专利名称：人胚胎干细胞的分化的制作方法
技术领域：
本发明提供促进多能干细胞分化成胰岛素产生细胞的方法。具体地讲，本发明提供了产生细胞群的方法，其中所述群体中大于80%的细胞表达定形内胚层谱系特征性标志物。
背景技术：
用于I型糖尿病的细胞替代疗法的进展以及可移植胰岛的缺乏已使得注意力集中在开发适于移植物移入的胰 岛素产生细胞或β细胞的来源上。一种方法是从多能干细胞，例如胚胎干细胞产生功能性β细胞。在脊椎动物的胚胎发育中，多能干细胞可在称为原肠胚形成的过程中产生包括三个胚层(外胚层、中胚层和内胚层)的细胞群。诸如甲状腺、胸腺、胰腺、肠和肝脏之类的组织将从内胚层，经由中间阶段发育而来。该过程中的中间阶段是形成定形内胚层。定形内胚层细胞可表达多种标志物，如HNF3P、GATA4、MIXLl、CXCR4和S0X17。定形内胚层分化成胰腺内胚层导致形成胰腺。胰腺内胚层细胞表达胰-十二指肠同源盒基因roxi。在不存在roxi时，胰腺形成腹胰芽和背胰芽后不再发育。因而，pdxi表达标志着胰腺器官发生中的一个关键步骤。除了其它细胞类型，成熟的胰腺还包括外分泌组织和内分泌组织。外分泌和内分泌组织来自胰腺内胚层的分化。据报道，从小鼠的胚胎细胞衍生了带有胰岛细胞特征的细胞。例如，Lumelsky等人(Science《科学》292:1389，2001)报道了小鼠胚胎干细胞向类似于胰岛的胰岛素分泌结构的分化。Soria等人(Diabetes《糖尿病》49:157，2000)报道了衍生自小鼠胚胎干细胞的胰岛素分泌细胞使链脲佐菌素诱导的糖尿病小鼠中的血糖变正常。在一个例子中，Hori等人(PNAS《美国科学院院刊》99 =16105,2002)公开了用磷脂酰肌醇3-激酶抑制剂(LY294002)处理小鼠胚胎干细胞产生了类似β细胞的细胞。在另一个例子中，Blyszczuk等人(PNAS《美国科学院院刊》100 =998,2003)报道了从组成型表达Pax4的小鼠胚胎干细胞生成胰岛素产生细胞。Micallef等人报道说，视黄酸可调节胚胎干细胞定向形成TOXl阳性胰腺内胚层。在对应于胚胎的原肠胚形成末期的期间，加入胚胎干细胞分化第4天的培养物中时视黄酸在诱导Pdxl方面最有效(Diabetes《糖尿病》54 =301,2005)。Miyazaki等人报道了过表达Pdxl的小鼠胚胎干细胞系。他们的结果显示，夕卜源Pdxl表达在所得的分化细胞中明显增强了胰岛素、生长抑素、葡萄糖激酶、神经元素3、p48、Pax6 和 Hnf6 基因的表达(Diabetes《糖尿病》53:1030，2004)。Skoudy等人报道了激活素A(TGF-13超家族的成员)能上调小鼠胚胎干细胞中的胰腺外分泌基因(P48和淀粉酶)和内分泌基因(Pdxl、胰岛素和胰高血糖素)的表达。使用InM激活素A观察到最大效应。他们还观察到胰岛素和PdxlmRNA的表达水平不受视黄酸的影响；然而，3nM FGF7处理导致了 Pdxl的转录水平升高(Biochem.J.《生物化学杂志》379 =749,2004)。Shiraki等人研究了能特征性增强胚胎干细胞分化成TOXl阳性细胞的生长因子的效果。他们观察到，TGF-β 2可再现地产生更高比例的roxi阳性细胞(Genes Cells.2005年 6 月；10(6) =503-16)。
Gordon等人阐明了在没有血清存在有激活素连同Wnt信号传导抑制剂存在的情况下从小鼠胚胎干细胞诱导短尾蛋白(brachyury)[阳性]/HNF30 [阳性]内胚层细胞(US2006/0003446A1)。Gordon等人(PNAS《美国科学院院刊》，第103卷，第16806页，2006)声称“Wnt和TGF-β /nodal/激活素信号传导同时为生成前原条所必需的”。然而，胚胎干细胞发育的小鼠模型可能不会完全模拟高等哺乳动物(例如人)中的发育程序。Thomson等人从人胚泡分离了胚胎干细胞(Science《科学》282:114,1998)。同时，Gearhart和其同事从胎儿生殖腺组织衍生了人胚胎生殖(hEG)细胞系(Shamblott等人，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA《美国科学院院刊》95:13726，1998)。与可简单通过与白血病抑制因子(LIF) —起培养来防止分化的小鼠胚胎干细胞不一样，人胚胎干细胞必须维持在非常特殊的条件下(美国专利N0.6，200，806 ；W099/20741 ；W001/51616)。D’Amour等人描述了在高浓度激活蛋白和低血清的存在下产生人胚胎干细胞衍生的定形内胚层的富集培养物(Nature BiOteChnOlOgy2005)。将这些细胞移植到小鼠的肾囊下，导致分化成具有某些内胚层器官的特性的更成熟细胞。在加入FGF-10之后，人胚胎干细胞衍生的定形内胚层细胞可进一步分化成I3DXl阳性细胞(US2005/0266554A1)。D，Amour 等人.(Nature Biotechnology《自然生物技术》-24,1392-1401 (2006))声称:“我们已开发出使人胚胎干(hES)细胞转化成能够合成胰腺激素胰岛素、胰高血糖素、生长抑素、胰多肽和生长激素释放肽的内分泌细胞的分化方法。该方法通过引导细胞经过类似于定形内胚层、肠管内胚层、胰腺内胚层和内分泌前体的阶段转变为表达内分泌激素的细胞来模拟体内胰腺器官发生”。在另一个例子中，Fisk等人报道了用于从人胚胎干细胞产生胰岛细胞的系统(US2006/0040387A1)。在该情形中，分化途径分成三个阶段。使用丁酸钠和激活素A混合物将人类胚胎干细胞首先分化成内胚层细胞。随后将该细胞用TGF-β拮抗剂例如头蛋白与EGF或乙胞素的混合物培养以生成roxi阳性细胞。通过烟酰胺诱导终末分化。因此，仍明显需要开发生成表达胰岛素的功能细胞的体外方法，所述细胞更密切地类似β细胞。本发明采取替代方法，通过生成细胞群来提高使人胚胎干细胞向胰岛素表达细胞分化的效率，其中所述群体中大于80%的细胞表达定形内胚层谱系特征性标志物。
发明内容
在一个实施例中，本发明提供了细胞群，其中所述群体中大于80%的细胞表达定形内胚层谱系特征性标志物。
在一个实施例中，本发明提供了生成细胞群的方法，其中所述群体中大于80%的细胞表达定形内胚层谱系特征性标志物，所述方法包括以下步骤:a.培养多能干细胞群，b.使所述多能干细胞群在葡萄糖浓度不超过10.5mM的培养基中分化成细胞群，其中所述群体中大于80%的细胞表达定形内胚层谱系特征性标志物。
图1显示了根据实例I中公开的方法分化的，人胚胎干细胞系Hl的细胞中指示的蛋白质表达的FACS分析。图2显示了培养基葡萄糖浓度对根据实例2中公开的方法分化的，人胚胎干细胞系Hl的细胞中的CXCR4表达水平(小图B)以及细胞数目或活力(小图B)的作用。图3显示了培养基葡萄糖浓度对根据实例2中公开的方法分化的，人胚胎干细胞系Hl的细胞中的CXCR4表达水平和培养物外观(小图A)、和S0X17表达的作用。图4显示了根据 实例2中公开的第一种方法分化的，人胚胎干细胞系Hl的细胞中指示的基因表达的实时PCR分析。图5显示了根据实例2中公开的第二种方法分化的，人胚胎干细胞系Hl的细胞中指示的基因表达的实时PCR分析。图6显示了在实例2中公开的方法的第I到4天时，在暴露于细胞24小时后多种培养基的pH水平。图7显示了培养基pH水平对根据实例3中公开的第二种方法分化的，人胚胎干细胞系Hl的细胞中指示的基因表达的作用。图8显示了根据实例4中公开的方法分化的，人胚胎干细胞系Hl的细胞中指示的基因表达的实时PCR分析。
具体实施例方式将本发明的具体实施方式
部分分成以下几个分部分，来描述或说明本发明的某些特征、实施例或应用，这是为了使公开内容清楚起见，并非限制本发明。定义干细胞是由它们在单细胞水平上既自我更新又分化产生子代细胞的能力来定义的未分化细胞，包括自我更新祖细胞、非更新祖细胞和末端分化细胞。干细胞的特征还在于:其具有在体外由多种胚层(内胚层、中胚层和外胚层)分化成各种细胞谱系的功能细胞以及移植后产生多种胚层的组织和注入胚泡后基本上有助于大部分(如果不是所有的话)组织形成的能力。干细胞根据其发育潜能分为:(I)全能，指能够产生所有的胚胎和胚胎外细胞类型；(2)多能，指能够产生所有的胚胎细胞类型；(3)专能，指能够产生细胞谱系的亚群，但所有细胞谱系都只分布于特定组织、器官或生理系统内(例如造血干细胞(HSC)可产生的后代细胞包括:HSC(自我更新)、局限于血细胞的寡能祖细胞以及作为血液正常组分的所有细胞类型和成分(如血小板));(4)寡能，指能够产生比专能干细胞更有限的细胞谱系亚群；以及(5)单能，指能够产生单一细胞谱系(如生精干细胞)。
分化是未特化的(“未定向的”)或特化不足的细胞获得特化细胞(如神经细胞或肌肉细胞)的特征的过程。分化的细胞或诱导分化的细胞是已经在细胞谱系中占据更特化的(“定向的”)位置的细胞。术语“定向的”当应用到分化的过程时，指在分化途径中已经进行到这么一种程度的细胞:在正常环境下，它会继续分化成特定的细胞类型或细胞类型子集，且在正常环境下不能分化成另一细胞类型或回复到分化程度较低的细胞类型。去分化指细胞回复到细胞谱系当中特化(或定向)程度较低的地位的过程。如本文所用，“细胞谱系”限定细胞的遗传关系，即它来自哪些细胞和它能产生什么细胞。细胞谱系将细胞定位于发育和分化的遗传计划内。谱系特异性标志物是指与所关注谱系的细胞表型特异性相关并能够用于评价非定向细胞向所关注谱系的分化的特征。如本文所用，“表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞”或“第I阶段细胞”或“第I阶段”是指表达至少一种下列标志物的细胞:SOX17、GATA4、HNF3 0、GSC、CERl、Nodal、FGF8、短尾蛋白、Mix样同源盒蛋白、FGF4Q348、脱中胚蛋白(eomesodermin, E0MES)、DKK4、FGF17、GATA6、CXCR4、C-Kit、CD99或0TX2。表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞包括原条前体细胞、原条细胞、中内胚层细胞和定形内胚层细胞。本文所用的“表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞”是指表达至少一种下列标志物的细胞:PDX1、NKX6.1、HNFl β、PTFl α、HNF6、HNF4 α、S0X9、ΗΒ9 或 PROXl。表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞包括胰腺内胚层细胞、原肠管细胞和后前肠细胞。如本文所用，“定形内胚层”指具有在原肠胚形成过程中从上胚层产生的细胞的特性并形成胃肠道及其衍生物的细胞。定形内胚层细胞表达下列标志物:HNF3i3、GATA4、S0X17、Cerberus、0TX2、goosecoid、C-Kit, CD99 和 MIXLl。如本文所用，“标志物”是在所关注细胞中差异表达的核酸或多肽分子。关于这一点，差异表达意指阳性标志物的水平增加，而阴性标志物的水平降低。与其它细胞相比，所关注细胞中的核酸或多肽标志物的可检测水平足够高或足够低，使得可以使用本领域已知的多种方法识别所关注 细胞，并将所关注细胞与其它细胞区相区分。本文所用的“胰腺内分泌细胞”或“胰激素表达细胞”或“表达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞”是指能够表达至少一种下列激素的细胞:胰岛素、胰高血糖素、生长抑素和胰多肽。多能干细胞的分离、扩增和培养多能干细胞的表征多能干细胞可表达阶段特征性胚胎抗原(SSEA) 3和4以及可用称为Tra-1_60和Tra-1-81的抗体检测的标志物中的一种或多种(Thomson等人,Science《科学》282:1145,1998)。多能干细胞体外分化导致丧失SSEA-4、Tral-60和Tral_81的表达(如果存在的话)，并增加SSEA-1的表达。未分化的多能干细胞通常具有碱性磷酸酶活性，该酶可通过用4%多聚甲醛固定细胞，然后用Vector Red作为底物显影来检测，如生产商所描述(VectorLaboratories, Burlingame Calif)。未分化的多能干细胞通常也表达0CT4和TERT,这可通过RT-PCR检测。增殖的多能干细胞的另一理想表型是分化成所有三个胚层即内胚层、中胚层和外胚层组织的细胞的潜能。多能干细胞的多能性可例如通过这样来证实:将细胞注射进重症联合免疫缺陷(SCID)小鼠中，用4%多聚甲醛固定所形成的畸胎瘤，然后对它们进行组织学检验以确定是否存在来自三个胚层的细胞类型。作为另外一种选择，可以通过产生胚状体并评估胚状体中三个胚层相关的标志物的存在来确定多能性。可以使用标准G带技术并比较已公布的相应灵长类物种的核型来分析增殖的多能干细胞系的核型。希望获得具有“正常核型”的细胞，其意指细胞为整倍体，其中所有人染色体都存在并且没有明显的改变。多能干细胞的来源可使用的多能干细胞的类型包括从妊娠后形成的组织衍生而来的确立多能细胞系，包括在妊娠期间任何时间取得的胚前组织(例如胚泡)、胚胎组织或胎儿组织，所述时间通常是但不一定是在大约10至12周妊娠前。非限制性的例子是已确立的人胚胎干细胞系或人胚胎生殖细胞系 ，例如人胚胎干细胞系H1、H7和H9 (WiCell)。还可设想的是，在此类细胞的初始建立或稳定期间使用本公开的组合物，在此情况下，源细胞将是直接取自源组织的原代多潜能细胞。另外合适的是取自已在不存在饲养细胞的情况下培养的多能干细胞群的细胞。同样合适的是突变型人胚胎干细胞系，例如BGOlv (BresaGen, Athens, GA)。
在一个实施例中，人胚胎干细胞如Thomson等人所述制备(美国专利N0.5，843，780 !Science《科学》282:1145，1998 ；Curr.Top.Dev.Biol.《发育生物学当代课题》38:133ff.，1998 ；Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.《美国科学院院刊》92:7844,1995)。多能干细胞的培养在一个实施例中，在饲养细胞层上培养多能干细胞，饲养细胞可以多种方式支持多能干细胞。作为另一种选择，在培养系统中培养多能干细胞，所述培养系统基本上不含饲养细胞，但同样支持多能干细胞的增殖而不会进行实质分化。使用通过此前培养另一细胞类型而调理过的培养基来支持多能干细胞在无饲养细胞的培养物中生长而不分化。作为另一种选择，用化学成分确定的培养基来支持多能干细胞在无饲养细胞的培养物中生长而不分化。在一个实施例中，可以根据如下文献中公开的方法在小鼠胚胎成纤维细胞饲养细胞层上培养多能干细胞:Reubinoff等人(Nature Biotechnology《自然生物技术》18:399-404(2000))。作为另外一种选择，可以根据如下文献中公开的方法在小鼠胚胎成纤维细胞饲养细胞层上培养多能干细胞=Thompson等人(Science《科学》1998年11月6日:第282卷，第5391期，第1145-1147页)。作为另外一种选择，可以在如下文献中公开的任何一种饲养细胞层上培养多能干细胞:Richards等人(Stem Cells《干细胞》21 =546-556,2003)。在一个实施例中，可以根据如下文献中公开的方法在人饲养细胞层上培养多能干细胞:Wang等人(Stem Cells《干细胞》23:1221-1227，2005)。在一个替代实施例中，可以在如下文献中公开的人饲养细胞层上培养多能干细胞:Stojkovic等人(Stem Cells《干细胞》200523 =306-314,2005)。作为另外一种选择，可以在如下文献中公开的人饲养细胞层上培养多能干细胞:Miyamoto等人(Stem Cells《干细胞》22:433_440，2004)。作为另外一种选择，可以在如下文献中公开的人饲养细胞层上培养多能干细胞=Amit等人(Biol.Reprod《繁殖生物学》68:2150-2156，2003)。作为另外一种选择，可以在如下文献中公开的人饲养细胞层上培养多能干细胞=Inzunza等人(Stem Cells《干细胞》23:544_549，2005)。在一个实施例中，可以在根据US20020072117公开的方法所得培养基中培养多能干细胞。作为另外一种选择，可以在根据US6642048公开的方法所得培养基中培养多能干细胞。作为另外一种选择，可以在根据W02005014799公开的方法所得培养基中培养多能干细胞。作为另外一种选择，可以在根据如下文献公开的方法所得培养基中培养多能干细胞:Xu等人(Stem Cells《干细胞》22:972_980，2004)。作为另外一种选择，可以在根据US20070010011公开的方法所得培养基中培养多能干细胞。作为另外一种选择，可以在根据US20050233446公开的方法所得培养基中培养多能干细胞。作为另外一种选择，可以在根据US6800480公开的方法所得培养基中培养多能干细胞。作为另外一种选择，可以在根据W02005065354公开的方法所得培养基中培养多能干细胞。在一个实施例中，可以在W02005065354公开的培养基中培养多能干细胞。作为另外一种选择，可以在W 02005086845公开的培养基中培养多能干细胞。在一个实施例中，可以根据如下文献中公开的方法在人饲养细胞层上培养多能干细胞:Cheon 等人(BioReprod《繁殖生物学》DOI:10.1095/biolreprod.105.046870,2005年10月19日)。作为另外一种选择，可以根据如下文献公开的方法培养多能干细胞:Levenstein等人(Stem Cells《干细胞》24:568-574, 2006)。作为另外一种选择，可以根据US20050148070公开的方法培养多能干细胞。作为另外一种选择，可以根据US20050244962公开的方法培养多能干细胞。作为另外一种选择，可以根据W02005086845公开的方法培养多能干细胞。可将多能干细胞接种至合适的培养基质上。在一个实施例中，合适的培养基质是胞外基质成分，例如衍自基底膜的成分，或者可形成黏着分子受体-配体偶联物的一部分的成分。在一个实施例中，合适的培养基材是MATRIGEL/' (Becton Dickenson)。MaTRIGELu'是得自Engelbreth-Holm Swarm肿瘤细胞的可溶性制剂,其在室温下胶凝而形成重构的基底膜。其它的细胞外基质组分和组分混合物适合作为替代物。取决于所扩增的细胞类型，这可包括单独的层粘连蛋白、纤连蛋白、蛋白聚糖、巢蛋白、硫酸乙酰肝素等或者它们的各种组合。可在存在可促进细胞存活、增殖和保持理想特性的培养基存在的情况下，以合适的分布将多能干细胞接种于所述基质上。所有这些特性可得益于对接种分布的认真考虑并可容易地由本领域技术人员确定。合适的培养基可用如下组分制备，例如达尔伯克氏改良伊格尔培养基(DMEM)，Gibco货号11965-092 ;敲除达尔伯克氏改良伊格尔培养基(K0 DMEM)，Gibco货号 10829-018 ；Ham ' s F12/50 % DMEM 基础培养基；200mM L-谷氨酰胺，Gibco 货号15039-027 ;非必需氨基酸溶液，Gibco 11140-050 ； β -巯基乙醇，Sigma货号Μ7522 ;人重组碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)，Gibco货号13256-029。由多能干细胞形成表达定形内胚层i普系特征性标志物的细胞本发明提供了由多能干细胞群形成表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞群的方法。在一个实施例中，本发明提供了使表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞进一步分化成表达胰腺内胚层谱系的细胞的方法。在一个实施例中，这通过利用分布分化方案来达到，其中多能干细胞群首先分化成表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞群。接下来，使表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞群随后分化成表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞群。接下来，使表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞群随后分化成表达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞群。本发明提供了细胞群，其中大于80%的细胞表达定形内胚层谱系特征性标志物。细胞群可以进一步处理，以形成表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞群。表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞群可以进一步处理，以形成表达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞群。可通过将处理过的细胞群暴露于可特异性识别由表达所需细胞类型特征性标志物的细胞表达的蛋白质标志物的试剂(例如抗体)来确定分化效率。用于评估蛋白质标志物和核酸标志物在培养的或分离的细胞中的表达的方法是本领域的标准方法。这些包括定量反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、Northern印迹、原位杂交(参见例如，Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel 等人编辑,2001增刊))以及免疫测定法，例如分段材料的免疫组织化学分析，Western印迹、以及用于未受损细胞中容易获得的标志物的流式细胞分析(FACS)(参见例如Harlow和Lane的“Using Antibodies:A Laboratory Manual，，,New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress (1998))。多能干细胞的特征是本领域技术人员熟知的，并且其它特征有待继续辨别。多能干细胞标志物包括(例如)一种或多种如下物质的表达:ABCG2、CRIPT0、F0XD3、Connexin43、Connexin45、0CT4、S0X2、Nanog、hTERT、UTFl、ZFP42、SSEA-3、SSEA-4、Tral-60、Tral-81o在用本发明方法处理多能干细胞后，可通过将处理过的细胞群暴露于特异性识别由表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞表达的蛋白质标志物(例如CXCR4)来进行纯化。适用于本发明的多能干细胞包括例如人胚胎干细胞系H9 (NIH编码:WA09)、人胚胎干细胞系Hl (NIH编码:WA01)、人胚胎干细胞系H7(NIH编码:WA07)和人胚胎干细胞系SA002(CellartiS，瑞典)。同样适用于本发明的是表达至少一种下列多能细胞特征性标志物的细胞:ABCG2、cripto、CD9、F0XD3、C0NNEXIN43、C0NNEXIN45、0CT4、S0X2、Nanog, hTERT、UTF1、ZFP42、SSEA-3、SSEA-4、Tral-60 和 Tra1-81。定形内胚层谱系特征性标志物选自S0X17、GATA4、HNF3P、GSC、CERl、Nodal、FGF8、短尾蛋白、Mix样同源盒蛋白、FGF4、⑶48、脱中胚蛋白(EOMES)、DKK4、FGF17、GATA6、CXCR4、C-Kit,⑶99和0TX2。适用于本发明的是表达至少一种定形内胚层谱系特征性标志物的细胞。在本发明的一个方面，表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞为原条前体细胞。在一个替代方面，表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞为中内胚层细胞。在一个替代方面，表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞为定形内胚层细胞。胰腺内胚层谱系特征性标志物选自PDX1、NKX6.UHNFl β ,PTFl a、HNF6、HNF4a、S0X9、HB9和PR0X1。适用于本发明的是表达至少一种胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞。在本发明的一个方面，表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞为胰腺内胚层细胞。 胰腺内分泌谱系特征性标志物选自NGN3、NEUR0D、ISLU PDXU NKX6.1、PAX4、NGN3和PTF-1 a。在一个实施例中，胰腺内分泌细胞能够表达以下激素中的至少一种:胰岛素、胰高血糖素、生长抑素和胰多肽。适用于本发明的是表达至少一种胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞。在本发明的一个方面，表达胰腺内分泌系特征性标志物的细胞为胰腺内分泌细胞。胰腺内分泌细胞可为表达胰激素的细胞。作为另外一种选择，胰腺内分泌细胞可为分泌胰激素的细胞。在本发明的一个方面，胰腺内分泌细胞是表达β细胞谱系特征性标志物的细胞。表达β细胞谱系特征性标志物的细胞可表达roxi和至少一种下列转录因子:NGN3、NKX2.2、NKX6.1、NEUR0D、ISL1、HNF3 β、MAFA、PAX4 和 PAX6。在本发明的一个方面，表达 β细胞谱系特征性标志物的细胞是β细胞。由多能干细胞形成表达定形内胚层i普系特征性标志物的细胞在本发明的一个方面，通过在葡萄糖浓度不超过10.5mM的培养基中培养多能干细胞，可以使多能干细胞群分化成表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞群。在一个实施例中，通过用激活素A和Wnt配体处理多能干细胞，达到多能干细胞群向表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞群的分化。
在替代实施例中，通过使用⑶F-8和至少一种选自下列的其它因子处理多能干细胞，达到多能干细胞群向表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞群的分化:苯胺-吡啶并三嗪、环状苯胺-吡啶并三嗪、Ν-{[1-(苯基甲基)氮杂卓-4-基]甲基}-2_吡唳-3-基乙酰胺、4-{[4-(4-{[2-(卩比唳-2-基氨基)乙基]氨基}-1,3,5_ 二嗪_2_基)批唆-2-基]氧} 丁 -1-酉享、3-({3-[4-({2_[甲基(卩比唳-2-基)氨基]乙基}氨基)-1，3，5-三嗪-2-基]吡啶-2-基}氨基)丙-1-醇、N 4 -[2-(3-氟苯基)乙基]-N 2 -[3-(4-甲基哌嗪-1-基)丙基]吡啶并[2，3-d]嘧啶_2，4-二胺、1-甲基-N-[(4-吡啶-3-基-2-{[3-(三氟甲基)苯基]氨基}-1，3-噻唑-5-基)甲基]哌啶-4-羧酰胺、I，
1-二甲基乙基{2-[4-({5-[3-(3-羟丙基)苯基]-4H-1，2，4-三唑-3-基}氨基)苯基]乙基}氨基甲酸酯、1，1_ 二甲基乙基{[3-({5-[5-(3-羟丙基)-2-(甲氧基)苯基]-1，3-|I恶唑_2-基}氨基)苯基]甲基}氨基甲酸酯、1-({5-[6-({4-[(4_甲基哌嗪-1-基)磺酰基]苯基}氨基)吡嗪-2-基]噻吩-2-基}甲基)哌啶-4-醇、1-({4-[6-({4-[(4-甲基哌嗪-1-基)磺酰基]苯基}氨基)吡嗪-2-基]噻吩-2-基}甲基)哌啶-4-羧酰胺、和
2-{[4-(1-甲基乙基)苯基]氨基}-N-(2-噻吩-2-基乙基)-7，8-二氢吡啶并[4，3_d]嘧啶-6(5H)_羧酰胺。适合于使用的因子的例子可以在美国专利申请序列N0.12/494，789中找到。在一个实施例中，所述至少一种其它因子是14-丙-2-烯-1-基-3，5，7，14，17，23，27-七氮杂四环[19.3.1.1 2，6 .I 8，12 ]二十七-1 (25)，2 (27)，3，5，8 (26)，9，
11,21,23-壬烯-16-酮。多能干细胞群可以在葡萄糖浓度不超过10.5mM的培养基中培养约一天到约七天。作为另外一种选择，多能干细胞群可以在葡萄糖浓度不超过10.5mM的培养基中培养约一天到约六天。作为另外一种选择，多能干细胞群可以在葡萄糖浓度不超过10.5mM的培养基中培养约一天到约五天。作为另外一种选择，多能干细胞群可以在葡萄糖浓度不超过10.5mM的培养基中培养约一天到约四天。作为另外一种选择，多能干细胞群可以在葡萄糖浓度不超过10.5mM的培养基中培养约四天。在一个实施例中，使用浓度为约5ng/ml至约500ng/ml的⑶F_8。在一个替代实施例中，使用浓度为约5ng/ml至约50ng/ml的GDF-8。在一个替代实施例中，使用浓度为约5ng/ml至约25ng/ml的⑶F-8。在一个替代实施例中，使用浓度为约25ng/ml的⑶F-8。
激活素A可以约lpg/mL至约100 μ g/mL的浓度使用。在一个替代实施例中，该浓度可以为约lpg/ml至约I μ g/mL.在一个替代实施例中，该浓度可以为约lpg/ml至约100ng/mlo在一个替代实施例中，该浓度可以为约50ng/ml至约100ng/ml。在一个替代实施例中，该浓度可以为约100ng/ml。Wnt配体可选自Wnt_l、Wnt_3a、Wnt_5a和Wnt_7a。在一个实施例中，Wnt配体是Wnt-10在一个替代实施例中，Wnt配体是Wnt_3a。Wnt配体可以约Ing/mL至约1000ng/mL的浓度使用。在一个替代实施例中，Wnt配体可以约10ng/mL至约100ng/mL的浓度使用。在一个实施例中，Wnt配体的浓度是约20ng/mLo
_3] 表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞的形成在一个实施例中，通过本发明的方法形成的表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞群通过本领域的任何方法进一步分化成表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞群。例如，根据D’ Amour等人，Nature Biotechnology《自然生物技术》24,1392-1401 (2006)中公开的方法，通过处理表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞群，可以使根据本发明的方法得到的表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞群进一步分化成表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞群。例如，根据美国专利申 请序列N0.11/736, 908中公开的方法,通过处理表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞群，可以使根据本发明的方法得到的表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞群进一步分化成表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞群。表达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞的形成在一个实施例中，可采用本领域的任何方法使表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞群进一步分化成表达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞群。例如，可以根据如下文献中公开的方法对表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞群进行处理，使表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞群进一步分化成表达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞群:D’ Amour等人，《自然生物技术》，2006)。例如，可以根据如下文献中公开的方法对表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞群进行处理，使表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞群进一步分化成表达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞群:D’ Amour等人，《自然生物技术》，2006)。例如，可以根据美国专利申请N0.11/736,908中公开的方法对表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞群进行处理，使表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞群进一步分化成表达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞群。例如，可以根据美国专利申请N0.11/779,311中公开的方法对表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞群进行处理，使表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞群进一步分化成表达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞群。例如，可以根据美国专利申请N0.60/953，178中公开的方法对表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞群进行处理，使表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞群进一步分化成表达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞群。例如，可以根据美国专利申请N0.60/990, 529中公开的方法对表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞群进行处理，使表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞群进一步分化成表达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞群。本发明通过(但不限于)以下实例进一步说明。SM实例I培养基和种植方案在人多能干细胞分化成表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞中的作用在第41代(p41)的人胚胎干细胞系Hl的细胞通过TrypLE (目录号12604-013，加利福尼亚州的英潍捷基公司(InvitiOgemCA))提升，并且作为单细胞以100，000细胞/cm2的密度种植到Matrigelu包被的皿上α: 3ο稀释度)补充有20ng/mi fgf2(目录号 100-18B，新泽西州的 P印roTech 公司(PeproTech, NJ))和 10 μ M Y-27632 (Rho 激酶抑制剂，目录号Υ0503， 密苏里州的西格玛公司(Sigma，M0))的MEF-CM(小鼠胚胎成纤维细胞条件培养基)中。平行地，通过用Dispase (目录号17105-041，加利福尼亚州的英潍捷基公司)提升细胞，并且将细胞在具有20ng/ml FGF2的MEF-CM中铺平板，将在第41代的人胚胎干细胞系Hl的细胞作为细胞集落以1-3次传代比种植到MATR1GEL/包被的皿上Q: 30稀释度)。对于单细胞或集落形式的培养物，在种植后24和48小时将培养基更换为具有20ng/ml FGF2 的新鲜 MEF-CM。在种植后72小时，如下使培养物分化成表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞:a.含有另外0.0025g/ml碳酸氢钠(目录号S3187，密苏里州的西格玛公司)的MCDB-13K目录号10372-019，加利福尼亚州的英潍捷基公司)补充有2%无脂肪酸BSA(目录号 68700，爱荷华州的 Proliant 公司(Proliant，IA) )、IX GlutaMax (目录号 35050-079，加利福尼亚州的英潍捷基公司)和100ng/ml激活素A(明尼苏达州的安迪生物科技公司(R&D Systems, MN))加上20ng/mlWNT_3a(目录号1324-WN-002，明尼苏达州的安迪生物科技公司)一天，随后为具有另外0.0025g/ml碳酸氢钠、2% BSA、Glutamax和100ng/ml激活素A的MCDB-131三天(条件I);或b.RPM1-1640(目录号22400-105，加利福尼亚州的英潍捷基公司)补充有2%无脂肪酸BSA(目录号68700，爱荷华州的Proliant公司)和100ng/ml激活素A(明尼苏达州的安迪生物科技公司)加上20ng/ml WNT_3a(目录号1324-WN-002，明尼苏达州的安迪生物科技公司)一天，随后为每天补充有2% BSA和100ng/ml激活素A的RPM1-1640培养基，共另外三天(条件2)。在第4天时，收集样品用于FACS分析。在图1中，关于CXCR4和⑶9表达的流式细胞术结果以散布图形式显示，其中CXCR4表达在Y轴上标绘，与在X轴上标绘的⑶9表达相比较。表达CXCR4、⑶9和⑶99(另外的分化标志物)的细胞百分比概括于表I中。如通过细胞表面标志物CXCR4和CD99的表达增加测量的，分化通过使用MCDB-131培养基得到改善，并且CXCR4和CD99的表达通过从集落型培养变成单细胞培养进一步增加。此外，如通过流式细胞术测量的，这些数据与CD9的表达减少关联，所述CD9是关于未分化细胞的细胞标志物。有趣的是，使用以簇或集落型形式的MCDB-131，在图1中存在更少的共阴性(CXCR4_/CD9_)细胞，指示在培养物处理的MCDB-131培养基中更少的非特异性分化，或不表达定形内胚层谱系特征性标志物的更少细胞。总体上，这些数据指示Hl人胚胎干细胞在MCDB-131培养基的存在下比RPM1-1640培养基更有效地分化，并且与集落型种植和培养相比较，在MCDB-131中的分化可以通过将细胞作为单细胞种植且培养进一步得到改善。表1:
权利要求
1.一种细胞群，其中所述群体中大于80%的细胞表达定形内胚层谱系特征性标志物。
2.一种生成细胞群的方法，其中所述群体中大于80%的细胞表达定形内胚层谱系特征性标志物，所述方法包括以下步骤: a.培养多能干细胞群， b.使所述多能干细胞群在葡萄糖浓度不超过10.5mM的培养基中分化成细胞群，其中所述群体中大于80%的细胞表达定形内胚层谱系特征性标志物。
3.根据权利要求2所述的方法，其中使用激活素A和Wnt配体，使所述多能干细胞群分化成细胞群，其中所述群体中大于80%的细胞表达定形内胚层谱系特征性标志物。
4.根据权利要求2所述的方法，其中使用GDF-8和至少一种选自下列的其它因子，使所述多能干细胞群分化成细胞群，其中所述群体中大于80%的细胞表达定形内胚层谱系特征性标志物:苯胺-吡啶并三嗪、环状苯胺-吡啶并三嗪、Ν-{[1-(苯基甲基)氮杂'获-4-基]甲基}-2_吡啶-3-基乙酰胺、4-{[4-(4-{[2-(吡啶-2-基氨基)乙基]氨基}-1，3，5-三嗪-2-基)吡啶-2-基]氧} 丁-1-醇、3-({3-[4-({2-[甲基(吡啶_2_基)氛基]乙基}氛基)_1, 3, 5- 二嚷_2_基]卩比唳_2_基}氛基)丙-1-醇、N 4~-[2_ (3-氣苯基)乙基]-N~ 2[3-(4-甲基哌嗪-1-基)丙基]吡啶并[2，3-d]嘧啶_2，4-二胺、1-甲基-N-[(4-吡啶-3-基-2-{[3-(三氟甲基)苯基]氨基}-1,3-噻唑-5-基)甲基]哌啶-4-羧酰胺、1，1-二甲基乙基{2-[4-({5-[3-(3_羟丙基)苯基]-4H-1，2，4-三唑_3_基}氨基)苯基]乙基}氨基甲酸酯、1，1_ 二甲基乙基{[3-({5-[5-(3_羟丙基)-2-(甲氧基)苯基]-1，3-噁唑-2-基}氨基)苯基]甲基}氨基甲酸酯、1-({5-[6-({4-[(4_甲基哌嗪-1-基)磺酰基]苯基}氨基)吡嗪-2-基]噻吩-2-基}甲基)哌啶-4-醇、1-({4-[6-({4-[(4-甲基哌嗪-1-基)磺酰基]苯基}氨基)吡嗪-2-基]噻吩-2-基}甲基)哌啶-4-羧酰胺、和2-{[4-(1_甲基乙基)苯基]氨基}-N-(2-噻吩-2-基乙基)-7, 8- 二氢吡啶并[4，3-d]嘧啶-6 (5H)-羧酰胺。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述至少一种其它因子是14-丙-2-烯-1-基-3，5，7，14，17，23，27-七氮杂四环[19.3.1.1 ~ 2，6 .I ~ 8，12 ~ ] 二十七-1 (25)，2 (27) ,3,5,8 (26) ,9, 11, 21，23-壬烯-16-酮。
6.根据权利要求2所述的方法，其中所述葡萄糖浓度不超过5.5mM。
全文摘要
本发明提供了促进多能干细胞分化成胰岛素产生细胞的方法。具体地讲，本发明提供了产生细胞群的方法，其中所述群体中大于80％的细胞表达定形内胚层谱系特征性标志物。
文档编号C12N5/0735GK103221536SQ201180041677
公开日2013年7月24日 申请日期2011年8月17日 优先权日2010年8月31日
发明者B.弗里耶 申请人:詹森生物科技公司