专利名称：表达人胆碱乙酰转移酶的人神经干细胞及其用途的制作方法
表达人胆碱乙酰转移酶的人神经干细胞及其用途
技术领域：
本发明涉及一种人神经干细胞及其用途，上述人神经干细胞转化为包含人胆碱乙酰转移酶编码核苷酸序列的载体，来表达胆碱乙酰转移酶，更详细地，本发明涉及阿尔茨海默病的治疗用药剂学组合物及认知功能障碍改善用组合物，上述组合物包含表达上述人胆碱乙酰转移酶的人神经干细胞。
背景技术：
阿尔茨海默病(Alzheimer Disease, AD)是最有破坏性的神经退行性疾病之一,其特征在于，学习及记忆力损伤等认知功能的缺损。(I)在阿尔茨海默病患者身上观察到作为乙酸胆喊(acetylcholine,ACh)合成酶的胆喊乙酸转移酶(choline acetyl transferase,ChAT)的活性减少，而突触前部的胆碱能系统的功能障碍是认知功能障碍的主要原因之一(2，3，4，5)。到目前为止，基于抑制作为乙酰胆碱分解酶的乙酰胆碱酯酶(acetyl cholineSteraSe，AChE)，来增加乙酰胆碱的浓度而设计的小分子的药物进行阿尔茨海默病治疗(5，6)。但是，对组织损伤没有强有力的保护效果的药物治疗只不过是暂时的症状改善效果，因此，对阿尔茨海默病患者而言，需要既有效，又实质性的治疗，并且，基于针对阿尔茨海默病进行靶向治疗的干细胞的治疗方法能够符合于上述的要求。对于多种神经障碍而言，为了治疗帕金森病(Parkinson disease, PD)、亨廷顿病(Huntington disease)、肌萎缩(amyotrophic lateral sclerosis, ALS)、脑卒中(stroke)及脊椎损伤(spinal cordinjury)等疾病，基于干细胞的治疗研 究正在开始(7-9)。与通过药物来暂时提高身体功能的情况相比，干细胞能够抑制或者延迟宿主细胞的凋亡，并能够使损伤的组织恢复(7-10)。本发明人确认了通过移植用于表达对多种功能基因，尤其对成长因子进行编码的基因的人神经干细胞(NSCs)，来保护宿主细胞，并使患有脑卒中、帕金森病、肌萎缩及脊椎损伤的动物模型恢复身体功能(11-14)。永生化的人神经干细胞在体外(ex vivo)，被认定为对基因操作及向中枢神经系统内的基因传递非常有效的细胞源。转基因的神经干细胞移植到正常或者损伤的脑内之后会生存，并与宿主组织成为一体化，并分化为神经元及胶质细胞(9)。本说明书全文参照多篇论文及专利文献，并表示这些引用。所引用的论文及专利文献的公开内容，作为参照全部插入到本说明书，从而更为明确地说明本发明所属技术领域的水准及本发明的内容。
发明内容发明要解决的技术课题本发明人员努力研究一种细胞治疗技术的开发，该技术利用干细胞移植方法，能够使患有阿尔茨海默病时显现的乙酰胆碱的缺乏引起的认知功能，例如学习能力或记忆能力的障碍恢复。首先，确立对人胆碱乙酰转移酶基因进行过度表达的人神经干细胞的转化体，并将此转化体移植到阿尔茨海默病动物模型的脑，移植的细胞进行稳定的分化来分泌乙酰胆碱，由此，以实验方式确认动物模型的认知功能得到改善，来完成本发明。因此，本发明的目的在于，提供一种表达人胆碱乙酰转移酶的人神经干细胞。本发明的再一个目的在于，提供一种包含表达人胆碱乙酰转移酶的人神经干细胞的阿尔茨海默病的治疗用药剂学组合物。本发明的另一个目的在于，提供一种包含表达人胆碱乙酰转移酶的人神经干细胞的认知功能障碍改善用药剂学组合物。本发明的又一个目的在于，提供一种治疗阿尔茨海默病的方法，该方法包括将表达人胆碱乙酰转移酶的人神经干细胞的药剂学有效量给药到患有阿尔茨海默病的对象(subject)的步骤。本发明的还有一个目的在于，提供一种治疗认知功能的障碍的方法，该方法包括将表达人胆碱乙酰转移酶的人神经干细胞的药剂学有效量给药到患有认知功能障碍的对象的步骤。本发明的其他目的在于，提供一种药剂学组合物，该药剂学组合物包含人神经干细胞作为有效成分，用于阿尔茨海默病的治疗方法，并且，上述人神经干细胞表达人胆碱乙酰转移酶。本发明的其他目的在于，提供一种药剂学组合物，该药剂学组合物包含人神经干细胞作为有效成分，用于认知功能障碍的治疗方法，并且，上述人神经干细胞表达人胆碱乙酰转移酶。本发明的目的及优点在发明内容、权利要求书及附图中进行更为明确的说明。
解决课题的技术方案根据本发明的一实施方式，本发明涉及一种人神经干细胞，该人神经干细胞转化为包含人胆碱乙酰转移酶编码核苷酸序列的载体，来表达胆碱乙酰转移酶。本发明的术语“胆碱乙酰转移酶”是具有将乙酰-Cok与胆碱(choline)相结合来产生作为神经传递物质的乙酰胆碱的功能的酶。这在神经元(neuron)的体(body)内合成，通过轴质流动(axoplasmic flow)向神经末梢移动。对于人而言,胆碱乙酰转移酶通过胆碱乙酸转移酶基因来进行编码(Strauss, W.L., Kemper R.R., Jayakar, P.et al., Genomics9,396-398 (1991))。根据本发明的优选实例，上述人胆碱乙酰转移酶包含序列号I的氨基酸序列(GenBank Accession N0.NP_065574)。本发明中，人的“神经干细胞”意味着具有继续繁殖的能力，S卩，自我复制能力(self-renew),并意味着能够分化为构成中枢神经系统的神经细胞(neuron或neuronalcel I)、星形胶质细胞(astrocyte)、少突胶质细胞(oligodendrocyte)等细胞的具有多分化能力的未分化细胞。根据本发明的优选实例,上述神经干细胞是原代培养(primary cultured)神经干细胞或由此进行转基因的永生化(immortalized)神经干细胞。作为本发明的转化体的神经干细胞有可能是从人组织中分离及培养的原代培养神经干细胞(primary cultured neural stem cell)。例如,从人胎儿或成人的脑中分离的神经干细胞，从人脐带血液来源的造血干细胞中诱导的神经干细胞，或从人胚芽中诱导的神经干细胞能够用于转化。
并且，本发明中转基因的永生化神经干细胞也能用于转化。例如，使用向从人胎儿的脑分离的神经干细胞导入包含v-myc肿瘤基因的逆转录病毒载体来确立的永生化人神经干细胞株。人神经干细胞作为干细胞标志物，通过巢蛋白(nestin)的阳性染色来确认。神经干细胞的具体分离方法在美国授权专利5654183中公开，此文献作为参照插入到本说明书中。神经干细胞将碱性成纤维细胞生长因子(bFGF, basic fibroblastgrowth factor)、表皮生长因子(EGF, epidermal growth factor)或成纤维细胞生长因子(FGF, fibroblast growth factor)以适合的浓度范围，例如5ng/ml 100ng/ml的范围添加到培养基进行培养。本发明的人神经干细胞是转化为包含人胆碱乙酰转移酶基因的载体的转基因(genetically modified)细胞。如下述本发明的具体一实施例中论证，向本发明的人神经干细胞以插入表达载体的形态进行导入的人胆碱乙酰转移酶进行稳定性表达，在向阿尔茨海默病动物模型的脑移植的情况下，在移植的脑组织中进行稳定性结合、生产及分化，使乙酰胆碱的浓度恢复到正常水准。本发明中，用于将人胆碱乙酰转移酶导入到人神经干细胞的载体能够优选使用以下载体，但并不局限于此。(i )腺病毒载体；(ii )逆转录病毒载体；(iii )腺-相关病毒载体；(iv)单纯疱疫病毒载体；(V)猴病毒(SV, simian virus) 40载体；(vi)多形瘤病毒载体；(vii)乳头状瘤病毒载体；(viii)细小核糖核酸病毒(Picornavirus)载体；(ix)痘苗病毒载体；(x)辅助依赖性腺病毒载体。在本发明的载体中所包含的真核细胞中启动的复制起点虽然包含fl复制起点、SV40复制起点、pMBl复制起点、Adeno复制起点、AAV复制起点及BBV复制起点等，但并不局限于此。作为用于本发明的载体的启动子能够利用来源于哺乳动物细胞的基因组的启动子(例如，金属硫蛋白启动子)或来源于哺乳动物病毒的启动子(例如，腺病毒后期启动子、痘苗病毒7.5K启动子、SV40启动子、巨细胞病毒(CMV)启动子及单纯疱疹病毒的tk启动子)，作为转录终止序列，包含多聚腺苷酸序列，例如，SV40polA序列及BGH polA等。用于本发明的载体为选择标记，该载体包含本发明所属技术领域中通常使用的抗生素抗性基因，例如，针对氨节西林(Ampicillin)、庆大霉素(Gentamycin)、羧节西林(carbenicillin)、氯霉素(chloroamphenicol)、链霉素(streptomycin)、卡那霉素(kanamycin)、遗传霉素(geneticin)、新霉素(neomycin)、嘌呤霉素(puromycin)及四环素(Tetracycline)具有抗性的基因。根据本发明的具体一实施例，包含本发明的人胆碱乙酰转移酶的表达载体的结构见图1的A部分。
将本发明的载体向人神经干细胞内运输的方法能够使用公知的转染(transfection)方法,例如，显微注射法(Capecchi, M.R.，Cell22,479 (1980))、磷酸I丐沉淀法(Graham, F.L.et al.，Virology52,456 (1973))、电穿孔法(Neumann, E.et al.，EMBOJ.1,841 (1982))、脂质体转染法(liposome transfection) (Wong, T.K.et al., Gene, 10,87 (1980))、二乙氨乙基-葡聚糖处理法(Gopal，Mol.Cell Biol.5，1188-1190 (1985))及基因枪(particle gun) (Yang et al., Proc.Natl.Acad.Sc1.USA87,9568-9572 (1990))等，但并不局限于此。筛选转化的人神经干细胞的步骤能够利用通过上述选择标记来表达的表型(phenotype)来容易地实施。例如，在上述选择标记为特定抗生素抗性基因的情况下，在含有上述抗生素的培养基中培养转化体，从而可容易地筛选出转化体。根据本发明的另一实施方式，本发明涉及包含人神经干细胞作为有效成分的阿尔茨海默病治疗用药剂学组合物，上述人神经干细胞转化为包含人胆碱乙酰转移酶编码核苷酸序列的载体，来表达胆碱乙酰转移酶。本发明的药剂学组合物能够制成通常包含细胞的悬浮液形态的注射剂。适合注射的制剂形态包含用于制备可立即准备的溶液或分散液的已灭菌的溶液或分散液。所有情况下，注射液形态的药剂应进行灭菌，并且应具有流动性，以便于注射。本发明的药剂学组合物除了有效成分以外，可包含药剂学上接受的载体。上述术语“药剂学上接受的”意味着当给药到人身上时不会引起过敏反应或类似的不良反应。此类载体包含特定溶剂、分散介质、涂敷剂、抗菌剂、抗真菌剂、等张剂(isotonizing agent)及吸收延迟剂等。药剂学上，在活性物质使用此类介质及制剂是本发明所属技术领域中公知的。药剂学组合物的载体可以是，例如，水、生理盐水、乙醇及多元醇(例如，甘油、丙二醇及液状聚乙二醇等)、适合的它们混合物及含有植物油的溶剂或分散介质。通过使用卵磷脂等涂敷剂能够维持流动性。为了防止微生物污染，可包含对羟苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸及硫柳汞等多种抗菌剂及抗真菌剂，还可包含糖或氯化钠等的等张剂。并且，体内给药时，为了延长吸收作用，能够在组合物包含延迟吸收的制剂，例如，单硬脂酸铝及凝胶。灭菌注射溶液根据需要，在上述所提到的具有多种其他成分的适合的溶剂中混合所需要的量的活性化合物后，进行过滤和灭菌来制备。优选的，本发明的药剂学组合物能够通过非口服、腹腔内、真皮内、肌肉内及静脉内途径进行给药，更优选的，能够通过直接向脑部位注射来进行给药。本发明的药剂学组合物与剂型对立的方式以治 疗上有效的量来给药。并且，能够根据所要治疗的对象的状态或条件来调节给药量。为了以水性注射溶液来进行非口服给药，溶液根据需要适合地进行缓冲，首先用充分的生理盐水或葡萄糖制备等张性的液体稀释剂。这些特殊的水性溶液尤其适合静脉内、肌肉内、皮下、真皮内及腹腔内给药。与此相关的，用于本组合物的载体、制剂及介质的相关内容是本发明所属技术领域中公知的(“Remington’s Pharmaceutical Sciences”，1995,参照 15 版)。根据本发明的又一实施方式，本发明涉及包含人神经干细胞作为有效成分的认知功能(cognitive function)障碍改善用组合物,上述人神经干细胞转化为包含人胆碱乙酰转移酶编码核苷酸序列的载体，来表达胆碱乙酰转移酶。根据本发明的优选实例，上述认知功能是学习能力或记忆能力。根据本发明的再一个优选实例，上述认知功能的障碍是由脑中的乙酰胆碱的分泌减少引起的。根据本发明的另一个优选实例，上述认知功能障碍改善用组合物能够以药剂学组合物的形态来制备。药剂学组合物的相关内容与上述阿尔茨海默病治疗用药剂学组合物的内容相同。根据本发明的再一个实施方式，本发明提供一种包括将人神经干细胞的药剂学有效量给药到患有阿尔茨海默病的对象(subject)的步骤，上述人神经干细胞转化为包含人胆碱乙酰转移酶(choline acetyl transferase, ChAT)编码核苷酸序列的载体,来表达胆碱乙酰转移酶。根据本发明的另一个实施方式，本发明提供一种包括将人神经干细胞的药剂学有效量给药到患有认知功能障碍的对象(subject)的步骤,上述人神经干细胞转化为包含人胆碱乙酰转移酶(choline acetyl transferase, ChAT)编码核苷酸序列的载体,来表达胆碱乙酰转移酶。根据本发明的又一实施方式，本发明提供一种药剂学组合物，该药剂学组合物包含人神经干细胞作为有效成分，用于阿尔茨海默病的治疗方法，上述人神经干细胞转化为包含人胆碱乙酰转移酶编码核苷酸序列的载体，来表达胆碱乙酰转移酶。根据本发明的还一个实施方式，本发明提供一种用于制备阿尔茨海默病治疗剂的人神经干细胞的用途Use)，上述人神经干细胞转化为包含人胆碱乙酰转移酶编码核苷酸序列的载体，来表达胆碱乙酰转移酶。根据本发明的其他一个实施方式，本发明提供一种药剂学组合物，该药剂学组合物包含人神经干细胞作为有效成分，用于认知功能障碍的治疗方法，上述人神经干细胞转化为包含人胆碱乙酰转移酶编码核苷酸序列的载体，来表达胆碱乙酰转移酶。根据本发明的其他一个实施方式，本发明提供一种用于制备认知功能障碍治疗剂的人神经干细胞的用途Use)，上述人神经干细胞转化为包含人胆碱乙酰转移酶编码核苷酸序列的载体，来表达胆碱乙酰转移酶。发明效果
本发明涉及一种人神经干细胞、包含该人神经干细胞作为有效成分的阿尔茨海默病治疗用药剂学组合物及认知功能障碍改善用组合物，上述人神经干细胞转化为包含人胆碱乙酰转移酶编码核苷酸序列的载体，来表达胆碱乙酰转移酶。将本发明的优点及效果归纳如下。(i)以表达本发明的人胆碱乙酰转移酶的方式转基因的人神经干细胞，在直接移植到阿尔茨海默病动物模型的脑内或通过血管注射等其他途径移植到阿尔茨海默病动物模型的脑内的情况下，上述人神经干细胞与宿主脑组织成功结合，并分化为神经元细胞(neuronal cell)及胶质细胞(glial cell)。(ii)本发明的转化为人胆碱乙酰转移酶表达载体的人神经干细胞株会直接移植到阿尔茨海默病动物模型的脑内，或通过血管注射等其他途径移植到阿尔茨海默病动物模型的脑内，来使胆碱乙酰转移酶进行稳定的表达，从而将减少的乙酰胆碱的浓度恢复到正常水准。(iii)本发明的表达胆碱乙酰转移酶的人神经干细胞将学习能力及记忆能力受损的阿尔茨海默病动物模型的认知能力恢复到正常水准。(iv)本发明的表达胆碱乙酰转移酶的人神经干细胞能够用于阿尔茨海默病的治疗及该阿尔茨海默病引起的认知功能障碍的改善。
图1的A部分显示包含人胆碱乙酰转移酶全长cDNA的，具有质粒pLPCX.ChAT的逆转录病毒载体的结构。本发明的F3.ChAT人神经干细胞是将上述载体感染到F3人神经干细胞来制备的。图1的B部分是显示胆碱乙酰转移酶mRNA表达的逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)分析结构的图片。图1的C部分显示F3细胞及多个F3.ChAT细胞的形态。图1的D部分是在F3细胞及多个F3.ChAT细胞中以免疫细胞化学方式对胆碱乙酰转移酶蛋白质进行确认的结果。比例尺为50μηι。永生化神经干细胞(Neural Stem Cell)细胞株，HBl.F3 (F3)将15周身孕的人胎儿脑的I次培养细胞利用对v-myc肿瘤基因进行涂敷的逆转录病毒载体来感染来进行确立(9，11，28)。F3NSC细胞株利用对人胆碱乙酰转移酶基因进行涂敷的逆转录病毒来感染。并使用包含全长人胆碱乙酰转移酶cDNA的质粒pLPCX.ChAT0利用应用脂质体(SuperFect)试剂将PG13小鼠(mouse)包装细胞株转染为pLPCX.ChAT载体，并对稳定的PG13细胞株使用5 μ g/ml的嘌呤霉素7天，来进行筛选。从PG13.ChAT细胞中收集到的无法复制逆转录病毒载体用于人神经干细胞的感染，对嘌呤霉素抗性F3.ChAT克隆进行·分离，并将作为其中一个克隆的F3.ChAT.D2扩张来用于移植。执行逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)，用于胆碱乙酰转移酶mRNA表达分析，并将培养物在人胆碱乙酰转移酶中与特殊的I次抗体进行培养后，以4’，6_ 二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)进行染色，以用于胆碱乙酰转移酶蛋白质的确认。多个细胞利用抗荧光淬灭封片溶液来安装在滑动玻璃上，并在奥林巴斯(Olympus)激光扫描共聚焦显微镜下进行观察。图2的A部分至D部分显示向注入AF64A的大鼠移植(I X IO6细胞/大鼠)人F3.ChAT细胞后，9周的大鼠脑中的人F3.ChAT细胞(通过人核基质抗原(hNuMA)阳性反应来确认)的分布。图2的E部分显示向注入AF64A的大鼠移植(I X IO6细胞/大鼠)人F3.ChAT细胞后，9周的大鼠脑中通过人F3.ChAT细胞(通过人核基质抗原(hNuMA)阳性反应来确认)的胆碱乙酰转移酶产生分布。图2的F部分至G部分显示向注入AF64A的大鼠移植(I X IO6细胞/大鼠)人F3.ChAT细胞后，9周的大鼠脑中的人F3.ChAT细胞(通过人核基质抗原(hNuMA)阳性反应来确认)以星形胶质细胞(由胶质纤维酸性蛋白(GFAP)染色；F部分)及神经细胞(由纳滤组合(NF-Mix)染色；G部分)分别进行分化。图3显示接着2周的AF64A预处理(3nmol/大鼠)，后移植F3细胞或F3.ChAT细胞的大鼠的脑脊液(CSF)的乙酰胆碱浓度的检测结果。A部分和B部分分别显示进行移植后的5周时点及9周时点的结果。脑脊液中的Ach浓度利用Amplex Red乙酰胆碱/乙酰胆碱酯酶分子探针(Molecular Probes)来测定。在此分析中，Ach通过AChE进行水解，从而排放胆碱，而这又重新通过胆碱氧化酶氧化为甜菜碱(betaine)及过氧化氢(H202)。过氧化氢在辣根过氧化酶(horseradish peroxidase)的存在下，与突光试剂(AmplexRed, 7-dihydroxyphenoxazine)进行相互作用，从而产生具有非常高的突光特性的试卤灵(resorufin)o产生的突光是通过530nm 560nm范围的放出及在530nm 590nm范围的激发，在荧光酶标仪中测定的。图4显示接着2周的AF64A预处理(3nmol/大鼠)，后移植F3细胞或F3.ChAT细胞(I X IO6细胞/大鼠)的大鼠在4周 5周时点(A部分及C部分)及8周 9周时点(B部分及D部分)的被动回避试验(A部分及B部分)及水中迷宫试验(C部分及D部分)的结果。.:正常对照群，▼:AF64A单独注射群，■:AF64A+F3移植群， :AF64A+F3.ChAT移植群。被动回避试验(passive avoidance trials)中，大鼠从明室(light room)通过闸门(guillotine door)进入暗室(dark compartment)时，以ImA给予2秒钟的电击。并记录从开启照明到停留在明室的时间。意味着记忆的完全获得的终点(end-point)设置为300秒钟。以每日一次，进行4天的试验(trial)后，为了确认记忆力的维持，在经过I周的时点，执行第5次试验。水中迷宫试验中，使大鼠进行连续4天，每天3次的试验，并为了确认记忆力的维持，在经过I周的时点，执行第5次试验。计算向平台逃避的平均逃避所需时间。实施方式以下，通过实施例对本发明进行更为详细的说明。对于本发明所属技术领域技术人员而言，这些实施例仅仅是为了更为具体地说明本发明而设，根据本发明的要点，本发明的范围并不局限于这些实施例是显而易见的。
实施例实施例1:人胆碱乙酰转移酶(ChAT)克隆及cDNA构建人胆喊乙酸转移酶(ChAT,choline acetyltrnasferase)全长 cDNA 通过与大鼠的末梢神经型胆碱乙酰转移酶相关的公知文献中已记述的方法(29)，从人小肠Marathon-Ready cDNA (酵母双杂交系统公司，芒廷维尤，加利福尼亚州；Clontech, Mountain View, CA)中，通过聚合酶链式反应(PCR)方法获得。质粒DNA的序列分析是利用ABI3100DNA序列分析仪(应用生物系统公司，福斯特城，加利福尼亚州=AppliedBiosystems, Foster City, CA)来执行。实施例2:人神经干细胞(Neural Stem Cells, NSCs)]将具有包含人胆碱乙酰转移酶全长cDNA的pLPCX.ChAT基因的逆转录酶病毒感染到HB1.F3 (F3)人神经 干细胞(NSC，neural stem cell)细胞株(8，9，11，28)，并筛选嘌呤霉素(puromycin)抗性细胞(13)。对胆碱乙酰转移酶过度表达克隆体的F3.ChAT进行分离，并通过逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)及免疫荧光显微镜分析胆碱乙酰转移酶的表达。实施例3:逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)分析利用TRIzoI (比彻姆(氏)研究实验室，盖瑟斯堡，马里兰州；BRL，Gaithersburg，MD)从人神经干细胞(NSC)培养物中提取总核糖核酸(RNA)。互补性DNA模板与寡脱氧胸苷引物一同利用400U的莫洛尼(氏)鼠白血病病毒(Moloney MurineLeukemia Virus)逆转录酶(普洛麦格公司，麦迪逊，威斯康星州；Promega, Madison, WI)执行25聚合酶链式反应(PCR)环节来准备，而PT-PCR产物是在包含溴化乙锭(ethidiumbromide, EtBr)的1.2%琼脂糖凝胶上进行分离。胆碱乙酰转移酶逆转录_聚合酶链反应(RT-PCR)中所使用的引物如下；正义核酸:5’ -CTGTGCCCCCTTCTAGAGC-3’(序列号2);反义核酸:5’ -CAAGGTTGGTGTCCCTGG-3’(序列号 3)。实施例4:神经干细胞细胞株的免疫细胞化学性分析F3.ChAT细胞在多聚赖氨酸涂敷的三氟氯乙烯均聚物(Aclar)塑料盖片上进行电镀，并在0.1M磷酸盐缓冲液内的4%多聚甲醛内以常温固定5分钟。将固定的培养物在人胆碱乙酰转移酶中与特殊抗体(I: 100,兔源多克隆抗体(rabbit polyclonal),科密困公司，蒂梅丘拉，加利福尼亚州；Chemicon, Temecula, CA) 一同在4°C下培养24小时，接着，与结合Alexa Fluor48的兔抗体IgG (分子探针公司，尤金，俄勒R州；MolecularProbes, Eugene, OR)—同在常温下培养I小时。为了能够确认多个细胞的一些核，利用4’，6- 二脉基-2-苯基卩引噪(DAPI, 4’, 6-diamidino_2-phenylindole)(西格玛公司，圣路易斯，密苏里州；DAPI，Sigma, St.Louis, MO)来进行对照染色。实施例5:阿尔茨海默病(Alzheimer disease)模型及神经干细胞的移植利用安氟醚(enfIurane)麻醉体重为220g 230g的雄性斯普拉-道来(氏)大鼠(Sprague-Dawley rat)(东方生物公司，城南市，韩国；0rient_Bio，Seongnam, Korea),并置于脑立体定位仪(stereotaxic frame)。切开皮肤、钻洞后，将新准备的AF64A (RBI公司，内蒂克，马萨诸塞州；RBI, Natick, MA)溶液(3nmol/3 μ I/大鼠)(17,20)从矢状缝合和冠状缝合的连接点(bregma)至尾部(posterior) 0.8mm,侧位(lateral) 1.5mm及腹部(ventral) 4.0mm的脑立体定位坐标上向右脑室内以0.5 μ I/分钟的流速进行脑室内(intracerebroventricular, icv)注入(17, 21)。2 周后，通过侧脑室(icv)注入，将 F3 或F3.ChAT细胞(I X IO6细胞/大鼠)移植到学习及记忆力受损的大鼠(n=15/组)的相同脑立体定位坐标部位。实施例6:学习能力/记忆力测试大鼠在移植细胞后，在4周 5周(n=8/组)或8周 9周(n=7/组)执行学习及记忆能力测试。为了记忆获取及维持的评价，连续4天执行一天一次的被动回避试验(passive avoidance trials),并在执行第4次试验I周后，即,第11天执行第5次试验。记录在暗室内对大鼠进行电击(以ImA进行2秒钟)后，在照明开启之后的从明室进入暗室前的停留时间。水中迷宫试验(water-maze trial)是在用温度维持在22°C +2°C的水填满的圆形水槽中执行。水槽区域分为4个区域，并将隐藏的逃避平台(直径10cm)隐藏在I个区域的中央的水中。将大鼠训练成观察迷宫外部的几个标志来寻找隐藏的平台。每天分别以5分钟的间隔执行3次试验，连续执行4天，并在第4次试验之后的一周后执行第5次试验。并记录逃向平台上的平均逃脱时间。实施例7:脑脊液中的乙酰胆碱浓度分析学习及记忆能力测试结束后，将大鼠处死，并采取脑脊液(cerebrospinalfluid, CSF),以用于分析乙酰胆碱(acethylcholine, ACh)的含量。脑脊液中的乙酰胆碱的浓度根据试剂盒制备人员的说明书，使用Amplex Red乙酰胆碱/乙酰胆碱酯酶分子探针(Molecular Probes)来测定。实施例8:对脑组织的免疫组织化学染色
将大鼠的脑以4%多聚甲醛溶液灌流地进行固定，并进行48小时的后固定后，在30%蔗糖中放置72小时后进行冻结保护。作为横截面，准备30μπι厚度的冰冻切片(cryosection),并使用人核基质抗原(hNuMA) (1:100,小鼠单克隆抗体，EMD Biosciences公司，圣地亚哥，加利福尼亚州)、胆碱乙酰转移酶(1:100,兔源多克隆抗体，Chemicon公司)、纳滤组合(NF-Mix) (1:1000,兔源多克隆抗体，Chemicon公司)或胶质纤维酸性蛋白(GFAP) (1:1000，兔源多克隆抗体，Chemicon公司)的特殊抗体，对人细胞确认用人核基质抗原(human nuclear matrix antigen)、具有功能的蛋白质胆碱乙酰转移酶(ChAT)、神经细胞确认用纳滤组合(NF-Mix )(神经丝蛋白)、星形胶质细胞确认用酸性蛋白质(胶质纤维酸性蛋白(GFAP))执行双重染色。将脑组织切片与I次抗体在4°C条件下进行一夜的培养，并与 Alexa Fluor-488 或 Alexa Fluor-594 (1:1000,分子探针(Molecular Probes))相结合的2次抗体在常温下进行I小时的培养。
实施例9:统计分析数据显示平均土标准误差。对行动数据的组间的比较中的统计学上的有意性通过单因素方差分析(one-way ANOVA)及双向方差分析(two-way AN0VA)决定。P-值<0.05的情况在统计学上视为有意。实施例10:胆碱乙酰转移酶表达的人神经干细胞的确立对人胆碱乙酰转移酶(ChAT)基因的向F3人神经干细胞(NSC)的转染，执行逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR, reverse transcriptase-polymerase chain reaction)分析，用于确认胆碱乙酰基mRNA在F3.ChAT神经干细胞内正常表达(参照图1的A部分及B部分)。F3.ChAT细胞与F3细胞相比，胆碱乙酰转移酶(ChAT)的mRNA表达及蛋白质合成水准非常高(图1的B部分及D部分)。F3.ChAT细胞显示与它的母细胞F3细胞具有类似的形态(图1的C部分)，并且，F3.ChAT细胞对胆碱乙酰转移酶(ChAT)抗体显示很高的阳性免疫反应(图1的D部分)。实施例11:向F3.ChAT细胞的`AF64A处理的大鼠脑移植的结果向进行AF64A处理的大鼠的脑室内移植F3.ChAT细胞(IX IO6细胞/大鼠)后，在第9周时点观察的结果，确认F3.ChAT细胞向脑整体区域分布(参照图2的A部分至D部分)。对胆碱乙酰转移酶(ChAT)的免疫反应性是从海马(hippocampus)、丘脑(thalamus)、下丘脑(hypothalamus)、皮质(cortices)及隔膜(septum)中检出。为了在体内确认移植的F3.ChAT细胞表达胆碱乙酰转移酶(ChAT)活性,对人核基质抗原(human nuclear matrixantigen, hNuMA)及胆碱乙酰转移酶使用特殊的抗体，来执行双重免疫染色。结果，观察到人核基质抗原阳性F3.ChAT细胞中的大部分会在移植后的9周会强烈表达胆碱乙酰转移酶(参照图2的E部分)。并且，发现了对人核基质抗原(hNuMA)及胶质纤维酸性蛋白(GFAP，glial fibrillary acidic protein)显示双阳性的同时,对人核基质抗原(hNuMA)及神经丝蛋白(neurofilament)显示双阳性的F3.ChAT细胞。上述结果意味着F3.ChAT细胞成功分化为星形胶质细胞(astrocyte)及神经细胞(neuron)(参照图2的F部分及G部分)。胆碱乙酰转移酶(ChAT)蛋白质是在移植后向脑整体区域分布的F3.ChAT细胞中检出，并直到9周时点，一直在体内生存(参照图2)。实施例12:基于F3.ChAT细胞移植的乙酰胆碱浓度的恢复AF64A (ethylcholine mustard aziridinium ion)是一种只通过高亲和性胆喊输送系统来吸收，并向胆碱性神经细胞的内部移动，从而对胆碱乙酰转移酶(ChAT)的mRNA表达及酶活性产生变化的胆碱类似体(choline analogue) (15_17)。向脑给药AF64A时，乙酰胆碱(ACh)的排出会减少，由此，会引发包括学习及记忆能力的缺乏的认知能力损伤(16-18)。因此，本发明为了检测由F3.ChAT细胞移植引起的记忆力提高的概念，使用了AF64A动物模型。例如，只要将乙酰胆碱(ACh)的水准减少25%-30%左右，不仅在β -淀粉样蛋白转化小鼠(Tg2576) (19)，还能在AF64A给药动物模型中显示严重的记忆力损伤，而这些症状在2周内开始，并持续11周以上(16-18，20)。将胆碱性毒素AF64A (3nmol/rat)向大鼠的脑室内注入后，在7周及11周时点检测脑脊液(CSF)内乙酰胆碱(ACh)浓度，结果发现，给药AF64A的大鼠的情况与给药生理盐水(saline)的对照组大鼠相比，乙酰胆碱的浓度显著减少(图3的A部分及B部分)。另一方面，在给药AF64A后的2周时点接受F3.ChAT细胞移植的大鼠的脑中，由于给药AF64A而减少的乙酰胆碱(ACh)的水准完全恢复，但作为比较组，接受F3细胞移植的大鼠脑中的乙酰胆碱(ACh )水准仍丨日维持在较低的水准。由于移植的神经干细胞的扩散分布，比起对特定脑区域，对脑脊液(CSF)中的乙酰胆碱(ACh)的浓度进行分析。这表示通过F3.ChAT细胞中的胆碱乙酰转移酶(ChAT)的mRNA表达(参照图1的B部分)及蛋白质的生成(参照图1的D部分)来增加脑脊液(CSF)中的乙酰胆碱(ACh)水准。实施例13:基于F3.ChAT细胞移植的学习及记忆能力的恢复进行AF64A处理的大鼠(用▼表示)在注入AF64A后2周时点(细胞移植前)、6周_7周(细胞移植后4周-5周)时点(图4的A部分及C部分)及10周-11周(细胞移植后8周-9周)时点(图4的B部分及D部分)执行的被动回避试验(图4的A部分及B部分)及水中迷宫试验(Morris water-maze)(图4的C部分及D部分)来检测，并显示与正常动物(用 表示)不同的学习能力及记忆能力的严重损伤。有趣的是，进行AF64A处理后接受F3.ChAT细胞移植的大鼠(用 表示)在移植后4周-5周及8周-9周时点恢复学习及记忆能力，相反的，为了进行比较，在 进行AF64A处理后接受F3细胞移植(用■表示)的情况未能显示如上所述的效果(.:正常对照组，▼:AF64A单独给药组，■:AF64A+F3移植组， :AF64A+F3.ChAT移植组)。如上所述，F3.ChAT细胞(IX IO6细胞/大鼠)的移植全面恢复脑中的乙酰胆碱(ACh)的水准(参照图3)，并由此推断将进行AF64A-处理的大鼠的学习及记忆能力提高到正常动物的水准(参照图4)。在F3母细胞的情况下，略微增加脑脊液(CSF)中的乙酰胆碱(ACh)的含量，但对于记忆能力提高而言，显示几乎能够忽视的效果。向F3及F3.ChAT细胞向伤口部位移动，从而以神经元(neuron)及星形胶质细胞(astrocyte)分化,并在移植后的9周后为止一直生存(参照图2)。由于扩散、分布在脑整体区域，因此，计算脑切片中的细胞的准确数量是不可能的。但是，确认了大部分的人核基质抗原(hNuMA)-阳性F3.ChAT细胞表达胆碱乙酰转移酶(参照图2)，而这意味着移植的F3.ChAT细胞在宿主脑组织的新环境下进行正常功能，并且，这得到在脑脊液(CSF)中增加的乙酰胆碱(ACh)水准的支持(参照图3)。通过上述本发明的实验，确认了将表达胆碱乙酰转移酶的人神经干细胞向进行AG64A-引导的阿尔茨海默病模型大鼠的脑中移植的情况下，将脑脊液(CSF)中的乙酰胆碱(ACh)水准几乎以正常水准恢复，从而对学习能力及记忆能力的恢复做出贡献。以上，对本发明的特定部分进行详细记述，此类具体记述仅仅是优选实例，本发明的范围不会限定于此，这对于本发明所属技术领域技术人员而言是显而易见的，因此，本发明的实质性范围由权利要求书及其等同替代来定义。参考文献1.Terry, R.D., Davies, P., Annu.Rev.Neurosc1.3, 77 (1980).
2.ffhitehouse, P.J.et al., Science215, 1237 (1982).
3.Coyle, T.J., Price, D.L., DeLong, M.R., Science219, 1184 (1983).
4.K.Kasa, P., Rakonczay, Z., Gulya, K., Prog.Neurobiol.52, 511 (1997).
5.Terry, A.V., Buccafusco, J.J., Pharmacol.Exp.Ther.306, 821 (2003).
6.Musial, A., Bajda, M., Malawska, B., Curr.Med.Chem.14, 2654 (2007).
7.Goldman, S.，Nat.Biotechnol.7，862 (2005).
8.Lindvallj 0.，Kokaiaj Z.，Nature441, 1094 (2006).
9.Kimj S.U.，deVellis, J.，J.Neurosc1.Res.87，2183 (2009).
10.Blurton-Jonesj M.et al.，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA106，13594 (2009).
11.Lee, H.J.et al.，Stem Cells25, 1204(2007).
12.Lee，S.T.et al.，Brainl31, 616 (2008).
13.Yasuharaj T.et al.，J.Neurosc1.26，12497 (2006).
14.Hwang, D.H.et al., Gene Ther.16，1034 (2009).
15.Fan, Q.1.，Haninj 1.，Neurochem.Res.24，15 (1999).
16.Yamazakij N.，Katoj K.，Kuriharaj E.，Nagaokaj A.，Psychopharmacology (Ber1.) 103,215(1991).
17.Besshoj T.，Takashinaj K.，Eguchij J.，Komatsu, T.，Saitoj K.，J.NeuralTransm.115，1019(2008).
I 8.Abe, E., Muraij S.，Masuda，Y.，Saito，H.，Itoh，T.，Br.J.Pharmacol.108，387 (1993).
19.Tsai, K.-J.，Tsai, Y._C.，Shenj C._K.，J.Exp.Med.204，1273 (2007).
20.Fisher, A.，Mantionej C.R.，Abraham, D.J.，Haninj 1.，J.Pharmacol.Exp.Ther.222，140(1982).
21.Takashinaj K.，Besshoj T.，Mori, R.，Eguchij J.，Saitoj K.，J.NeuralTransm.115，1027(2008).
22.Shimatoj S.et al., Gene Ther.14，1132 (2007).
23.Xuanj A.G.et al.，Neurosc1.Lett.440，331 (2008).
24.Wuj S.et al.，Pathobiology75, 186 (2008).
25.Srivastavaj N.，Seth, K.，Khannaj V.K.，Ansarij R.W.，Agrawalj A.K.，Int.J.Dev.Neurosc1.27，103 (2009).
26.Beck, K.D.et al.，Nature373，339 (1995).
27.Schbitzj W.R.et al.，Stroke31, 2212 (2000).
28.Kimj S.U.，Neuropathology24, 159 (2004).
29.Matsuo et al.，A.，Neurochem.1nt.46，423 (2005).
权利要求
1.一种人神经干细胞，其特征在于，上述人神经干细胞转化为包含人胆碱乙酰转移酶编码核苷酸序列的载体，来表达胆碱乙酰转移酶。
2.根据权利要求1所述的人神经干细胞，其特征在于，上述人胆碱乙酰转移酶具有序列号I的氨基酸序列。
3.根据权利要求1所述的人神经干细胞，其特征在于，上述人神经干细胞是原代培养神经干细胞或由该原代培养神经干细胞转基因而得的永生化的神经干细胞。
4.根据权利要求1所述的人神经干细胞，其特征在于，上述载体是腺病毒载体、逆转录病毒载体、腺-相关病毒载体、单纯疱疹病毒载体、猴病毒40载体、多形瘤病毒载体、乳头状瘤病毒载体、细小核糖核酸病毒载体、痘苗病毒载体或辅助依赖性腺病毒载体。
5.根据权利要求1所述的人神经干细胞，其特征在于，上述载体具有图1的A部分所公开的载体结构。
6.一种阿尔茨海默病治疗用药剂学组合物，其特征在于，包含权利要求1所述的人神经干细胞作为有效成分。
7.一种认知功能障碍改善用组合物，其特征在于，包含权利要求1所述的人神经干细胞作为有效成分。
8.根据权利要7所述的认知功能障碍改善用组合物，其特征在于，上述认知功能的障碍是由脑中乙酰胆碱的分泌减少引起的。
9.根据权利要7所述的认知功能障碍改善用组合物，其特征在于，上述认知功能为学习能力或记忆能力。
10.一种治疗阿尔茨海默病的方法，其特征在于， 包括将人神经干细胞的药剂学有效量给药到患有阿尔茨海默病的对象的步骤， 其中，上述人神经干细胞转化为包含人胆碱乙酰转移酶编码核苷酸序列的载体，来表达胆碱乙酰转移酶。
11.一种治疗认知功能的障碍的方法，其特征在于， 包括将人神经干细胞的药剂学有效量给药到患有认知功能障碍的对象的步骤， 其中，上述人神经干细胞转化为包含人胆碱乙酰转移酶编码核苷酸序列的载体，来表达胆碱乙酰转移酶。
12.—种药剂学组合物，其特征在于， 包含如下的人神经干细胞作为有效成分，用于阿尔茨海默病的治疗方法: 上述人神经干细胞转化为包含人胆碱乙酰转移酶编码核苷酸序列的载体，来表达胆碱乙酰转移酶。
13.—种药剂学组合物，其特征在于， 包含如下的人神经干细胞作为有效成分，用于认知功能的障碍的治疗方法: 上述人神经干细胞转化为包含人胆碱乙酰转移酶编码核苷酸序列的载体，来表达胆碱乙酰转移酶。
全文摘要
本发明涉及人神经干细胞、包含人神经干细胞的阿尔茨海默病治疗用药剂学组合物及学习能力或记忆能力等认知功能障碍改善用组合物，上述人神经干细胞转化为包含人胆碱乙酰转移酶编码核苷酸序列的载体，来表达胆碱乙酰转移酶。用于表达人胆碱乙酰转移酶的转基因的人神经干细胞在移植到阿尔茨海默病动物模型的脑的情况下，与宿主的脑组织成功结合，分化为正常的神经细胞，并稳定地表达胆碱乙酰转移酶，从而将减少的乙酰胆碱的浓度恢复到正常水准。并且，对认知功能受损的阿尔茨海默病动物模型的认知功能进行改善。因此，本发明的表达胆碱乙酰转移酶的人神经干细胞可开发为用于治疗阿尔茨海默病的药剂及用于改善由阿尔茨海默病引起的学习能力或记忆能力等认知功能障碍的药剂。
文档编号C12N5/10GK103189503SQ201180048580
公开日2013年7月3日 申请日期2011年7月4日 优先权日2010年10月8日
发明者金允培, 金承业 申请人:忠北大学校产学协力团