专利名称：诺如病毒衍生的免疫原性组合物和方法
诺如病毒衍生的免疫原性组合物和方法本申请要求2010年7月6日提交的美国临时申请61/361，581的优先权，其全部内容通过引用纳入本文以用于所有目的。诺如病毒(Norovirus)(先前称为诺沃克类病毒、NVL或诺沃克病毒)是成人和儿童中急性病毒性胃肠炎的主要病因。诺如病毒有高度传染性(infectious)，并且通过摄入污染食物例如牡蛎和水扩散。诺如病毒也在半封闭社区(如医院、学校、疗养院和大型游轮)中通过粪口途径(fecal-oral route)人际传播而快速蔓延。这些特性使诺如病毒成为主要的公众健康问题。例如，仅在美国，诺如病毒造成大于95%病毒性胃肠炎的爆发，和估计的每年 2 千 3 百万例胃肠炎(Fankhauser 等(2002) J.1nfect.Dis.186:1-7;MMWR Morb.Mortal Weekly Rep.(2000)49:207-211)。诺如病毒传染(infectious)的症状包含腹泻和呕吐以及伤寒、头疼、寒颤和胃疼。这种症状的原因可以与诺如病毒和小肠表皮细胞糖受体结合有关，所述结合造成了离子转移中的不平衡(Marionneau 等(2002)Gastroenterologyl22:1967-1977;Hutson 等(2003)J.Virol.77:405-415).极易传染的诺如病毒能用少至10个病毒颗粒传染引起疾病。尽管其他方面健康，传染诺如病毒的人可以在2-4天内恢复，但其在症状开始后仍传播病毒多至2周。约30-40%传染的人可以保持无症状，但是通过向更容易传染的其他人传播病毒来扩散传染(Hutson 等(2004) Trends Microbiol.12(6):279-287)。诺如病毒是杯状病毒(Caliciviridae)家族成员，所述杯状病毒是小的、无包膜、二十四面体病毒，直径27-40nm，包含单链正义RNA。系统发生研究显示了诺如病毒属由至少40种不同的毒株组成,根据序列相似性分成5个基因群(genogroup), G1-GV。这5个基因群中，GI和GII是对人类传染最重要的基因群。每个基因群进一步分成基因型。当前GI包含8种不同的基因型，和GII有至少17种不同的基因型。在基因组水平，基因群中的毒株有51-56%核苷酸序列相同性,和基因型中的毒株有69-70%核苷酸序列相似性(Donaldson等，Nat.Rev.Microbiol.2010年2月2日[在线提前发表])。诺如病毒RNA包含了编码所述病毒结构和非结构蛋白的三个开放阅读框(ORF)。诺如病毒的主要结构蛋白是病毒蛋白I (VPl)。其完全由诺如病毒RNA的0RF2编码，并且形成诺如病毒衣壳结构。所述诺如病毒衣壳由180个拷贝的VPl单体组成。当重组表达VPl时，其能自体组装成缺乏病毒基因组的二十四面体衣壳结构，并称为病毒样颗粒(VLP)。X射线晶体学研究揭示了各衣壳蛋白VPl由2个不同的结构域组成:壳⑶结构域和突出(protruding) (P)结构域。这两个结构域通过短的柔性接头或铰链栓在一起。VPl单体的S结构域共同形成诺如病毒VLP的核心，并且P结构域在VLP表面辐射状延伸，并且包含大量已知诺如病毒抗原表位部分。所述P结构域(aa226-530,诺沃克株编号)分成两个亚结构域Pl和P2。所述P2结构域呈辐射状位于病毒颗粒(或VLP)的最外表面，并且认为序列上高度可变。(参见例如Chen等，(2004) J.Virol.78:6469-6479)。所述P2结构域是诺如病毒株中VPl最不保守的区域，并且 认为在受体结合和免疫反应中起重要作用。(Kitamoto等(2002)J.Cl in.Microbiol.40:2459-2465;Prasad 等(1999)Science286:287-290;Tan等(2003)J.Virol.77:12562-12571;White 等(1996)J.Virol.70:6589-6597;Vance 等(2005)J.General Virol.86:2799-2806)。结构研究显示了不同诺如病毒P2亚结构域形状和大小的多样性，这与观察到的P2亚结构域序列可变性一致。Chen等(2004)J.Virology78(12):6469-6479。使用杆状病毒传染的昆虫细胞表达系统(Jiang等(1992)J.Virol.66:6527-6532)且随后使用委内瑞拉马脑炎病毒载体传染的哺乳动物细胞表达系统(Baric等(2002) J.Virol.76:3025-3030)第一次显示了诺沃克病毒VLP的表达和自体组装。当在真核表达系统中高水平表达时，诺沃克病毒中VPl单体和某些其他诺如病毒自体组装成结构上模仿天然诺如病毒颗粒的VLP。VLP保持了病毒蛋白衣壳的可靠构型，但是缺乏诺如病毒遗传材料。当注射到动物中时，诺如病毒VLP能引起合适的宿主免疫反应。尽管已经知道了关于诺如病毒的抗原属性，开发针对诺如病毒的有效疫苗缓慢并且有挑战性。有数个原因造成开发有效针对广泛诺如病毒株(包含从不同基因群和基因型中地域分离(field isolate))的诺如病毒疫苗是一个挑战。一个原因是在不同的诺如病毒株中存在的复杂抗原多样性。基因型变异能产生新的配体结合特性和抗原属性(Donaldson等，Nat.Rev.Microbiol.2010年2月2日[在线提前发表])。第二个原因是优势(dominant)循环诺如病毒株的顺序取代(Siebenga 等(2007) J.Virol81:9932-9941)。第三个原因是缺乏人诺如病毒的细胞培养模型，阻止了中和试验的发展。第四个原因是缺乏人诺如病毒的动物模型，限制了疫苗功效的临床前测试并且妨碍了解诺如病毒病因和免疫的研究(Donaldson 等(2010) Nature Rev.Microbiol.8:231-241)。为了呈现优势免疫诺如病毒表位作为疫苗，先前制备了包含来自仅一种诺如病毒株的一种类型VPl蛋白的VLP (也称为单价VLP)或来自两种或更多种诺如病毒株的非嵌合VPl蛋白的混合物(也称为多价VLP)。见例如W02009039229。单价VLP可能针对广泛诺如病毒株的有效性小于多价VLP。当前多价VLP可限制在来自不同株的VPl范围中，所述不同株能由于株之间VPl-VPl相互作用表面的差异而共组装。由于这些问题，上述疫苗系统都不适合针对由于病毒进化而出现的新型诺如病毒的快速定制。诺如病毒经历了抗原类 型的累进变化，用新的抗原变体代替更旧的抗原变体。因此，可能需要周期性改变诺如病毒疫苗的毒株组成，如现在对季节性流感疫苗所完成的。在不同的效率水平发生来自不同诺如病毒株VPl的VLP组装，并且所得VLP有不同水平的产率和稳定性。株之间的这种变化会妨碍诺如病毒疫苗组合物中所需株改变的速度、可靠性和便利性。因此，仍需要改善诺如病毒疫苗的开发方法，所述方法使具有来自任意所需诺如病毒株(包含新的地域(field)和/或临床分离)的有效制备、稳定和合适呈现的诺如病毒免疫原性材料的毒株组成快速改变。
发明内容
本发明部分提供了包含诺如病毒抗原和材料的免疫原性组合物，以及能用于快速开发这种组合物的方法。本发明的诺如病毒抗原包含嵌合诺如病毒VPl蛋白，其中全部或部分P结构域用来自不同诺如病毒株的全部或部分P结构域取代。一方面，本发明涉及嵌合诺如病毒的病毒蛋白I (VPl)，所述病毒蛋白包含来自第一诺如病毒株VPl的S结构域和至少一部分来自第二诺如病毒株VPl的P结构域,和可选操作性连接所述S结构域和P结构域的接头肽。当存在时，所述接头肽能是任意合适的接头，例如来自第一诺如病毒株、来自第二诺如病毒株或来自第三诺如病毒株的VPl的接头肽。所述嵌合VPl能有如式⑴所述的结构:A— S — L一P — B(I)。
在式(I)中，A和B各自缺失，或是任意所需的氨基酸序列；S是来自第一诺如病毒株VPl的S结构域；L不存在或是接头肽；并且P是诺如病毒VPl的P结构域；其中至少一部分P结构域来自第二诺如病毒株。在一些实施方式中，P是来自第二诺如病毒株的P结构域。在其他实施方式中，P包含来自第一诺如病毒株的Pl亚结构域或其部分，和来自第二诺如病毒株的P2亚结构域。所述嵌合VPl蛋白能包含数个部分，如来自任意所需诺如病毒株如表I所列举的诺如病毒株的S结构域、P结构域。在一些实施方式中，所述S结构域来自雪山(SnowMountain)株。在这些实施方式中,所述P结构域或其部分(如P2亚结构域)能来自任意其他诺如病毒株，如表I所列举的那些。在特定实施方式中，所述S结构域来自雪山株，和所述P结构域或其部分(如P2亚结构域)来自基因群GII的不同诺如病毒株、基因群GI的诺如病毒株或基因群GIV的诺如病毒株。在更特定的实施方式中，所述S结构域来自雪山株，和所述P结构域或其部分(如P2亚结构域)来自诺沃克病毒、GI1.4.2006a或新奥尔良(New Orleans)病毒。在另一方面，本发明涉及包含本文所述嵌合VPl蛋白的诺如病毒病毒样颗粒(VLP)。所述VLP能是单价或多价。所述多价VLP能包含如本文所述的两种或更多种嵌合VPl蛋白。所述多价VLP能包含本文所述嵌合VPl蛋白和天然产生的诺如病毒VPl蛋白。本发明也涉及编码本文所述嵌合诺如病毒VPl蛋白的重组核酸。所述重组核酸能是例如RNA或DNA，并且若需要能包含载体。在一些实施方式中，所述重组核酸是自体复制的，例如自体复制RNA。另一方面，本发明涉及包含本文所述嵌合诺如病毒VPl蛋白、本文所述VLP或其组合的免疫原性组合物。本发明也涉及包含编码本文所述嵌合诺如病毒VPl蛋白的重组核酸的免疫原性组合物。另一方面，本发明涉及包含编码本文所述嵌合诺如病毒VPl蛋白的重组核酸的重组宿主细胞。例如所述宿主细胞能是昆虫细胞、哺乳动物细胞、禽类细胞、细菌、酵母细胞、四膜虫细胞和其组合。本发明也涉及生成嵌合诺如病毒VPl蛋白和/或VLP的方法，所述方法包含在表达所述重组核酸和生成嵌合VPl蛋白的条件下培养本文所述重组宿主细胞。在一些实施方式中，在适于形成VLP的条件下维持所述重组宿主细胞。在一些实施方式中，所述方法还包含从培养基和/或所述重组宿主细胞中分离所述嵌合诺如病毒VPl蛋白和/或VLP。附图简要说明
图1描述适合亚克隆和扩增本发明所述嵌合VPl寡核苷酸的载体PMADC5的图。图2描述适合在酿酒酵母(S.cerevisiae)中表达嵌合VPl蛋白和VLP的载体PBS24.1 的图。图3是来自三个不同诺如病毒株(诺沃克(norw)基因型Gl.1 (SEQ ID NO: 11)、雪山(雪(snow))基因型 GI1.2 (SEQ ID NO: 12)和 2006a(g2.4)GI1.4 (SEQ ID NO: 13) ) ^VPl蛋白的氨基酸比对。如所示，所述壳结构域(S结构域)是残基1-221，所述接头肽是残基222-230，和所述突出结构域(P结构域)是残基231-530。图4A描述诺如病毒株雪山中0RF2的核苷酸序列(SEQ ID NO: 14),所述核苷酸序列在所述株中编码VPl蛋白。图4B显示了由雪山0RF2编码的VPl蛋白的经翻译的氨基酸序列(SEQ ID NO: 12)。图5描述编码嵌合VPl蛋白的核酸(SEQ ID NO: 15)，所述蛋白的S结构域衍生自雪山株，和P结构域衍生自诺沃克株。图6描述编码嵌合VPl蛋白的核酸(SEQ ID NO: 16)，所述蛋白的S结构域衍生自雪山株，和P结构域衍生自GI1.42006a株。图7显示了 24种本发明示例性嵌合VPl蛋白的初级结构的示意图。所述变体A、
S、L、Pl-1、P2、P1-2和B如本文所述。图8A-8E显示了数个诺如病毒株的VPl序列的多个氨基酸比对。见Hansman等
(2006)J.General Virology87:909-919。这些图中指不了下列区域:N末端区(线)；S结构域(填充框)，Ph亚结构域(空心框)；P2亚结构域(XXX) $-2亚结构域(空心框)和C末端区(线)。星号表示保守氨基酸。所示序列来自下列诺如病毒株:#8(SEQID NO:17)(AB058547, GI/11 株);SeV(SEQ ID NO:18) (AB031013,GI/1 株);258 (SEQID NO:19)(AB078335, GI/2 株)；645(SEQ ID NO:20)(BD011871, GI/3 株)；CV(SEQ IDNO:21)(AB042808, GI/4 株)；WUG1(SEQ ID NO:22)(AB081723,GI/8 株)；HV(SEQ IDN0:23) (U07611,GII/1 株);485(SEQ ID NO:24)(DQ093065, GII/1 株);Ina(SEQ IDNO:25)(AB195225,GII/2 株);809(SEQ ID NO:26)(BD011876, GII/3 株);Sh5 (SEQ IDNO: 27) (AB195226, GII/3 株);18-3(SEQ ID NO: 28) (DQ093062, GII/3 株);336 (SEQID N0:29)(DQ093063，GII/3 株)；1152(SEQ ID NO:30)(DQ0930);104(SEQ ID N0:31)(AB078336, GI1/4 株);754 (SEQ ID NO:32)(BD011877, GII/5 株);7k(SEQ ID NO:33)(AB078337，GII/6 株)；445(SEQ ID NO:34)(DQ093064, GII/6 株)；10-25(SEQ ID NO:35)(9BD011881,GII/7 株);U25(SEQ ID NO:36)(AB039780, GII/8 株);026(SEQ ID NO:37)(AF504671，GII/10 株)；CHV(SEQ ID NO:38)(AB032758, GII/12 株)；47(SEQ ID NO:39)(AB078334, GII/14 株);Hiro(SEQ ID NO:40)(AB044366,GII/12 株);Alph23(SEQ IDN0:41)(DQ093067, GII/17 株)。图9 是显示由 Chakavarty 等(2005) J.Virology, 79 (I): 554-568 鉴定的氨基酸残基，所述氨基酸残基来自区分不同的已知和提示抗原性诺如病毒株和种类的S和P结构域。图1OA是有深灰色S结构域(内部)和浅灰色P结构域(外部)的诺沃克病毒样颗粒的X射线结构。图1OB是图1OA中彩色的单个单体的视图。图1lA是描述雪山VLP的纯化蛋白的图像。图1lB是雪山VLP的电子显微照片。图12A是描述雪山/诺沃克VLP嵌合体的纯化蛋白的图像。图12B是雪山/诺沃克嵌合VLP的电子显微照片。发明详述本发明提供了生产和使用嵌合诺如病毒VPl蛋白的组合物和方法。本发明还提供了包含含有所述VPl蛋白 的诺如病毒VLP的免疫原性组合物，其中所述S结构域获自第一诺如病毒株和全部或部分所述P结构域获自第二诺如病毒株。本发明的其他方面包含核酸和多肽，以及制备和纯化这种核酸和多肽的方法。下面更详细描述了本发明的这些方面与本发明的VLP和其在免疫原性组合物中的应用以及这种组合物在治疗或预防诺如病毒中的使用方法。1.定义除非另外说明，本申请中使用的所有科学和技术术语的含义具有本领域通用的含义。本申请使用的下列单词或短语有特定含义。如本文所用，“一个”、“一种”和“该”包括单数和复数指代形式，除非文中另有明确说明。因此，例如提及“一种多核苷酸”包括两种或更多种多核苷酸的混合物等。与数值X相关的术语“约”表示，例如x+10%。本文使用的术语〃诺如病毒〃和〃诺沃克样病毒〃指正义单链RNA包膜病毒的杯状病毒家族的诺如病毒属成员(Green等，Human Caliciviruses (人杯状病毒)，FieldsVirology(《费氏病毒学》)，卷I，第841-874页(Knipe和Howley,主编，第4版，利平科特威廉斯.威尔金斯出版公司(Lippincott Williams&Wilkins)2001))。术语诺如病毒包含所有病毒基因群中的毒株。当前，诺如病毒株分成5个基因群(G1-GV)，再分成至少20个基因簇或基因型。特别地，术语诺如病毒包括但不限于:物种诺沃克病毒(NV)、Lordsdale病毒(LV)、墨西哥病毒(MV)、夏威夷病毒(HV)、雪山病毒(SMV)、沙漠风暴病毒(DSV)和南安普顿病毒(SV)。大量诺如病毒分离物被部分或完全测序。见例如GenBank数据库(ncb1.nlm.nih.gov)、国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)的分类学数据库(Taxonomy Database) (ncb1.nlm.nih.gov)或杯状病毒的 pathosystems资源整合中心数据库(PathoSystems Resource Integration Center Database) (patric.vb1.vt.edu)。术语诺如病毒也包含在提交时间没有定性的分离物。术语〃多肽〃和〃蛋白〃指氨基酸残基的聚合物，且不限于产物的最小长度。因此，该定义中包含肽、寡肽、二聚体、多聚体等。该定义包含全长蛋白和其片段。所述术语也包含多肽的表达后修饰，例如糖基化、乙酰化、磷酸化等。另外，出于本发明的目的，"多肽"指包含对天然序列修饰例如缺失、加入和取代(通常性质上保守)的蛋白，只要所述蛋白维持了所需活性。这些修饰可以是有意的，例如通过定点诱变，或者可以是意外的，例如通过产生蛋白质的宿主突变或PCR扩增所致的误差。〃基本纯化〃通常指物质(化合物、多核苷酸、蛋白、多肽、多肽组合物)的分离，从而所述物质包含大部分其驻留的样品。通常样品中，基本纯化成分包含样品的50%，优选80%-85%，更优选90-95%。纯化感兴趣的多核苷酸和多肽的技术为本领域熟知，并且包含例如离子交换层析、亲和层析和密度沉降。当涉及多肽时，〃分离的〃指所示分子是从全生物体中分离和分开(discrete)，所述全生物体中天然发现所述分子或者所述分子在基本没有相同类型的其他生物大分子情况下存在。对多核苷酸而言，术语〃分离的〃是全部或部分没有其天然相关(associate)序列的核酸分子；或者如其天然存在的一种序列，但是有与之关联的异源序列；或者从染色体解离的分子。
本文用于描述核酸分子的“重组”指基因组、cDNA、病毒、半合成或合成来源的多核苷酸，由于其来源或操作，所述多核苷酸与其天然相关(associate)的全部或部分多核苷酸不关联。对蛋白或多肽而言，使用术语“重组”指由重组多核苷酸表达生成的多肽。通常，克隆感兴趣基因并且然后在如下面进一步所述的转化生物体中表达。所述宿主生物体表达外源基因以生成表达条件下的蛋白。术语“转化”指将外源多核苷酸插入到宿主细胞，而不考虑使用插入的方法。例如，包含直接摄取、转染、转导或f匹配。所述外源多核苷酸可维持为非整合载体例如质粒，或者可以整合到宿主基因组中。“重组宿主细胞”、“宿主细胞”、“细胞”、“细胞系”、“细胞培养物”和其他这种术语表示培养的微生物或高等真核细胞系，因为单细胞实体指能用作或者已经用作重组载体或其他转移DNA的受体，并且包含已转染原始细胞的初始后代。“编码序列”或“编码”选定多肽的·序列是置于合适调节序列(或“控制元件”)控制下时体内转录(DNA情况中)和翻译(mRNA情况中)成多肽的核酸分子。编码序列的边界能由5’(氨基)末端起始密码子和3’(羧基)末端翻译终止密码子确定。编码序列能包括但不限于来自病毒、原核或真核mRNA的cDNA，来自病毒或原核DNA或RNA的基因组DNA序列，和甚至合成的DNA序列。转录终止序列可以位于编码序列的3’端。通常“控制元件”包括但不限于转录启动子、转录增强子元件、转录终止信号、聚腺苷酸化序列(位于翻译终止密码子的3')、翻译起始优化序列(位于编码序列的5')和翻译终止序列。术语“核酸”包括DNA和RNA，以及其类似物，如含有修饰主链的类似物(如硫代磷酸酯等)，及肽核酸(PNA)等。本发明包含与上述那些互补的序列的核酸(例如出于反义或探针目的)。术语“自体复制”指编码聚合酶、包含能使聚合酶复制所述核酸分子的核苷酸序列元件、并且优选也编码所需多肽如嵌合诺如病毒VPl的核酸分子。所述自体复制核酸优选是自体复制RNA分子。例如自体复制RNA分子能基于α病毒基因组，并且编码能指导所述RNA分子复制的非结构蛋白，包含足以使RNA分子复制的复制识别序列，还编码所需靶标多肽例如嵌合诺如病毒VPl。可选地，从自体复制RNA分子中删除或省略一种或多种结构病毒基因(如衣壳和/或包膜糖蛋白)。能用于生成自体复制RNA分子的合适α病毒包含辛德毕斯病毒、西门利克森林病毒、东部马脑炎病毒、委内瑞拉马脑炎病毒等。(关于自体复制 RNA 分子，参见例如 EP1751289Bl;Ying 等(1999) Nat.Med.5 (7): 823-827; Racanelli 等
(2004)Immunity, 20(I):47-58)。〃操作性连接〃指配置所述组件以便行使其常见功能的元件排列。因此，当存在合适的酶时，操作性连接到编码序列的给定启动子能影响编码序列的表达。启动子可不必与编码序列毗连，只要其发挥指导编码序列表达的功能。因此，例如，间插非翻译和尚未转录序列可启动子序列和编码序列之间出现，仍可认为该启动子序列“操作性连接”该编码序列。“由…编码”指编码多肽序列的核酸序列，其中所述多肽序列或其部分包含至少3个氨基酸的氨基酸序列。“表达盒”或“表达构建物”指能指导感兴趣序列或基因表达的组件。表达盒一般包括上述控制元件，例如操作性连接到感兴趣序列或基因的启动子(以指导其转录)，并且通常还包括聚腺苷酸化序列。在本发明的某些实施方式中，本文所述的表达盒可以包含在质粒构建物中。除了表达盒的成分，所述质粒构建物可以包含一种或多种选择标记、使质粒构建物作为单链DNA存在的信号(如复制的M13起点)、至少一个多克隆位点和复制的“哺乳动物”起点(如复制的SV40或腺病毒起点)。“纯化的多核苷酸”指感兴趣多核苷酸或其片段，其基本没有所述多核苷酸天然结合(associate)的蛋白，例如包含少于约50%、优选少于约70%、和更优选少于约至少90%的所述蛋白。纯化感兴趣多核苷酸的技术为本领域熟知，并且包含例如用离液剂破坏包含多核苷酸的细胞，和通过离子交换层析、亲和层析和密度沉降分离多核苷酸和蛋白。“载体”能转移核酸序列到靶细胞(如病毒载体、非病毒载体、特定运载体和脂质体)。〃载体构建物"、〃表达载体〃和〃基因转移载体〃通常指能指导感兴趣核酸表达并能将核酸序列转移至靶细胞的核酸构建物。因此，该术语包括克隆和表达运载体以及病毒载体。本文使用的术语“表位”通常指由T细胞受体和/或抗体识别的抗原上位点。其可以是衍生自蛋白抗原或是作为蛋白抗原一部分的短肽。所述表位的三维结构对其功能可以重要或不重要。然而所述术语也意在包含有糖肽和糖表位的肽。单个抗原分子可以载有数个不同的表位。术语“表位”也包含刺激识别全生物体反应的氨基酸或糖的修饰序列。如果选定表位是造成传染性(infectious)疾病的传染剂的表位,那么这是有利的。对于各种诺如病毒衣壳表位的描述，参见例如Hardy等，美国专利申请
发明者E·塞滕布里, A·梅迪纳-塞尔比, D·科伊特, P·道米策 申请人:诺华有限公司