含有非复制型益生微生物的饮用酸乳制品的制作方法
【专利摘要】本发明涉及可饮用酸乳组合物领域。特别是，本发明提供了包含非复制型益生微生物的可饮用酸乳组合物。这些非复制型益生微生物例如可为生物活性的经热处理的益生微生物。本发明还涉及由这些非复制型益生微生物提供的健康益处。
【专利说明】含有非复制型益生微生物的饮用酸乳制品
[0001]本发明涉及可饮用酸乳组合物领域。特别是，本发明提供了包含非复制型益生微生物的可饮用酸乳组合物。这些非复制型益生微生物例如可为生物活性的经热处理的益生微生物。本发明还涉及由这些非复制型益生微生物提供的健康益处。
[0002]益生菌的健康益处同时已被本领域接受，并且例如总结于Blum等人.Curr IssuesIntest Microbiol.2003年9月;4 (2): 53—60中。益生菌经常与益生元一起在共生制剂中施用，这可更提高了健康益处。
[0003]当前益生菌通常例如在酸乳或酸乳饮料中出售。
[0004]可饮用的酸乳组合物看起来是特别优选的，因为它们可在早晨或在白天作为健康美食而被欣然地消费。
[0005]已知益生菌能够附着人体肠道细胞，并清除人体肠道细胞上的致病菌。为拥有这一活性，益生菌必须在产品中保持存活直至被消费。这对工业而言是一种挑战，并使得往食品中添加益生菌是不平凡的。
[0006]特别是，对于在生产过程中被加热、和/或在被消费之前可能有较长贮存时间的产品(诸如货架稳定产品)，通常认为难以保证益生菌在产品中保持存活直至被消费，此外也难以确保它们有活力地到达肠道。
[0007]期望能够获得这样的可饮用酸乳组合物，其甚至能够在对益生菌苛刻的条件下长时间贮存后提供益生菌的益处，而且制备简单。如果其通过使用对施与者安全、无副作用且应用现有的工业技术容易地掺入可饮用酸乳组合物的天然成分来实现，则是优选的。
[0008]还期望提供具有改善的免疫增强效果的包含益生菌的组合物。
[0009]还期望提供具有改善的抗炎效果的包含益生菌的组合物。
[0010]本发明人已经解决了此需要。因此本发明的目的为改进现有技术和提供满足上面所述的需要的可饮用酸乳组合物。
[0011]本发明人令人惊讶地看到通过独立权利要求的主题他们能够实现此目标。从属权利要求进一步发展了本发明的想法。
[0012]因此，本发明人提供了包含非复制型益生微生物的可饮用酸乳组合物。
[0013]向产品中添加非复制型益生微生物的一个优点是:与有活力的益生菌不同，当存在于产品中时，它们对纤维结构(texture)没有影响，因此组合物的口感不随时间改变。
[0014]此外，本发明人还能够表明非复制型益生菌能够提供益生菌的健康益处，并且甚至可能具有改善的益处。
[0015]因此，在终产品中保持益生菌存活以及确保它们有活力地到达肠道的复杂措施看来是不必要的。此外，在可饮用酸乳组合物中使用非复制型益生菌还使得允许在一制品中同时含有益生菌和益生元，而没有在产品的制备和贮存期间不希望的过早破坏纤维的风险。
[0016]本发明可饮用酸乳组合物中非复制型微生物的量可相应于每份约IO6至1012cfu。
[0017]很明显，非复制型微生物不形成菌落，因而，此术语理解为从IO4到1012cfu/g的复制型细菌获得的非复制型微生物的量。这包括失活的、无活力的或死亡的或以片段例如DNA或细胞壁或细胞质复合物存在的微生物。换句话说，组合物含有的微生物的量以微生物的菌落形成能力(Cfu)的量表示，就好像所述所有微生物是活的而不管它们实际上是否是非复制型的，例如失活的或死亡的、碎片的或任何或所有这些状态的混合物。
[0018]根据本发明的可饮用酸乳组合物可包含约80-90%重量的水、约3-15%重量的糖以及约2.5-5%重量的脱脂奶粉。
[0019]可饮用酸乳组合物还可包含约0.3-0.5%重量的果胶。
[0020]可饮用酸乳组合物可贮存于冷藏条件下。冷藏条件通常具有2°C至15°C、优选4°C至8 °C的温度。
[0021]可饮用酸乳组合物还可贮存于环境(ambient)条件下。环境条件通常具有16°C至25°C、优选18°C至23°C的温度。在环境条件下长时间保持益生菌活力是特别有挑战性的。因此，尤其对于在环境条件下贮存的可饮用酸乳组合物而言，添加非复制型益生微生物是赋予所述产品更多健康益处的有前途的途径。
[0022]可饮用酸乳组合物还可包含益生元。
[0023]“益生元”意指在肠中促进益生菌生长的食物物质。它们在摄入它们的人的胃和/或肠上部中不被分解或在胃肠道中不被吸收，但它们被胃肠微生物群和/或益生菌发酵。益生兀定义在例如 Glenn R.Gibson 和 Marcel B.Roberfroid, Dietary Modulationof the Human Colonic Microbiota:1ntroducing the Concept of Prebiotics, J.Nutr.1995125:1401-1412 中。
[0024]根据本发明可使用的益生元没有特别限制，包括在肠中促进益生菌生长的所有食物物质。优选的，它们可选自低聚糖，其任选包含果糖、半乳糖、甘露糖；膳食纤维，特别是可溶纤维、大豆纤维；菊粉；或其混合物。优选的益生元为低聚果糖(FOS)、低聚半乳糖(galacto-oligosaccharides) (IOS)、低聚异麦芽糖、低聚木糖、大豆低聚糖、葡糖基鹿糖(GS)、乳蔗糖(LS)、乳果糖(LA)、低聚异麦芽酮糖(PAO)、低聚麦芽糖(MOS)、树胶和/或其水解产物、果胶和/或其水解产物。
[0025]益生元的典型实例为低聚果糖和菊粉。
[0026]根据本发明的可饮用酸乳组合物中的益生元的量取决于它们促进乳酸菌生长的能力。
[0027]可饮用酸乳组合物例如可包含相当于至少103CfU/g益生元、优选IO4至107CfU/g益生元的量的益生菌。
[0028]本发明人惊奇地发现，例如，在免疫增强作用方面和/或在抗炎作用方面，非复制型益生微生物甚至可比复制型益生微生物更有效。
[0029]这是令人惊奇的，因为益生菌经常被定义为“当以足够的量施用时赋予宿主健康益处的活的微生物”(FA0/WH0指南)。绝大多数公开的文献涉及活益生菌。此夕卜，若干研究调查了由非复制型细菌递送的健康益处，它们中多数表明了益生菌的失活(例如，通过热处理)导致它们的声称的健康益处的损失(Rachmilewitz, D.等人，2004，Gastroenterologyl26:520 — 528;Castagliuolo 等人，2005，FEMS Tmmuno1.Med.Microbiol.43:197-204;Gill, H.S.和 K.J.Rutherfurd, 2001，Br.J.Nutr.86:285 —289; Kai la, M.等人，1995，Arch.Dis.Child72:51-53.)。一些研究显示了灭活的益生菌可保留一些健康作用(Rachmilewitz, D.等人，2004，Gastroenterology 126:520 —528;Gill, H.S.K.J.Rutherfurd, 2001, Br.J.Nutr.86:285 — 289)，但明确的是，本领域迄今认为活益生菌为更有效的。
[0030]“非复制型”益生微生物包括已被热处理的益生细菌。这包括失活的、死亡的、无活力的和/或以片段例如DNA、代谢物、细胞质复合物、和/或细胞壁物质存在的微生物。
[0031]“非复制型”意指没有活细胞和/或菌落形成单位能够由经典的平板培养法检出。此类经典的平板培养法总结于微生物学书:James Monroe Jay, Martin J.Loessner, DavidA.Golden.2005.Modern food microbiology.第 7 版，Springer Science, New York, N.Y.790p中。典型地，可如下表明不存在活细胞:在用不同浓度的细菌制备物(“非复制型”样品)接种和在适当条件(需氧和/或厌氧气氛下至少24小时)温育之后，在琼脂平板上没有可见的菌落或液体生长培养基中浊度不增加。
[0032]对于本发明的目的，益生菌定义为“对宿主的健康或安康具有有益作用的微生物细胞制备物或微生物细胞的组分”(Salminen S，Ouwehand A.Benno Y.等人“Probiotics:how should they be defined”Trends Food Sc1.Technol.1999:10107-10)。
[0033]本发明的组合物包含足以至少部分地产生健康益处的量的益生微生物和/或非复制型益生微生物。足以实现所述的量被定义为“治疗有效剂量”。对该目的有效的量将取决于本领域技术人员所知的许多因素例如消费者的重量和一般健康状态，并取决于食物基质(matrix)的影响。
[0034]在预防性应用中，以足以至少部分降低患病风险的量对易患病或有患病风险的消费者施用根据本发明的组合物。此类量被定义为“预防有效剂量”。再一次，准确的量取决于许多因素例如消费者的健康状态和重量，并取决于食物基质的影响。
[0035]本领域技术人员能够适当地调整治疗有效剂量和/或预防有效剂量。
[0036]一般来说，本发明的组合物含有治疗有效剂量和/或预防有效剂量的非复制型益生微生物。
[0037]典型地，治疗有效剂量和/或预防有效剂量在每日剂量约0.005mg -1OOOmg非复制型益生微生物的范围内。
[0038]优选地，非复制型微生物以相当于IO4至109cfu/g干组合物的量存在，更优选以相当于IO5至109cfu/g干组合物的量存在
[0039]可通过本领域已知的任何方法使益生菌成为非复制型的。
[0040]当今可用的使得益生菌菌株成为非复制型的技术通常为热处理、Y-辐射、UV线或使用化学试剂(福尔马林，多聚甲醛)。
[0041]就数量而言，“短时间高温”处理的非复制型微生物可以以相当于IO4至IO12当量cfu/g干组合物的量存在于组合物中。
[0042]优选地，使用在食品工业的工业环境下相对容易应用的致使益生菌成为非复制型的技术。
[0043]例如，可使益生菌成为非复制型的，并可作为非复制型益生菌添加至可饮用酸乳组合物中。
[0044]当今市场上的多数含有益生菌的产品在它们的生产过程中被热处理。因此，能够与生产的产品一起或至少以相似的方式热处理益生菌，同时益生菌保持或提高它们的有益的性质或甚至获得对消费者的新的有益性质，将是方便的。[0045]因此，还可将益生菌以有活力的形式添加至可饮用酸乳组合物中，并在该可饮用酸乳的正常生产过程中的加热处理步骤期间使其成为非复制型的。
[0046]在文献中，通过热处理的益生微生物失活通常与益生菌活性的至少部分丧失相关联，然而本发明人现在惊奇地发现，例如，通过热处理使得益生微生物成为非复制型不导致益生菌健康益处的丧失，相反地，可增强现存的健康益处，并且甚至产生新的健康益处。
[0047]因此，本发明的一个实施方案是可饮用酸乳组合物，其中非复制型益生微生物通过热处理成为非复制型的。
[0048]可在至少71.5°C处理至少I秒来进行此热处理。
[0049]可使用长时热处理或短时热处理。
[0050]在当今工业规模中，通常优选短时热处理，例如UHT-样热处理。这类热处理减少细菌负载，并且减少加工时间，从而减少营养物质的破坏。
[0051]本发明人首次证实，不管它们的初始性质，被高温短时间热处理的益生微生物表现了抗炎免疫谱(profile)。特别地通过这种热处理发展新的抗炎谱或加强现有的抗炎谱。
[0052]因此通过使用特定的热处理参数，现在可能产生具有抗炎免疫谱的非复制型益生微生物，即使活的对应物不是抗炎菌株，所述热处理参数对应于典型的工业可应用的热处理。
[0053]因此，例如，热处理可为在约71.5 - 150°C、约1-120秒的高温处理。高温处理可为高温/短时(HTST)处理或超高温(UHT)处理。
[0054]益生微生物可在约71.5 - 150°C高温处理约1-120秒的短时间。
[0055]更为优选地，所述微生物可在约90 - 140°C例如90 — 120°C高温处理约1_30秒的短时间。
[0056]此高温处理使得微生物至少部分成为非复制型的。
[0057]可在正常大气压力但也可在高压力下进行高温处理。典型的压力范围是I至50巴，优选I至10巴,更优选2至5巴。明显地，当加热时，优选在为液体或固体的介质中热处理益生菌。因此，应用的理想的压力将取决于提供微生物的组合物的性质和使用的温度。
[0058]高温处理可在约71.5_150°C、优选约90_120°C、更优选约120_140°C的温度范围内进行。
[0059]高温处理可进行约1-120秒、优选约1-30秒、更优选约5-15秒的短时间。
[0060]该给定的时间范围指益生微生物在给定的温度下的时间。需注意的是，取决于提供微生物的组合物的性质和量以及取决于使用的加热装置的构造，热施用的时间可不同。
[0061]然而，典型地，本发明的组合物和/或微生物通过高温短时(HTST)处理、巴氏瞬间灭菌法或超高温(UHT)处理来进行处理。
[0062]UHT处理是超高温加工或超热处理(两者都缩写为UHT)，涉及通过大约1_10秒、温度超过135°C (275° F)短时加热的组合物的至少部分灭菌，所述温度是杀死奶中的细菌芽孢所需要的温度。例如，使用超过135°C温度用这种方法加工奶使得在必要持续时间内(至2-5秒)降低细菌负载，使能够连续流操作。
[0063]有两种主要类型的UHT系统:直接和间接系统。在直接系统中，通过蒸汽注射或蒸汽输注处理产品，而在间接系统中，使用平板热交换器、管状热交换器或刮面热交换器热处理产品。可在产品制备方法中的任一步骤或多个步骤中应用UHT系统的组合。[0064]HTST处理如下定义(高温/短时):巴氏灭菌法设计达到5-log减少，杀死在奶中活的微生物数量的99.9999%。这被认为足以破坏几乎全部酵母、霉菌和常见的腐败细菌，并且也保证常见病原性热抗性生物的足够的破坏。在HTST方法中，加热奶至71.7°C (161° F)达15 — 20秒。
[0065]巴氏瞬间灭菌法是易腐的饮料(如水果和蔬菜汁、啤酒和乳制品)的热巴氏灭菌的方法。它在装入容器前完成，以杀死腐败微生物，以使得产品更安全以及延长它们的贮存期限。液体在71.50C (160° F)至74°C (165° F)温度处理约15到30秒的同时以受控制的连续流移动。
[0066]对于本发明的目的，术语“短时高温处理”应包括例如高温短时(HTST)处理、UHT处理和巴氏瞬间灭菌法。
[0067]由于此类热处理提供了具有改善的抗炎谱的非复制型益生菌，本发明的组合物可用于炎性疾病的预防或治疗。
[0068]不特别限制能够通过本发明的组合物治疗或预防的炎性疾病。例如，它们可选自急性炎症例如脓毒病；灼伤；和慢性炎症，例如炎性肠病，例如，克罗恩病、溃疡性结肠炎、隐窝炎(pouchitis);坏死性小肠结肠炎；皮肤炎症，例如UV或化学诱导的皮肤炎症、湿疹、反应性皮肤；肠易激综合征；眼炎症；变态反应、哮喘；和它们的组合。
[0069]如果使用长时热处理使得益生微生物成为非复制型，可在约70 - 150°C温度范围内达约3分钟-2小时，优选地在80 — 140°C范围内从5分钟-40分钟进行此类热处理。
[0070]尽管现有技术通常教导通过长时热处理变成非复制型的细菌通常就发挥它们的益生性质而言不如活细胞有效，但是本发明人能够证实与它们的活对应物相比被热处理的益生菌在刺激免疫系统中是优越的。
[0071]本发明也涉及包含益生微生物的组合物，所述微生物通过在至少约70°C、至少约3分钟的热处理成为非复制型的。
[0072]通过体外免疫谱分析(immuneprofiling)确认非复制型益生菌的免疫增强作用。使用的体外模型使用来自人外周血单核细胞(PBMC)的细胞因子谱分析并且作为测试免疫调节化合物的标准模型在本领域中被广为接受(Schultz等人，2003，Journal of Dairy Research70, 165 — 173;Taylor 等人，2006，Clinicaland Experimental Allergy, 36, 1227-1235;Kekkonen 等人，2008，World Journal ofGastroenterology, 14, 1192-1203)。
[0073]若干作者/研究队伍已经使用了体外PBMC测定法，以例如根据益生菌的免疫谱，即它们的抗或促炎特征对它们分类(Kekkonen等人，2008，WorldJournal of Gastroenterology, 14, 1192-1203)。例如，在结肠炎小鼠模型中已经显示出此测定法允许预测益生候选物的抗炎作用(Foligne, B.,等人，2007，WorldJ.Gastroenterol.13:236-243)。此外，在临床试验中此测定法被经常地用作读出(read-out)测定法并且显示了此测定法导致与临床结果一致的结果(Schultz等人，2003，Journal of Dairy Research70, 165 — 173;Taylor 等人，2006，Clinical andExperimental Allergy, 36, 1227-1235)。
[0074]在过去的几十年中变态反应性疾病稳定地上升并且当前WHO认为它们是流行病。一般地，认为变态反应由免疫系统的Thl和Th2应答的不平衡造成，所述不平衡导致强烈偏向于Th2介质的生产。因此，通过恢复免疫系统的Thl分路和Th2分路之间的适当的平衡能够缓和、下调或预防变态反应。这暗示了减少Th2应答或至少瞬时增强Thl应答的必要性。后者将是免疫增强应答的特征，通常由例如较高水平的IFNy、TNF-a和IL-12伴随。(Kekkonen 等人，2008，World Journal of Gastroenterology, 14, 1192-1203; Vil janen M.等人，2005，Allergy, 60，494-500)。
[0075]本发明的可饮用酸乳组合物因而允许其治疗或预防与受损的免疫防御相关的疾病。
[0076]因此，不特别限制能够通过本发明组合物治疗或预防的与受损的免疫防御相关的疾病。
[0077]例如，它们可选自感染，特别地为细菌的、病毒的、真菌的和/或寄生虫感染；吞噬细胞缺乏；低的到严重的免疫抑制水平例如由应激或免疫抑制药物、化学疗法或放射疗法诱导的那些免疫抑制水平；较少免疫活性的免疫系统的天然状态，例如新生儿的那些免疫系统；变态反应；以及其组合。
[0078]本发明描述的可饮用酸乳组合物也允许其增强儿童对疫苗的应答，特别是对口服疫苗的应答。
[0079]任何量的非复制型微生物将会是有效力的。然而，一般优选，如果至少90%，优选至少95%，更优选至少98%，最优选至少99%，理想地至少99.9%，最理想地全部益生菌为非复制型的。
[0080]在本发明的一个实施方案中全部微生物为非复制型的。
[0081]因此，在本发明的组合物中至少90%，优选地至少95%，更优选地至少98%，最优选地至少99%，理想地至少99.9%，最理想地全部益生菌可为非复制型的。
[0082]所有益生微生物可用于本发明的目的。
[0083]例如，益生微生物可选自双歧杆菌属(bifidobacteria)、乳杆菌属(Iactobacilli)、丙酸杆菌属(propionibacteria)，或其组合，例如长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)、乳双歧杆菌(Bifidobacterium lactis)、动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)、短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)、婴儿双歧杆菌(Bifidobacterium infantis)、青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、干酿乳杆菌(Lactobacillus casei)、类干酿乳杆菌(Lactobacillus paracasei)、唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)、路氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)、约汉逊氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、双乙酸乳酸乳球菌(Lactococcus diacetylactis)、乳脂乳球菌(Lactococcus cremoris)、保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)、瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)、德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)、大肠杆菌(Escherichia coli)和 / 或它们的混合物。
[0084]根据本发明的组合物可包含例如选自长双歧杆菌NCC3001、长双歧杆菌NCC2705、短双歧杆菌NCC2950、乳双歧杆菌NCC2818、约汉逊氏乳杆菌LaU类干酪乳杆菌NCC2461、鼠李糖乳杆菌NCC4007、路氏乳杆菌DSMl7983、路氏乳杆菌ATCC55730、嗜热链球菌NCC2019、嗜热链球菌NCC2059、干酪乳杆菌NCC4006、嗜酸乳杆菌NCC3009、干酪乳杆菌ACA-DC6002 (NCC1825)、大肠杆菌Nissle、保加利亚乳杆菌NCC15、乳酸乳球菌NCC2287，或它们的组合的益生微生物。
[0085]所有这些菌株根据布达佩斯条约保藏和/或是可商购的。
[0086]根据布达佩斯条约保藏的菌株如下:
[0087]长双歧杆菌NCC3001: ATCC BAA-999，分离于 1969 年 6 月
[0088]长双歧杆菌NCC2705: CNCM 1-2618，保藏于 2001.01.29
[0089]短双歧杆菌NCC2950 CNCM 1-3865，保藏于 2007.11.15
[0090]乳双歧杆菌NCC2818: CNCM 1-3446，保藏于 2005.06.07
[0091]类干酪乳杆菌NCC2461: CNCM 1-2116，保藏于 1999.01.12
[0092]鼠李糖乳杆菌NCC4007: CGMCC1.3724，保藏于2004年10月
[0093]嗜热链球菌NCC2019: CNCM 1-1422，保藏于 1994.05.18
[0094]嗜热链球菌NCC2059: CNCM 1-4153，保藏于 2009.04.24
[0095]乳酸乳球菌NCC2287: CNCM 1-4154，保藏于 2009.04.24
[0096]干酪乳杆菌NCC4006: CNCM 1-1518，保藏于 1994.12.30
[0097]干酪乳杆菌NCC1825: ACA-DC6002，保藏日不详
[0098]嗜酸乳杆菌NCC3009: ATCC700396，保藏日不详
[0099]保加利亚乳杆菌NCC15: CNCM 1-1198，保藏于 1992.04.02
[0100]约汉逊氏乳杆菌Lal CNCM 1-1225，保藏于1992.06.30
[0101]路氏乳杆菌DSM17938 DSM17938，保藏于 2006.02.06
[0102]路氏乳杆菌ATCC55730 ATCC55730，保藏于 1995.12.07
[0103]大肠杆菌Nisslel917: DSM6601，保藏日 1991.07.11
[0104]以 ATCC 命名的菌株保藏于 ATCC Patent Depository, 10801UniversityBlvd., Manassas, VA20110, USA。
[0105]以CNCM命名的菌株保藏于国立微生物保藏中心(CNCM)，25，杜博士路，F-75724巴黎15区，法国。
[0106]以CGMCC命名的菌株保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，微生物研究所，中国科学院，中关村，P.0.Box2714,北京100080，中国。
[0107]以ACA-DC 命名的菌株保藏于 Greek Coordinated Collectionsof Microorganisms,Dairy Laboratory, Department of Food Scienceand Technology,Agricultural University of Athens,75,Ieraodos, Botanikos, Athens, 11855,希腊。
[0108]以 DSM 命名的菌株保藏于 DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen undZellkulturen GmbH, Inhoffenstr.7B', 38124Braunschweig,德国。
[0109]本领域技术人员将理解他们能够自由地组合文中描述的本发明的全部特征而不偏尚本发明公开的范围。
[0110]本发明另外的优势和特点从下述实施例和图中显而易见。
[0111]图1A和B显示了用“短时高温”处理的益生菌的抗炎免疫谱(profiles)的增强。
[0112]图2显示了非抗炎益生菌菌株变为抗炎的，即非抗炎益生菌菌株在用“短时高温”处理后表现出显著的体外抗炎免疫谱。
[0113]图3A和B显示了在可商购的产品中使用的益生菌菌株，其在用“短时高温”处理之后表现出增强的或新的体外抗炎免疫谱。
[0114]图4A和B显示了乳品起子菌株(即Lcl起子菌株)，经高温热处理所述起子菌株表现出增强的或新的体外抗炎免疫谱。
[0115]图5显示了非抗炎益生菌菌株，在被HTST处理之后其表现出体外抗炎免疫谱。
[0116]图6:用以它们活的和热处理(140°C、15秒)形式的益生和乳品起子菌株生成的PBMC数据的主成分分析(IL-12p40、IFN- y、TNF- a、IL-10)。每一个点代表用NCC数字或名称标识的活的或热处理的一种菌株。
[0117]图1显示了活的和热处理的(85°C，20分钟)菌株的IL-12p40/IL-10比率。总体地，在85°C达20分钟的热处理导致IL-12p40/IL-10比率上升，与本发明的“短时高温”处理相反(图1、2、3、4、和5)。
[0118]图8显示了来自用热处理的细菌刺激的人PBMCs的体外细胞因子分泌的增强。
[0119]图9显示了在受盐水攻击的OVA致敏的小鼠中(阴性对照)、在受OVA攻击的OVA致敏的小鼠中(阳性对照)和在受OVA攻击以及用热处理的或活的短双歧杆菌NCC2950处理的OVA致敏的小鼠中观测到的腹泻强度百分数。以腹泻强度百分数展示结果(从4个独立实验中计算平均值土SEM)，100%腹泻强度对应于在阳性对照(由变态反应原致敏和攻击)组中出现的症状。
[0120]实施例1:
[0121]方法学:
[0122]细菌制备物
[0123]通常认为活的益生菌对宿主免疫系统递送的健康益处是菌株特异性的。已经显示诱导高水平的IL-10和/或体外诱导低水平的促炎细胞因子(PBMC测定法)的益生菌是有效的体内抗炎菌株(Foligne, B.等人，2007，World J.Gastroenterol.13:236-243)。
[0124]使用若干益生菌菌株以研究热处理的益生菌的抗炎性质。这些菌株为长双歧杆菌NCC3001、长双歧杆菌NCC2705、短双歧杆菌NCC2950、乳双歧杆菌NCC2818、类干酪乳杆菌NCC2461、鼠李糖乳杆菌NCC4007、干酪乳杆菌NCC4006、嗜酸乳杆菌NCC3009、干酪乳杆菌ACA-DC6002 (NCC1825)和大肠杆菌Nissle。也测试了包括商业用于生产Nestl6 Lcl发酵产物的一些菌株在内的若干起子培养物菌株:嗜热链球菌NCC2019、嗜热链球菌NCC2059、保加利亚乳杆菌NCC15和乳酸乳球菌NCC2287。
[0125]在对每一菌株优化的条件下在5 - 15L的生物反应器中培养细菌细胞。全部的典型细菌生长培养基为可用的。此类培养基为本领域技术人员所知。当调整pH至5.5时，连续地加入30%碱溶液(NaOH或Ca(OH)2)。当足够时，通过用CO2充气顶部空间维持厌氧的条件。在标准需氧条件下培养大肠杆菌。
[0126]通过离心(5000xg，4°C)收集细菌细胞并且重悬于足够体积的磷酸盐缓冲液(PBS)中以达到约109-101QCfu/ml的最终浓度。一部分制备物与15%甘油冷冻在-80°C。通过以下方法热处理另一部分细胞:
[0127]-超高温:140°C达15秒；通过间接蒸汽注射。
[0128]-高温短时(HTST):通过间接蒸汽注射74°C、90°C和120°C处理15秒。[0129]-在水浴中长时间低温度(85°C，20分钟)
[0130]热处理后，在_80°C冻存样品直到使用。
[0131]细菌制备物的体外免疫谱分析:
[0132]评价活的和热处理的细菌制备物的免疫谱(即从体外人血细胞诱导特定细胞因子分泌的能力)。从血液过滤器分离人外周血单核细胞(PBMCs)。在通过细胞密度梯度分离之后，收集单核细胞并用Hank平衡盐溶液洗涤两次。随后在用10%胎牛血清(Bioconcept, Paris,法国)、1%L_ 谷氨酰胺(Sigma)、1% 青霉素 / 链霉素(Sigma)和 0.1%庆大霉素补充的Iscove改良的Dulbecco培养基(MDM，Sigma)中重悬细胞。随后在48孔板中用活的和热处理的细菌(相当于7xl06cfu/孔)温育PBMC(7xl05个细胞/孔)达36小时。在来自8个个体供体的PBMC上测试活的和热处理的细菌的作用，所述个体供体被分至两个分离的实验。在温育36小时之后，冷冻并在_20°C保存培养板直到细胞因子测量。对活细菌和它们热处理的对应物平行地实施(即，在同一实验中对同一批PBMC实施)细胞因子谱分析。
[0133]在36小时温育后依照制造者的说明书通过ELISA(R&D DuoSet Human IL-10, BDOptEIA人IL12p40、BD OptEIA人TNF a、BD OptEIA人IFN- y )确定在细胞培养物上清液中的细胞因子(IFN-Y、IL-12p40、TNF-a 和 IL-10)的水平。IFN-Y、IL_12p40、和 TNF-a是促炎细胞因子，而IL-1O是强效的抗炎介质。用4个个体供体的平均值(pg/ml)+/-SEM表示结果，并且结果代表了两个单独实验，每一个所述单独实验用4个供体实施。对每一菌株计算IL-12p40/IL-10的比率作为体内抗炎作用的预测值(Folign6，B.，等人，2007，WorldJ.Gastroenterol.13:236-243)。
[0134]把对每一菌株通过ELISA(见上)确定的细胞因子数值(pg/ml)转移入BioNumerics v5.10 软件(Applied Maths, Sint-Martens-Latem,比利时)。在此数据集上实施主成分分析(PCA，量度技术)。此分析包括就特征减去平均值和就特征除以方差。
[0135]结果
[0136]通过超高温(UHT)/高温短时(HTST)样处理生成的抗炎谱
[0137]将研究中的益生菌菌株进行一系列热处理(超高温(UHT)、高温短时(HTST)和85°C达20分钟)并且把它们的免疫谱和体外活细胞的那些免疫谱相比较。当与人PBMC —起温育时活微生物(益生菌和/或乳品起子培养物)诱导了不同水平的细胞因子产生(图1、2、3、4和5)。这些微生物的热处理以温度依赖性的方式改变了由PBMC生产的细胞因子的水平。“短时高温”处理(120°C或140°C，15秒)产生了具有抗炎免疫谱的非复制型细菌(图1、2、3和4)。实际上，UHT-样处理的菌株(140°C，15秒)诱导了更少的促炎细胞因子(TNF- a，IFN- y，IL_12p40)，同时维持或诱导额外的IL-1O产生(与活的对应物相比)。对于任何UHT-样处理的菌株，获得的IL-12p40/IL-10比率与活细胞相比更低(图1、2、3和4)。对于由HTST-样处理处理的细菌，即受到120°C持续15秒(图1、2、3和4)、或74°C和90°C持续15秒(图5)处理的细菌，这一观察结果也是有效的。热处理(UHT-样或HTST-样处理)对益生菌菌株(图1、2、3和5)和乳品起子培养物(图4)的体外免疫谱具有相似的效果。对用活的和热处理的(140°C，15秒)益生菌和乳品起子菌株生成的PBMC数据的主成分分析揭示了活的菌株全部沿X轴分散，表明菌株表现出非常不同的体外免疫谱，从低(左侦U)促炎细胞因子的诱导物到高(右侧)促炎细胞因子的诱导物。热处理的菌株聚集在图表左侧，显示了热处理菌株更少诱导促炎细胞因子(图6)。与之相反，在85°C达20分钟的热处理的细菌比活细胞诱导更多的促炎细胞因子和更少的IL-10，导致更高的IL-12p40/IL-10比率(图7)。
[0138]UHT-样和HTST-样处理增强或生成抗炎谱。
[0139]不管它们各自初始的免疫谱(活细胞)，UHT和HTST处理的菌株表现出抗炎谱。已表明，在“短时高温”处理以后，已知为体内抗炎且体外表现抗炎谱的益生菌菌株(长双歧杆菌NCC3001、长双歧杆菌NCC2705、短双歧杆菌NCC2950、乳双歧杆菌NCC2818)表现出增强的体外抗炎谱。如图1中所示，UHT-样处理的双歧杆菌属菌株的IL-12p40/IL-10比率低于来自活的对应物的那些比率，因此显示了 UHT-样处理的样品的提高的抗炎谱。更突出地，对于非抗炎的活菌株也确认了由HUT-样和HTST-样处理产生抗炎谱。活鼠李糖乳杆菌NCC4007和类干酪乳杆菌NCC2461都表现出体外高IL-12p40/IL_10比率(图2和5)。显示了这两种活菌株对小鼠中TNBS-诱导的结肠炎是非保护性的。在“短时高温”处理(UHT或HTST)以后，由鼠李糖乳杆菌NCC4007和类干酪乳杆菌NCC2461诱导的IL-12p40/IL_10比率剧烈下降，达到与用双歧杆菌属菌株获得的水平一样低的水平。这些低IL-12p40/IL-10比率由于与没有变化(鼠李糖乳杆菌NCC4007)或剧烈诱导(类干酪乳杆菌NCC2461)的IL-10分泌相结合的低水平IL-12p40产生所致(图2)。
[0140]因此:
[0141]-通过UHT-样和HTST-样热处理能够增强活微生物的抗炎谱(例如长双歧杆菌NCC2705、长双歧杆菌NCC3001、短双歧杆菌NCC2950、乳双歧杆菌NCC2818)。
[0142]-通过UHT-样和HTST-样热处理能够从非抗炎活微生物产生抗炎谱(例如鼠李糖乳杆菌NCC4007、类干酪乳杆菌NCC2461、乳品起子嗜热链球菌NCC2019)。
[0143]-对于从可商购的产品(包含益生大肠杆菌菌株)分离的菌株也显示了抗炎谱(图 3A&B)。
[0144]对于所有测试的益生菌和乳品起子例如乳杆菌、双歧杆菌和链球菌，UHT/HTST-样处理的影响是相似的。
[0145]将UHT/HTST-样处理施用于表现出不同体外免疫谱的若干乳杆菌、双歧杆菌和链球菌。与它们活的对应物相比，在UHT/HTST-样处理以后所有菌株诱导更少的促炎细胞因子(图1、2、3、4、5和6)，这证实了 UHT/HTST-样处理对获得的非复制型细菌的免疫性质的作用能够概括至全部益生菌，特别是概括至乳杆菌属和双歧杆菌属和特定的大肠杆菌株以及概括至全部乳品起子培养物，特别是概括至链球菌属、乳球菌属和乳杆菌属。
[0146]实施例2:
[0147]方法学:
[0148]细菌制备物:
[0149]使用5株益生菌菌株以研究非复制型益生菌的免疫增强性质:3株双歧杆菌(长双歧杆菌NCC3001、乳双歧杆菌NCC2818、短双歧杆菌NCC2950)和2株乳杆菌(类干酪乳杆菌NCC2461、鼠李糖乳杆菌NCC4007)。
[0150]在37°C、无pH控制下以分批发酵使细菌细胞在MRS上生长达16-18小时。把细菌细胞离心下来(5，000xg，4°C)并重悬于磷酸盐缓冲液中，然后在盐水中稀释，以达到约10E10cfu/ml的最终浓度。在水浴中在85°C将长双歧杆菌NCC3001、乳双歧杆菌NCC2818、类干酪乳杆菌NCC2461、鼠李糖乳杆菌NCC4007热处理20分钟。在水浴中在90°C将短双歧杆菌NCC2950热处理30分钟。将热处理的细菌悬液等分(aliquoted)并冻存于_80°C直到使用。活细菌贮存在_80°C、15%PBS-甘油中直到使用。
[0151]细菌制备物的体外免疫谱分析
[0152]评价活的和热处理的细菌制备物的免疫谱(即体外诱导人血细胞特定细胞因子分泌的能力)。从血液过滤器分离人外周血单核细胞(PBMCs)。在通过细胞密度梯度分离之后，收集单核细胞并用Hank平衡盐溶液洗涤两次。随后在用10%胎牛血清(Bioconcept, Paris,法国)、1%L_ 谷氨酰胺(Sigma)、1% 青霉素 / 链霉素(Sigma)和 0.1%庆大霉素补充的Iscove改良的Dulbecco培养基(MDM，Sigma)中重悬细胞。随后在48孔板中用活的和热处理的细菌(相当于7xl06cfu/孔)温育PBMC(7xl05个细胞/孔)达36小时。在来自8个个体供体的PBMC上测试活的和热处理的细菌的作用，所述个体供体被分至两个分离的实验。在温育36小时之后，冷冻并在_20°C保存培养板直到细胞因子测量。对活细菌和它们热处理的对应物平行地实施(即，在同一实验中对同一批PBMC实施)细胞因子谱分析。
[0153]在36小时温育后依照制造者的说明书通过ELISA (R&D DuoSet Human IL-10, BDOptEIA人IL12p40、BD OptEIA人TNF、BD OptEIA人IFN- y )确定在细胞培养物上清液中的细胞因子(IFN-Y、IL-12p40、TNF-a 和 IL-10)的水平。IFN-Y、IL_12p40、TNF-a 是促炎细胞因子，而IL-1O是强效的抗炎介质。用4个个体供体的平均值(pg/ml)+/-SEM表示结果，并且结果代表了两个单独实验，每一个所述单独实验用4个供体实施。
[0154]活的和热处理的短双歧杆菌NCC2950在预防变态反应性腹泻中的体内作用 [0155]使用变态反应性腹泻的小鼠模型以测试短双歧杆菌NCC2950的Thl促进作用(Brandt E.B 等人? JCI2003; 112 (11): 1666-1667)。在致敏(间隔 14 天，在第 0 和第 14 天2次腹膜内注射卵清蛋白(OVA)和硫酸铝钾)之后，用OVA 口服攻击雄性Balb/c小鼠6次(第27、29、32、34、36、39天)，导致瞬时的临床症状(腹泻)和免疫参数(总IgE、0VA特异性的IgE、小鼠肥大细胞蛋白质酶I即MMCP-1的血浆浓度)的改变。在OVA致敏之前四天(第-3、-2、_1、0天和第11、12、13和14天)和在攻击期间(第23至39天)通过管饲法施用活的或在90°C热处理30分钟的短双歧杆菌NCC2950。使用约109菌落形成单位(cfu)或相当的cfu/小鼠的日细菌剂量。
[0156]
[0157]热处理后“促炎”细胞因子分泌的诱导
[0158]体外评估热处理的细菌菌株刺激人外周血单核细胞(PBMC)分泌细胞因子的能力。在相同的体外测定法中将经热处理的细菌刺激PBMC的基于4种细胞因子的免疫谱与活细菌细胞诱导的基于4种细胞因子的免疫谱相比较。
[0159]将热处理的制备物平板接种并评估活菌数的缺乏。热处理的细菌制备物在平板接种后不产生菌落。
[0160]当与人PBMC —起温育时活的益生菌诱导不同的和菌株依赖性水平的细胞因子产生(图8)。与它们的活的对应物相比，益生菌的热处理改变了 PBMC产生的细胞因子的水平。热处理的细菌比它们的活的对应物诱导更多的促炎细胞因子(TNF-a、IFN-Y和IL-12p40)。相反,与活细胞对比,热处理的细菌诱导相似或更低量的IL-10 (图8)。这些数据显示了热处理的细菌比它们的活的对应物更能够刺激免疫系统且因此更能够增强弱化的免疫防御。换言之，体外数据说明了在热处理之后细菌菌株的提高的免疫增强效果。
[0161]为了说明热处理的短双歧杆菌NCC2950对免疫系统的增强的作用(与活细胞相比)，在变态反应性腹泻的动物模型中测试活的和热处理的短双歧杆菌NCC2950 (菌株A)。
[0162]与阳性对照组相比，在用热处理的短双歧杆菌NCC2950处理后，腹泻的强度显著地和持续地下降(41.1%±4.8)，而在用活的短双歧杆菌NCC2950处理后腹泻的强度仅降低了 20±28.3%。这些结果显示了热处理的短双歧杆菌NCC2950表现出比它的活的对应物增强的对变态反应性腹泻的保护作用(图9)
[0163]因此，显示了在热处理后益生菌增强免疫防御的能力被提高了。
[0164]其他实施例
[0165]可应用标准技术制备在冷藏温度(4_8°C )贮存的以下可饮用酸乳组合物。
【权利要求】
1.可饮用酸乳组合物，其包含非复制型益生微生物。
2.根据权利要求1的可饮用酸乳组合物，其包含非相当于每份约IO6至IO12Cfu的量的非复制型益生微生物。
3.根据前述项权利要求之一的可饮用酸乳组合物，其包含约80-90%重量的水、约3-15%重量的糖以及约2.5-5%重量的脱脂奶粉。
4.根据前述项权利要求之一的可饮用酸乳组合物，其还包含约0.3-0.5%重量的果胶。
5.根据前述项权利要求之一的可饮用酸乳组合物，特征在于所述组合物待在冷藏温度或环境温下贮存。
6.根据前述项权利要求之一的可饮用酸乳组合物，其还包含益生元，例如低聚果糖和菊粉。
7.根据前述项权利要求之一的可饮用酸乳组合物，其中益生微生物是通过热处理成为非复制型的，所述热处理优选是在至少71.5°C处理至少I秒的高温处理。
8.根据权利要求7的可饮用酸乳组合物，其中热处理为在约71.5 - 150°C处理约I 一120秒的高温处理，并且优选为高温/短时(HTST)处理或超高温(UHT)处理。
9.根据权利要求8的可饮用酸乳组合物，其用于预防或治疗炎性疾病。
10.根据权利要求7的可饮用酸乳组合物，其中热处理在约70- 150°C温度范围内进行约3分钟一 2小时,优选在80 — 14CTC范围内进行5分钟一 40分钟。
11.根据权利要求10的可饮用酸乳组合物，其用于预防或治疗与受损的免疫防御相关的疾病。
12.根据前述项权利要求之一的可饮用酸乳组合物，其中至少90%、优选至少95%、更优选至少98%、最优选至少99%、理想地至少99.9%、最理想地全部益生菌为非复制型的。
13.根据前述项权利要求之一的可饮用酸乳组合物，其中益生微生物选自双歧杆菌属(bifidobacteria)、乳杆菌属(Iactobacilli)、丙酸杆菌属(propionibacteria)或它们的组合，例如长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)、乳双歧杆菌(Bifidobacteriumlactis)、动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)、短双歧杆菌(Bifidobacteriumbreve)、婴儿双歧杆菌(Bifidobacterium infantis)、青春双歧杆菌(Bifidobacteriumadolescentis)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)、类干酿乳杆菌(Lactobacillus paracasei)、唾液乳杆菌(Lactobacillussalivarius)、路氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)、约汉逊氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)、植物乳杆菌(Lactobacillusp I ant arum)、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)、乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)、乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)、双乙酸乳酸乳球菌(Lactococcus diacetylactis)、乳脂乳球菌(Lactococcuscremoris)、保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)、瑞士乳杆菌(Lactobacillushelveticus)、德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)、大肠杆菌(Escherichia coli)和/或它们的混合物。
14.根据前述项权利要求之一的可饮用酸乳组合物，其中益生微生物选自长双歧杆菌NCC3001、长双歧杆菌NCC2705、短双歧杆菌NCC2950、乳双歧杆菌NCC2818、约汉逊氏乳杆菌LaU类干酪乳杆菌NCC2461、鼠李糖乳杆菌NCC4007、路氏乳杆菌DSM17983、路氏乳杆菌ATCC55730、嗜热链球菌NCC2019、嗜热链球菌NCC2059、干酪乳杆菌NCC4006、嗜酸乳杆菌NCC3009、干酪乳杆菌ACA-DC6002(NCC1825)、大肠杆菌Nissle、保加利亚乳杆菌NCC15、乳酸乳球菌NCC2287，或它们的组合。
15.根据前述项权利要求之一的可饮用酸乳组合物，其每日剂量含有约0.005mg —1000mg非复制型微生物 。
【文档编号】A23C9/123GK103648305SQ201180064202
【公开日】2014年3月19日 申请日期:2011年11月7日 优先权日:2010年11月5日
【发明者】A·梅赛尼尔, G·普里乌特, S·努特恩 申请人:雀巢产品技术援助有限公司