酸序列至少95%相同。
10.权利要求8的重组狂犬病病毒，其中所述MOKVG基因包括SEQ ID NO: 47的核苷酸序列；所述WCBV G基因包括SEQ ID NO:49的核苷酸序列；所述LBV G基因包括SEQ IDNO:53的核苷酸序列。
11.权利要求1的重组狂犬病病毒，其中一个异源G基因位于狂犬病病毒P基因和M基因之间。
12.权利要求1的重组狂犬病病毒，其中一个异源G基因位于狂犬病病毒G基因和L基因之间。
13.权利要求1的重组狂犬病病毒，其中一个异源G基因位于狂犬病病毒N基因和P基因之间。
14.权利要求3的重组狂犬病病毒，其中所述异源G基因位于狂犬病病毒P基因和M基因之间以及狂犬病病毒G基因和L基因之间。
15.权利要求7的重组狂犬病病毒，其中所述异源G基因位于狂犬病病毒N基因和P基因之间、狂犬病病毒P基因和M基因之间以及狂犬病病毒G基因和L基因之间。
16.权利要求1的重组狂犬病病毒，其中所述基因组来自狂犬病病毒ERA株。
17.权利要求16的重组狂犬病病毒，其中所述ERA株基因组的核苷酸序列包括与SEQID NO:1至少95%相同的序列ο
18.权利要求16的重组狂犬病病毒，其中所述ERA株基因组的核苷酸序列包括SEQIDNO:1。
19.权利要求1的重组狂犬病病毒，其中所述狂犬病病毒糖蛋白在第333位氨基酸包括Glu (SEQ ID N0:5)。
20.一种载体，所述载体包括全长狂犬病病毒反义基因组DNA，其中所述反义基因组DNA包括狂犬病病毒N基因、P基因、M基因、L基因和G基因，和至少两个不同的异源狂犬病病毒属病毒G基因，其中所述狂犬病病毒属病毒选自LBV、MOKV, DUVV, EBLV-1、EBLV-2、ABLV、ARAV、KHUV、IRKV 和 WCBV。
21.权利要求20的载体，其中所述狂犬病病毒属病毒选自LBV、M0KV和WCBV。
22.权利要求20的载体，所述载体包括两个不同的异源狂犬病病毒属病毒G基因。
23.权利要求22的载体，其中所述两个异源G基因是MOKVG基因和WCBV G基因。
24.权利要求23的载体，其中所述MOKVG基因的核苷酸序列与SEQ ID NO:47的核苷酸序列至少95%相同，所述WCBV G基因的核苷酸序列与SEQ ID NO:49的核苷酸序列至少95%相同。
25.权利要求23的载体，其中所述MOKVG基因包括SEQ ID NO: 47的核苷酸序列；所述WCBV G基因包括SEQ ID NO: 49的核苷酸序列。
26.权利要求20的载体，所述载体括三个不同的异源狂犬病病毒属病毒G基因。
27.权利要求26的载体，其中所述三个异源G基因是LBVG基因、MOKV G基因和WCBVG基因。
28.权利要求27的载体，其中所述MOKVG基因的核苷酸序列与SEQ ID NO:47的核苷酸序列至少95%相同；所述WCBV G基因的核苷酸序列与SEQ ID NO:49的核苷酸序列至少95%相同；所述LBV G基因的核苷酸序列与SEQ ID NO:53的核苷酸序列至少95%相同。
29.权利要求27的载体，其中所述MOKVG基因包括SEQ ID NO: 47的核苷酸序列；所述WCBV G基因包括SEQ ID NO:49的核苷酸序列；并且所述LBV G基因包括SEQ ID NO: 53的核苷酸序列。
30.权利要求20的载体，其中一个异源G基因位于狂犬病病毒P基因和M基因之间。
31.权利要求20的载体，其中一个异源G基因位于狂犬病病毒G基因和L基因之间。
32.权利要求20的载体，其中一个异源G基因位于狂犬病病毒N基因和P基因之间。
33.权利要求22的载体，其中所述异源G基因位于狂犬病病毒P基因和M基因之间以及狂犬病病毒G基因和L基因之间。
34.权利要求26的载体，其中所述异源G基因位于狂犬病病毒N基因和P基因之间、狂犬病病毒P基因和M基因之间以及狂犬病病毒G基因和L基因之间。
35.权利要求20的载体，其中所述反义基因组DNA来自狂犬病病毒ERA株。
36.权利要求35的载体，其中所述ERA株反义基因组DNA的核苷酸序列包括与SEQIDNO:1至少95%相同的序列。
37.权利要求35的载体，其中所述ERA株反义基因组DNA的核苷酸序列包括SEQIDNO:1。
38.一种细胞，所述细胞包含权利要求20-37任一项中的载体。
39.一种组合物，所述组合物包括权利要求1-19任一项的重组狂犬病病毒和可药用载体。
40.权利要求39的组合物，所述组合物还包括佐剂。
41.权利要求1-19任一项的重组狂犬病病毒在制备用于在受试者中诱发抗狂犬病病毒属病毒的免疫应答的药剂中的用途。
42.权利要求39或40中的组合物在制备用于在受试者中诱发抗狂犬病病毒属病毒的免疫应答的药剂中的用途。
43.权利要求41或42的用途，其中在所述受试者中抗狂犬病病毒属病毒的免疫应答保护所述受试者免受至少三种不同基因型的狂犬病病毒属病毒的感染。
44.权利要求41或42的用途，其中在所述受试者中抗狂犬病病毒属病毒的免疫应答保护所述受试者免受至少四种不同基因型的狂犬病病毒属病毒的感染。
45.权利要求1-19任一项的重组狂犬病病毒,用于在受试者中诱发抗狂犬病病毒属病毒的免疫应答的方法中。
全文摘要
本文描述了重组狂犬病病毒，所述重组狂犬病病毒编码狂犬病病毒糖蛋白和至少一种来自另一种狂犬病病毒属病毒例如莫克拉病毒、拉各斯蝙蝠病毒和/或西高加索蝙蝠病毒的异源糖蛋白。在具体的实施方案中，所述重组狂犬病病毒包括两种或三种异源的狂犬病病毒属病毒糖蛋白。所公开的重组狂犬病病毒可以用作广谱狂犬病病毒属病毒疫苗以提供抗引起狂犬病的狂犬病病毒属病毒的保护。
文档编号C12N15/47GK103068985SQ201180040773
公开日2013年4月24日 申请日期2011年6月23日 优先权日2010年6月24日
发明者吴贤福, C·E·鲁普雷希特, I·V·库兹明 申请人:美国政府(由卫生和人类服务部、疾病控制和预防中心的部长所代表)