细胞毒诱导治疗剂的制作方法

细胞毒诱导治疗剂的制作方法
【专利摘要】本发明发现了新的多肽缔合体，该多肽缔合体维持BiTE所具有的强的抗肿瘤活性和安全性优异的性质，具有长的血中半衰期，并且通过取代抗原结合结构域，将各种细胞作为靶诱发细胞毒。
【专利说明】细胞毒诱导治疗剂
【技术领域】
[0001]本发明涉及多肽缔合体、该多肽缔合体的制备方法、和含有该多肽缔合体作为有效成分的细胞毒诱导治疗剂，该多肽缔合体使T细胞接近于靶癌细胞，通过T细胞对靶癌细胞的细胞毒活性，使癌症的治疗成为可能。本发明还涉及含有该细胞毒诱导治疗剂作为有效成分的用于治疗或预防各种癌症的药物组合物、或者使用该药物组合物的治疗方法。
【背景技术】
[0002]目前为止，显示优异的抗肿瘤效果的多数的治疗用抗体，作为以癌症治疗为目的的药物得以开发(非专利文献I)。已知这些治疗用抗体通过抑制癌细胞增殖所必需的信号、诱发细胞凋亡信号、或者ADCC(Antibody Dependent Cell-mediated Cytotoxicity ;抗体依赖性细胞毒)、Q)C (Complement Dependent Cytotoxicity ;补体依赖性细胞毒),发挥对癌细胞的抗肿瘤效果(非专利文献2)。通过抗体的Fe区与存在于NK细胞或巨噬细胞等的效应细胞上的Fe受体相结合，这些效应细胞对抗体所结合的靶癌细胞所发挥的细胞毒为ADCC。存在于抗体的结构中的补体结合部位上结合有补体复合体。通过在抗体所结合的细胞的细胞膜上存在于该复合体中的补体成分形成孔，来促进水或离子向细胞内流入而破坏细胞所引起的细胞毒为CDC。在现有的治疗用抗体中虽然确认到优异的作用，但通过给予这样的抗体而获得的治疗成效还无法满足需要。因此，期望开发发挥更为强有力的杀细胞活性的对癌症的治疗抗体。
[0003]除将上述的NK细胞或巨噬细胞作为效应细胞动员的ADCC当作其抗肿瘤效果的机理的抗体之外，将T细胞作为效应细胞动员的细胞毒当作其抗肿瘤效果的机理的抗体即T细胞募集抗体(T cell recruiting抗体、TR抗体)也从1980年代就被人们所知(非专利文献3?5)。TR抗体为双特异性抗体(bispecific antibody),该TR抗体包含对抗T细胞上的T细胞受体(TCR)复合体的任意一个构成亚单元的抗体、特别是与CD3epsilon链结合的抗体和与靶癌细胞上 的抗原结合的抗体。通过TR抗体同时与CD3印silon链和癌抗原结合，T细胞接近于癌细胞。从而被认为通过T细胞所具有的细胞毒作用，对癌细胞的抗肿瘤效果得以发挥。
[0004]作为TR抗体之一,也已知有被称为三官能抗体(trifunctional antibody)的抗体(非专利文献6、7)。该三官能抗体为与癌抗原结合的Fab和与CD3epsilon链结合的Fab分别包含在单臂中的whole IgG型的双特异性抗体。通过将对抗EpCAM的三官能抗体即卡妥索单抗(catumaxomab)向具有EpCAM表达阳性的癌细胞的恶性腹水患者的腹腔内进行给予，显示出对于恶性腹水症的治疗效果。在EU中以上述的治疗作为目的的卡妥索单抗的使用得以承认。
[0005]并且最近,被称为BiTE (bispecific T-cell engager)的TR抗体显不强的抗肿瘤作用这一事情得以认知(非专利文献8、9)。BiTE为具有对抗癌抗原的抗体的scFv与对抗⑶3epsilon链的抗体的scFv经由短的多肽接头相连接而成的分子型的TR抗体。报道称BiTE与目前为止已知的各种TR抗体相比具有优异的抗肿瘤作用(非专利文献9、10)。即，BiTE与其他TR抗体相比，在明显低的浓度、以及低的效应细胞:癌细胞比率(ET比例)之下，发挥出抗肿瘤效果。另外，在此效果的表达中，显示了无需预先将效应细胞通过IL-2或⑶28激动性抗体等进行活性化。与已知在临床上具有优异效果的Rituxan相比，对抗⑶19的BiTE即blinatumomab(MT103)在体外显示出非常强的对于癌细胞的伤害作用。并且，报道了:在最近进行的一期临床试验、二期临床试验中，显示出极为优异的抗肿瘤效果(非专利文献11) ο
[0006]由于卡妥索单抗在临床上显示药效而作为治疗药得以认可、和包含blinatumomab在内的多数的BiTE发挥强的抗肿瘤效果，因此暗示了将T细胞作为效应细胞动员的TR抗体与通常的ADCC作为其作用机制的抗体相比，具有极高的作为抗肿瘤药的潜在性。
[0007]然而，已知三官能抗体癌抗原非依赖性地同时与T细胞和NK细胞或巨噬细胞等细胞相结合，结果在这些细胞上表达的受体进行交联，由此诱导癌抗原非依赖性的各种细胞因子的表达。这样的细胞因子的表达的诱导被认为与由三官能抗体的全身给予而引起的细胞因子风暴样的副作用的发生相关联。实际上，已有报道:在对非小细胞肺癌患者全身给予卡妥索单抗而进行的一期临床试验中，5 μ g/身体(body)这样的极低的用量为最大许可给予量，给予超过以上的用量则会引起各种严重的副作用(非专利文献12)。给予这样低的用量的卡妥索单抗时，无法达到其有效血中浓度。即，给予这样低的用量的卡妥索单抗无法获得所期待的抗肿瘤作用。
[0008]另一方面、BiTE不同于卡妥索单抗，由于不具有Fe Y受体-结合部位，因此不会癌抗原非依赖性地使表达于T细胞和NK细胞或巨噬细胞等上的受体发生交联。因此，显示出在给予了卡妥索单抗的情况下不会引起可观察到的癌抗原非依赖性的细胞因子的诱导。然而，由于BiTE为欠缺Fe区的低分子量型的修饰抗体分子，因此与通常用作治疗用抗体的IgG型抗体相比较，存在给予患者的BiTE的血中半衰期明显短的问题点。实际上，已经显示:活体内给予的BiTE的血中半衰期为数小时左右(非专利文献13、14),在blinatumomab的临床试验中，通过使用微泵(minipump)的持续静脉内给予来进行blinatumomab的给予。这样的给予对于患者来说不仅为便利性明显差的给予法，也潜在着由机器的故障等引起的医疗事故的风险，不能称为理想的治疗法。
[0009]现有技术文献
[0010]非专利文献
[0011]非专利文献I:Clin Cancer Res.(2010) 16 (I)，11-20 ;
[0012]非专利文献2:Drug Des Devel Ther (2009) 3，7-16 ;
[0013]非专利文献3 =Nature (1985) 314 (6012), 628-31 ；
[0014]非专利文献4:1nt J Cancer (1988)41 (4)，609-15 ;
[0015]非专利文献5:Proc Natl Acad Sci USA (1986) 83 (5)，1453-7 ;
[0016]非专利文献6 =Cancer Treat Rev.(2010) 36 (6)，458-67 ；
[0017]非专利文献7 =Expert Opin Biol Ther (2010) 10 (8)，1259-69 ；
[0018]非专利文献8:Proc Natl Acad Sci USA.(1995) 92 (15)，7021-5 ;
[0019]非专利文献9:Drug Discov Today (2005)，10 (18)，1237-44 ;
[0020]非专利文献10:Trends Biotechnol (2004) 22 (5)，238-44 ；
[0021]非专利文献11:Science (2008) ,321(5891)，974-7 ;[0022]非专利文献12:Cancer Tmmunol Immunother (2007) 56 (10), 1637-44 ；
[0023]非专利文献13:Cancer Tmmunol Immunother.(2006) 55 (5), 503-14 ；
[0024]非专利文献14:Cancer Tmmunol Immunother.(2009) 58 (I), 95-109。

【发明内容】

[0025]发明所要解决的课题
[0026]本发明基于上述情況而设，目的在于:提供多肽缔合体、该多肽缔合体的制备方法、和含有该多肽缔合体作为有效成分的细胞毒诱导治疗剂，该多肽缔合体使T细胞接近于靶癌细胞，通过T细胞对靶癌细胞的细胞毒活性，使癌症的治疗成为可能。本发明的目的还在于:提供含有该细 胞毒诱导治疗剂作为有效成分的用于治疗或预防各种癌症的药物组合物、或者使用该药物组合物的治疗方法。
[0027]用于解决课题的手段
[0028]本发明人发现了新的多肽缔合体，该多肽缔合体维持BiTE所具有的强的抗肿瘤活性、和不会癌抗原非依赖性地诱导细胞因子风暴等这样的安全性上优异的性质，且具有长的血中半衰期。并且发现了通过取代多肽缔合体中的抗原结合结构域，该多肽缔合体将各种细胞作为靶诱发细胞毒。本发明人基于上述发现，明确了本发明涉及的多肽缔合体伤害癌细胞。并且，还发现了通过向多肽缔合体导入CH1/CL界面缔合控制和导入Knob intoHole(KiH)修饰，更高效地诱发细胞毒。另外，本发明人发现了本发明涉及的多肽缔合体作为有效成分的细胞毒诱导治疗剂可以治疗或预防各种癌症。
[0029]SP，本发明提供以下的〔I〕?〔68〕。
[0030]〔 I〕多肽缔合体，其包含下述的结构域:
[0031](I)抗原结合结构域；
[0032](2)含有Fe区的结构域，其中，该Fe区为Fe Y受体-结合活性降低的Fe区；和
[0033](3) T细胞受体复合体结合结构域。
[0034]〔2〕〔I〕所述的多肽缔合体，其中，T细胞受体复合体结合结构域为T细胞受体结合结构域。
[0035]〔3〕〔I〕所述的多肽缔合体，其中，T细胞受体复合体结合结构域为⑶3结合结构域。
[0036]〔4〕〔I〕?〔3〕中任一项所述的多肽缔合体，其中，抗原结合结构域为二价的抗原结合结构域。
[0037]〔5〕〔4〕所述的多肽缔合体，其中，二价的抗原结合结构域为具有F(ab' )2结构的结构域。
[0038]〔6〕〔5〕所述的多肽缔合体，其中，构成具有F(ab' ) 2结构的结构域的重链恒定区的两个多肽与构成Fe区的两个多肽分别相连接。
[0039]〔7〕〔6〕所述的多肽缔合体，其中，⑶3结合结构域与构成Fe区的一个或两个的CH3相连接。
[0040]〔8〕〔7〕所述的多肽缔合体，其中，构成⑶3结合结构域的重链Fv片段与构成Fe区的一个CH3相连接，构成⑶3结合结构域的轻链Fv片段与构成Fe区的另一个CH3相连接。[0041]〔9〕〔8〕所述的多肽缔合体，其中，构成⑶3结合结构域的重链Fv片段上连接有抗体的CHl结构域、和轻链Fv片段上连接有抗体的CL结构域。
[0042]〔10〕〔6〕所述的多肽缔合体，其中，⑶3结合结构域与构成F(aY )2的一个或两个的CL相连接。
[0043]〔11〕〔6〕所述的多肽缔合体，其中，⑶3结合结构域与构成F(aY )2的一个或两个的VH相连接。
[0044]〔12〕〔6〕所述的多肽缔合体，其中，⑶3结合结构域与构成F(aY )2的一个或两个的VL相连接。
[0045]〔13〕〔I〕?〔12〕中任一项所述的多肽缔合体，其中，⑶3结合结构域为Fv。
[0046]〔14〕〔I〕?〔7〕和〔10〕?〔12〕中任一项所述的多肽缔合体，其中，⑶3结合结构域为Fab。
[0047]〔15〕〔I〕?〔7〕和〔10〕?〔12〕中任一项所述的多肽缔合体，其中，⑶3结合结构域为scFv。
[0048]〔16〕〔I〕?〔15〕中任一项所述的多肽缔合体，其中，⑶3结合结构域为一价。
[0049]〔17〕〔I〕?〔3〕中任一项所述的多肽缔合体，其中，抗原结合结构域为一价的scFv和一价的Fab。
[0050]〔18〕〔17〕所述的多肽缔合体,其中，一价的scFv经由构成⑶3结合结构域的scFv与构成Fe区的一个多肽相连接，一价的F ab的重链Fv片段经由CHl区与构成Fe区的一个多肽相连接，该Fab的轻链Fv片段与CL区相连接。
[0051 ] 〔19〕〔1〕?〔3〕中任一项所述的多肽缔合体，其中，抗原结合结构域为二价的scFv。
[0052]〔20〕〔19〕所述的多肽缔合体，其中，一价的scFv经由构成⑶3结合结构域的重链Fv片段与构成Fe区的一个多肽相连接,另一个一价的scFv经由构成⑶3结合结构域的轻链Fv片段与构成Fe区的另一个多肽相连接。
[0053]〔21〕〔19〕所述的多肽缔合体，其中，一价的scFv经由构成⑶3结合结构域的scFv与构成Fe区的一个多肽相连接,另一个一价的scFv与构成Fe区的另一个多肽相连接。
[0054]〔22〕〔I〕?〔3〕中任一项所述的多肽缔合体，其中，抗原结合结构域和T细胞受体复合体结合结构域分别为一价的Fab。
[0055]〔23〕〔22〕所述的多肽缔合体，其中，构成抗原结合结构域的一价的Fab的重链Fv片段经由CHl区与构成Fe区的一个多肽相连接，该Fab的轻链Fv片段与CL区相连接；构成T细胞受体结合结构域的Fab的重链Fv片段经由CHl区与构成Fe区的另一个多肽相连接，该Fab的轻链Fv片段与CL区相连接。
[0056]〔24〕〔22〕所述的多肽缔合体，其中，构成抗原结合结构域的一价的Fab的重链Fv片段经由CHl区与构成Fe区的一个多肽相连接，该Fab的轻链Fv片段与CL区相连接；构成T细胞受体结合结构域的Fab的轻链Fv片段经由CHl区与构成Fe区的另一个多肽相连接，该Fab的重链Fv片段与CL区相连接。
[0057]〔25〕〔22〕所述的多肽缔合体，其中，构成抗原结合结构域的一价的Fab的重链Fv片段经由CHl区与构成Fe区的一个多肽相连接，该Fab的轻链Fv片段与CL区相连接；构成T细胞受体结合结构域的Fab的重链Fv片段经由CL区与构成Fe区的另一个多肽相连接，该Fab的轻链Fv片段与CHl区相连接。[0058]〔26〕〔22〕所述的多肽缔合体，其中，构成T细胞受体结合结构域的一价的Fab的重链Fv片段经由CHl区与构成Fe区的一个多肽相连接，该Fab的轻链Fv片段与CL区相连接；构成抗原结合结构域的Fab的轻链Fv片段经由CHl区与构成Fe区的另一个多肽相连接，该Fab的重链Fv片段与CL区相连接。
[0059]〔27〕〔22〕所述的多肽缔合体，其中，构成T细胞受体结合结构域的一价的Fab的重链Fv片段经由CHl区与构成Fe区的一个多肽相连接，该Fab的轻链Fv片段与CL区相连接；构成抗原结合结构域的Fab的重链Fv片段经由CL区与构成Fe区的另一个多肽相连接，该Fab的轻链Fv片段与CHl区相连接。
[0060]〔28〕〔22〕所述的多肽缔合体，该多肽缔合体包含下述的结构域:
[0061](I)抗原结合结构域，其中，结合在抗原上的一价的Fab结构的重链Fv片段经由CHl区与上述构成Fe区的一个多肽相连接，该Fab结构的轻链Fv片段与CL区相连接；和
[0062](2) T细胞受体复合体结合结构域，其中，结合在T细胞受体复合体上的一价的Fab结构的重链Fv片段经由CHl区与构成Fe区的另一个多肽相连接，该Fab结构的轻链Fv片段与CL区相连接，
[0063]并且，控制CHl区和CL区的电荷，使抗原结合结构域中的重链Fv片段与抗原结合结构域中的轻链Fv片段、或T细胞受体结合结构域中的重链Fv片段与T细胞受体结合结构域中的轻链Fv片段相缔合。〔29〕〔28〕所述的多肽缔合体，其中，连接于T细胞受体复合体结合结构域中的重链Fv片段的CHl区的氨基酸残基和连接于抗原结合结构域中的轻链Fv片段的CL区的氨基酸残基相互具有同种的电荷。〔30〕〔28〕所述的多肽缔合体，其中，连接于抗原结合结构域中的重链Fv片段的CHl区的氨基酸残基和连接于T细胞受体复合体结合结构域中的轻链Fv片段的CL区的氨基酸残基相互具有同种的电荷。〔31〕〔28〕所述的多肽缔合体，其中，连接于T细胞受体复合体结合结构域中的重链Fv片段的CHl区的氨基酸残基和连接于抗原 结合结构域中的轻链Fv片段的CL区的氨基酸残基相互具有同种的电荷、连接于抗原结合结构域中的重链Fv片段的CHl区的氨基酸残基和连接于T细胞受体复合体结合结构域中的轻链Fv片段的CL区的氨基酸残基相互具有同种的电荷。
[0064]〔32〕〔29〕或〔31〕所述的多肽缔合体，其中，连接于T细胞受体复合体结合结构域中的重链Fv片段的CHl区的氨基酸残基和连接于T细胞受体结合结构域中的轻链Fv片段的CL区的氨基酸残基相互具有不同种的电荷。
[0065]〔33〕〔30〕或〔31〕所述的多肽缔合体，其中，连接于抗原结合结构域中的重链Fv片段的CHl区的氨基酸残基与连接于抗原结合结构域中的轻链Fv片段的CL区的氨基酸残基也具有不同种的电荷。
[0066]〔34〕〔22〕?〔33〕中任一项所述的多肽缔合体，其中，T细胞受体复合体结合结构域为T细胞受体结合结构域。
[0067]〔35〕〔34〕所述的多肽缔合体，其中，T细胞受体结合结构域为⑶3结合结构域。
[0068]〔36〕〔32〕或〔33〕中任一项所述的多肽缔合体，其中，CHl区的氨基酸残基和CL区的氨基酸残基为选自由以下(a)?(f)所示的I组或2组以上氨基酸残基的组构成的组合:
[0069](a) CHl区的氨基酸残基且EU编号147位的氨基酸残基、和CL区的氨基酸残基且EU编号180位的氨基酸残基；[0070](b)CHl区的氨基酸残基且EU编号147位的氨基酸残基、和CL区的氨基酸残基且EU编号131位的氨基酸残基；
[0071](c)CHl区的氨基酸残基且EU编号147位的氨基酸残基、和CL区的氨基酸残基且EU编号164位的氨基酸残基；
[0072](d)CHl区的氨基酸残基且EU编号147位的氨基酸残基、和CL区的氨基酸残基且EU编号138位的氨基酸残基；
[0073](e)CHl区的氨基酸残基且EU编号147位的氨基酸残基、和CL区的氨基酸残基且EU编号123位的氨基酸残基；
[0074](f)CHl区的氨基酸残基且EU编号175位的氨基酸残基、和CL区的氨基酸残基且EU编号160位的氨基酸残基，
[0075]并且，CHl区的氨基酸残基和CL区的氨基酸残基为相互具有不同种电荷的氨基酸残基。
[0076]〔37〕〔36〕所述的多肽缔合体，其中，进一步选自包含以下的(g)所示氨基酸残基的组的组合:
[0077](g)CHl区的氨基酸残基且EU编号213位的氨基酸残基、和CL区的氨基酸残基且EU编号123位的氨基酸残基。
[0078](38)〔36〕或〔37〕所述的多肽缔合体，其中，上述具有不同种电荷的氨基酸残基为选自以下的(X)或(Y)的任一组合中所含有的氨基酸残基:`[0079](X)谷氨酸(E)、天冬氨酸⑶；
[0080](Y)赖氨酸⑷、精氨酸(R)、组氨酸⑶。
[0081]〔39〕〔36〕?〔38〕中任一项所述的多肽缔合体，其中，上述具有不同种电荷的氨基酸残基是=CHl区的氨基酸残基且EU编号175位的氨基酸残基为Lys，CL区的氨基酸残基且EU编号180位、131位和160位的氨基酸残基均为Glu。
[0082]〔40〕〔36〕?〔38〕中任一项所述的多肽缔合体，其中，上述具有不同种电荷的氨基酸残基是=CHl区的氨基酸残基且EU编号147位和175位的氨基酸残基为Glu，CL区的氨基酸残基且EU编号180位、131位和160位的氨基酸残基均为Lys。
[0083]〔41〕〔40〕所述的多肽缔合体，其中，进一步地，CHl区的氨基酸残基且EU编号213位的氨基酸残基为Glu，CL区的氨基酸残基且EU编号123位的氨基酸残基为Lys。
[0084]〔42〕〔I〕?〔41〕中任一项所述的多肽缔合体，其中，Fe区是对Fcy1、FcyIIA、Fe γ IIB、Fe Y IIIA和/或Fe Y IIIB中任一项的Fe Y受体-结合活性降低的Fe区。
[0085]〔43〕〔I〕?〔42〕中任一项所述的多肽缔合体，其特征在于:Fc区为构成SEQ IDNO:23记载的Fe区、SEQ ID NO:24记载的Fe区、SEQ ID NO:25记载的Fe区、或SEQ IDNO:26记载的Fe区的氨基酸发生突变的Fe区。
[0086]〔44〕〔43〕所述的多肽缔合体，其中，Fe区为构成Fe区的氨基酸中按照EU编号特定的下述任一种氨基酸的Fe区:
[0087]118位?260位的氨基酸序列为SEQ ID NO:24记载的序列；261位?447位的氨基酸序列为SEQ ID NO:26记载的序列。
[0088]〔45〕〔43〕所述的多肽缔合体，其中，Fe区为构成Fe区的氨基酸中按照EU编号特定的下述任一种氨基酸发生突变的Fe区:[0089]220 位、226 位、229 位、231 位、232 位、233 位、234 位、235 位、236 位、237 位、238位、239 位、240 位、264 位、265 位、266 位、267 位、269 位、270 位、295 位、296 位、297 位、298位、299 位、300 位、325 位、327 位、328 位、329 位、330 位、331 位、332 位。
[0090]〔46〕〔45〕所述的多肽缔合体，其特征在于:Fc区为构成SEQ ID NO:23记载的Fe区的氨基酸发生突变的Fe区。
[0091]〔47〕〔46〕所述的多肽缔合体，其中，Fe区为构成Fe区的氨基酸中按照EU编号特定的下述任一种氨基酸:即233位、234位、235位、236位、237位、327位、330位、331位在对应的IgG2或IgG4中被其EU编号对应的氨基酸取代的Fe区。
[0092]〔48〕〔46〕所述的多肽缔合体，其特征在于:Fc区为构成Fe区的氨基酸中按照EU编号特定的下述任一种氨基酸:即234位、235位、297位发生突变的Fe区。
[0093]〔49〕〔48〕所述的多肽缔合体，其特性在于:234位的氨基酸突变为丙氨酸、235位的氨基酸突变为丙氨酸、和/或、297位的氨基酸突变为丙氨酸。
[0094]〔50〕〔43〕?〔49〕中任一项所述的多肽缔合体，其特征在于:构成Fe区的两个多肽的序列相互具有不同的序列。
[0095]〔51〕〔I〕?〔50〕中任一项所述的多肽缔合体，其特征在于:构成Fe区的两个多肽的一个多肽的氨基酸残基中按照EU编号特定的349位的氨基酸突变为半胱氨酸、366位的氨基酸突变为色氨酸，另一个多肽的氨基酸残基中按照EU编号特定的356位的氨基酸突变为半胱氨酸、366位的氨基酸突变为丝氨酸、368位的氨基酸突变为丙氨酸、407位的氨基酸突变为缬氨酸。
[0096]〔52〕〔I〕?〔50〕中任一项所述的多肽缔合体，其特征在于:构成Fe区的两个多肽的一个多肽的氨基酸残基中按照EU编号特定的356位的氨基酸突变为赖氨酸，另一个多肽的氨基酸残基中按照EU编号特 定的439位的氨基酸突变为谷氨酸，其中任意一个多肽的氨基酸残基中按照EU编号特定的435位的氨基酸突变为精氨酸。
[0097]〔53〕〔51〕或〔52〕所述的多肽缔合体，其特征在于:存在于构成Fe区的两个多肽的羧基末端的序列GK缺失。
[0098]〔54〕〔I〕?〔53〕中任一项所述的多肽缔合体，其中，抗原结合结构域在相同的表位上结合。
[0099]〔55〕〔54〕所述的多肽缔合体，其中，相同的表位存在于由SEQ ID NO:2记载的氨基酸序列组成的蛋白质中。
[0100]〔56〕〔54〕所述的多肽缔合体，其中，相同的表位存在于由SEQ ID NO:4记载的氨基酸序列组成的蛋白质中。
[0101]〔57〕〔I〕?〔53〕中任一项所述的多肽缔合体，其中，抗原结合结构域在相互不同的表位上接合。
[0102]〔58〕〔57〕所述的多肽缔合体，其中，不同的表位存在于由SEQ ID NO:2记载的氨基酸序列组成的蛋白质中。
[0103]〔59〕〔57〕所述的多肽缔合体，其中，不同的表位存在于由SEQ ID NO:4记载的氨基酸序列组成的蛋白质中。
[0104]〔60〕多核苷酸,该多核苷酸编码〔I〕?〔59〕中任一项所述的多肽缔合体。
[0105]〔61〕载体,该载体包含〔60〕所述的多核苷酸。[0106]〔62〕细胞，该细胞持有〔61〕所述的载体。
[0107]〔63〕多肽缔合体的制备方法，该制备方法包含:将〔62〕所述的细胞进行培养，从培养上清中回收多肽缔合体。
[0108]〔64〕细胞毒诱导治疗剂，该治疗剂含有〔I〕?〔59〕中任一项所述的多肽缔合体作为有效成分。
[0109]〔65〕〔64〕所述的治疗剂，其中，细胞毒诱导治疗剂为癌症治疗剂。〔66〕〔65〕所述的治疗剂，其中，癌症为肝癌或肺癌。
[0110]〔67〕癌症的治疗或预防方法，其特征在于:将〔I〕?〔59〕中任一项所述的多肽缔合体给予需要治疗的患者。
[0111]〔68〕〔67〕所述的治疗或预防方法，其中，癌症为肝癌或肺癌。
[0112]本发明还涉及用于本发明方法的试剂盒，所述试剂盒含有本发明的多肽缔合体或通过本发明的制备方法制备的多肽缔合体。本发明还涉及本发明的多肽缔合体或通过本发明的制备方法制备的多肽缔合体在制备细胞毒诱导治疗剂中的应用。本发明还涉及用于本发明方法的、本发明的多肽缔合体或通过本发明的制备方法制备的多肽缔合体。
[0113]发明效果
[0114]通过本发明可以提供新的多肽缔合体，该多肽缔合体维持BiTE所具有的强的抗肿瘤活性和不会癌抗原非依赖性地诱导细胞因子风暴等这样的安全性上优异的性质，且具有长的血中半衰期。通过取代本发明的多肽缔合体中的抗原结合结构域，含有该多肽缔合体作为有效成分的细胞毒诱导治疗剂将包含癌细胞的各种细胞作为祀诱发细胞毒，可以治疗或预防各种癌症。对于患者来说，可以进行不仅安全性高，而且对身体的负担小且便利性也高的理想的治疗。
【专利附图】

【附图说明】
[0115]图1为显示GPC3ERY1 (GPC3BiTE)、GPC3ERY2、IgG型GPC3抗体的细胞毒活性的比较的图表。黑正方形( )表示GPC3ERY1 (GPC3BiTE)、黑三角形(▲)表示GPC3ERY2、白正方形(□)表示IgG型GPC3抗体的细胞毒活性。
[0116]图2为显示GPC3BiTE、GPC3ERY5的细胞毒活性的比较的图表。黑正方形( )表示GPC3BiTE、白圆形(〇)表示GPC3ERY5的细胞毒活性。
[0117]图3为显示GPC3BiTE、GPC3ERY6的细胞毒活性的比较的图表。黑正方形 表示GPC3BiTE、黑三角形(▲)表示GPC3ERY6的细胞毒活性。
[0118]图4为显示GPC3BiTE、GPC3ERY7的细胞毒活性的比较的图表。黑正方形( )表示GPC3BiTE、黑菱形(?)表示GPC3ERY7的细胞毒活性。
[0119]图 5 为显示 GPC3BiTE、GPC3ERY8-2、GPC3ERY9-l、GPC3ERY10-l 的细胞毒活性的比较的图表。黑正方形( 表示GPC3BiTE、黑三角形(▲)表示GPC3ERY8-2、白圆形(〇)表示GPC3ERY9-1、白正方形(口 )表示GPC3ERY10-1的细胞毒活性。
[0120]图6为显示PC-10预混(pre-mix)模型中的GPC3ERY8-2的体内抗肿瘤效果的图表。白正方形(口)表示GPC3ERY7给予组的肿瘤体积的变化。黑菱形(?)表示对照组(给予PBS)的肿瘤体积的变化。
[0121]图7为显示PC-10预混模型中的GPC3ERY10-1的体内抗肿瘤效果的图表。白正方形(□)表示GPC3ERY10-1给予组的肿瘤体积的变化。黑菱形(?)表示对照组(给予PBS)的肿瘤体积的变化。
[0122]图8为显示PC-10T细胞移入模型中的GPC3ERY10-1的体内抗肿瘤效果的图表。白正方形(口)表示GPC3ERY10-1给予组的肿瘤体积的变化。黑菱形(?)表示对照组(给予PBS)的肿瘤体积的变化。
[0123]图9为显示使用GPC3表达Ba/F3细胞来测定的GPC3ERY9-1和GPC3ERY10-1的血浆中浓度的推移的图表。黑菱形(?)表示GPC3ERY9-1、白正方形(□)表示GPC3ERY10-1的血浆中浓度的推移。
[0124]图10为显示使用CD3表达Ba/F3细胞来测定的GPC3ERY9-1和GPC3ERY10-1的血浆中浓度的推移的图表。黑菱形(?)表示GPC3ERY9-1、白正方形(□)表示GPC3ERY10-1的血浆中浓度的推移。
[0125]图 11 为显示基于 GPC3BiTE、GPC3ERY9-l、GPC3ERY10-l、GPC3ERY15-l、和卡妥索单抗的癌抗原非依赖性的细胞因子诱导能的评价的图表。
[0126]图 12 为显示 GPC3ERY18L1、GPC3ERY18L2、GPC3ERY18L3、GPC3ERY18L4、GPC3ERY18S1的体外细胞毒活性的图表。黑三角形(▲)表示GPC3ERY18L1、黑圆形(.)表示GPC3ERY18L2、黑正方形( )表示GPC3ERY18L3、白正方形(口 )表示GPC3ERY18L4、白菱形(?)表示GPC3ERY18S1的细胞毒活性。
[0127]图13为显示GPC3ERY18L3和GPC3ERY10-1的体外细胞毒活性的比较的图表。黑正方形( )表示GPC3ERY18L3、白正方形(口 )表示GPC3ERY10-1的细胞毒性。
[0128]图14为显示GPC3ERY19-3和GPC3BiTE的体外细胞毒活性的比较的图表。白正方形(□)表示GPC3ERY19-3、黑正方形( )表示GPC3BiTE的细胞毒活性。
[0129]图15A为显示表达了 NTAlL/NTAlR/GC33-kO的CM的尺寸排阻层析分析的结果的层析图。图15B为显示表达了 NTA2L/NTA2R/GC33-kO的CM的尺寸排阻层析分析的结果的层析图。
[0130]图16为构成本申请说明书的实施例中记载的多肽缔合体即GPC3BiTE、GPC3ERY2、GPC3ERY5、GPC3ERY6、GPC3ERY7、GPC3ERY8-2、GPC3ERY9-1、GPC3ERY10-1、GPC3ERY15、GPC3ERY18、和GPC3ERY19-3的各结构域的标识；以交叉线表示的结构域为抗癌抗原(GPC3、EpCAM、EGFR)抗体H链可变区、以斜线表示的结构域为抗癌抗原(GPC3、EpCAM、EGFR)抗体L链可变区、以点线表示的结构域为抗CD3抗体H链可变区、以涂全黑表示的结构域为抗CD3抗体L链可变区、以涂全白表示的结构域为抗体恒定区、十字表示沉默Fe突变、星号表示使异种Fe缔合化的突变。
[0131]图17显示A:GPC3BiTE的模式图、B:GPC3ERY10的模式图、C:GPC3ERY2的模式图、D:GPC3ERY5 的模式图、E:GPC3ERY6 的模式图、F:GPC3ERY7 的模式图、G:GPC3ERY8_2的模式图、H:GPC3ERY9-1的模式图、I:GPC3ERY10-1的模式图、J:GPC3ERY15的模式图、K:GPC3ERY18的模式图、L:GPC3ERY19_3的模式图。
[0132]图18显示构成IgGl、IgG2、IgG3和IgG4的Fe区的氨基酸残基与kabat的EU编号(在本说明书中又称EU INDEX)之间的关系。
[0133]图19为构成本申请说明书的实施例中记载的多肽缔合体即GPC3ERY17-2、GPC3ERY17-3、EpCAM ERY17-2、和EpCAM ERY17-3的各结构域的标识；以交叉线表示的结构域为抗癌抗原(GPC3、EpCAM、EGFR)抗体H链可变区、以斜线表示的结构域为抗癌抗原(GPC3、EpCAM、EGFR)抗体L链可变区、以点线表示的结构域为抗⑶3抗体H链可变区、以涂全黑表示的结构域为抗CD3抗体L链可变区、以涂全白表示的结构域为抗体恒定区、十字表示沉默Fe突变、星号表示使异种Fe缔合化的突变。
[0134]图 20 为显示 GPC3BiTE、GPC3ERY17-2、GPC3ERY17-3、GPC3ERY10-1 的细胞毒活性的比较的图表。黑正方形( 表示GPC3BiTE、黑三角形(▲)表示GPC3ERY17-2、白圆形(O )表示GPC3ERY17-3、白正方形(口 )表示GPC3ERY10-1的细胞毒活性。
[0135]图21为显示PC-10T细胞移入模型中的GPC3ERY17-2的体内抗肿瘤效果的图表。白正方形(□)表示GPC3ERY17-2给予组的肿瘤体积的变化。黑菱形(?)表示对照组(给予PBS)的肿瘤体积的变化。
[0136]图22为显示GPC3ERY17-2、GPC3ERY17-2-M20的细胞毒活性的比较的图表。黑三角形(▲)表示GPC3ERY17-2、白圆形(〇)表示GPC3ERY17-2-M20的细胞毒活性。
[0137]图23为显示EpCAM ERY17-2, EpCAM ERY17-3的细胞毒活性的比较的图表。黑三角形(▲)表示EpCAM ERY17-2、白正方形(口 )表示EpCAM ERY17-3的细胞毒活性。
[0138]图24为构成本申请说明书的实施例中记载的多肽缔合体即GMl或GM2、和GMO的各结构域的标识。将导入了 CH1/CL界面缔合控制、且导入了 Knob into Hole(KiH)的修饰的多肽缔合体表示为Ajf CH1/CL界面缔合控制和KiH均未导入的多肽缔合体表示为B ；以交叉线表示的结构域为抗癌抗原(GPC3，EpCAM)抗体H链可变区、以斜线表示的结构域为抗癌抗原(GPC3，EpCAM)抗体L链可变区、以点线表示的结构域为抗CD3抗体H链可变区、以涂全黑表示的结构域为抗CD3抗体L链可变区、以涂全白表示的结构域为抗体恒定区、十字表示沉默Fe突变、星号表示使异种Fe缔合化的突变、空心圆表示导入了 CH1/CL界面缔合控制的突变。
[0139]图25为显示GM1、GM2、GMO的细胞毒活性的比较的图表。黑三角形(▲)表示GMl、白正方形(口)表示GM2、白圆形(〇)表示GMO的细胞毒活性。
[0140]图26为显示EGFR ERY17-2的细胞毒活性的图表。黑三角形(▲)表示EGFRERY17-2的细胞毒活性。
【具体实施方式】
[0141]以下的定义为了便于理解本说明书中说明的本发明而提供。
[0142]技述
[0143]在本说明书中，抗体是指天然的、或者通过部分或完全合成而制备的免疫球蛋白。抗体可从天然存在该抗体的血浆或血清等的天然资源、或者产生抗体的杂交瘤细胞的培养上清中分离，或者可通过使用基因重组等的方法部分或完全地合成。作为抗体的例子，适合举出:免疫球蛋白的同种型和这些同种型的亚类。已知人免疫球蛋白有IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl、IgA2、IgD、IgE、IgM这9种类别(同种型)。本发明的抗体中，可包含这些同种型中的 IgGl、IgG2、IgG3、IgG4。
[0144]制作具有所需结合活性的抗体的方法是本领域是公知的。下面，例示与属于GPI锚定型受体家族的、GPC3(Im J Cancer.(2003) 103 (4)，455-65)结合的抗体(抗GPC3抗体)的制作方法。与GPC3以外的抗原结合的抗体也可以根据下述例示来适当制作。[0145]抗GPC3抗体可以使用公知的方法以多克隆或单克隆抗体的形式获得。作为抗GPC3抗体，可以适合制作哺乳动物由来的单克隆抗体。哺乳动物由来的单克隆抗体包含由杂交瘤产生的抗体和由宿主细胞所产生的抗体等，所述宿主细胞为通过基因工程学的方法用含有抗体基因的表达载体转化而成的细胞。
[0146]产生单克隆抗体的杂交瘤，可以通过使用公知技术，例如以如下方式来制作。即，使用GPC3蛋白质作为致敏性抗原，按照常规的免疫方法对哺乳动物进行免疫。利用常规的细胞融合法使获得的免疫细胞与公知的亲本细胞相融合。其次，利用常规的筛选法，通过筛选产生单克隆抗体的细胞，可以选择产生抗GPC3抗体的杂交瘤。
[0147]具体而言，单克隆抗体的制作例如以如下方式来进行。首先，通过表达在RefSeq检索号NM_001164617.1(SEQ ID NO:1)中公开了其核苷酸序列的GPC3基因，可以获得用作抗体获得的致敏性抗原的RefSeq检索号NP_001158089.1(SEQ ID NO:2)所表示的GPC3蛋白质。即，通过将编码GPC3的基因序列插入到公知的表达载体中，适当的宿主细胞得以转化。用公知的方法从该宿主细胞中或培养上清中纯化所需的人GPC3蛋白质。为了从培养上清中获得可溶型的GPC3，例如，代替SEQ ID NO:2所表达的GPC3蛋白质，使从SEQ IDNO:2所表示的GPC3多肽序列中缺失了构成相当于为了使GPC3锚定于细胞膜上所使用的GPI锚定序列的疏水区的564-580氨基酸的蛋白质表达。另外，经纯化的天然的GPC3蛋白质也同样可以用作致敏性抗原。
[0148]作为用于免疫哺乳动物的致敏性抗原可以使用该纯化GPC3蛋白质。GPC3的部分肽也可以用作致敏性抗原。此时，该部分肽也可以通过由人GPC3的氨基酸序列化学合成来获得。另外，也可以通过将部分GPC3基因插入到表达载体中使其表达来获得。并且可以通过使用蛋白质分解酶来分解GPC3蛋白质来获得，但作为部分肽使用的GPC3肽的区和大小不特定限定为特别的方案。优选的区可以从在SEQ ID NO:2的氨基酸序列中相当于564-580氨基酸的氨基酸序列中选择任意的序列。构成作为致敏性抗原的肽的氨基酸数目优选为至少5以上、例如6以上、或者7以上。更具体而言，可以使用8?50、优选10?30残基的肽作为致敏性抗原。
`[0149]另外，可以将GPC3蛋白质的所需的部分多肽或肽与不同的多肽融合而成的融合蛋白质作为致敏性抗原来利用。为了制备用作致敏性抗原的融合蛋白质，例如可以适当利用抗体的Fe片段或肽标签等。表达融合蛋白质的载体可以通过使编码所需的两种或其以上的多肽片段的基因在符合读框内进行融合，该融合基因如上述插入到表达载体中来制作。融合蛋白质的制作方法记载于Molecular Cloning2nd ed.(Sambrook, J et al.,Molecular Cloning2nd ed., 9.47-9.58 (1989) Cold Spring Harbor Lab.press)中。用作致敏性抗原的GPC3的获得方法和使用GPC3的免疫方法也具体地记载于W02003/000883、W02004/022754, W02006/006693 等中。
[0150]作为用该致敏性抗原免疫的哺乳动物，不限于特定的动物，但优选考虑与用于细胞融合的亲本细胞的适合性来进行选择。一般来说适合使用啮齿类的动物，例如小鼠、大鼠、仓鼠、或者兔、猴等。
[0151]按照公知的方法利用致敏性抗原对上述的动物进行免疫。例如，作为一般的方法，通过向哺乳动物的腹腔内或皮下注射给予致敏性抗原来实施免疫。具体而言，使用PBS(Phosphate-Buffered Saline)或生理盐水等以适当的稀释倍率稀释的致敏性抗原根据需要与常规的佐剂、例如弗氏完全佐剂进行混合、乳化后，将该致敏性抗原每隔4?21天数次给予哺乳动物。另外，在致敏性抗原的免疫时可以使用适当的载体。特别是在使用分子量较小的部分肽作为致敏性抗原的情况下，将与白蛋白、钥孔虫戚血兰素等的载体蛋白质结合而成的该致敏性抗原肽用于免疫有时也为理想的情况。
[0152]另外，产生所需抗体的杂交瘤也可以使用DNA免疫以如下方式来制作。DNA免疫是指，在给予了以在免疫动物中使编码抗原蛋白质的基因能够表达的方式构建的载体DNA的该免疫动物中，通过使致敏性抗原在该免疫动物的活体内表达，而赋予免疫刺激的免疫方法。与对免疫动物给予蛋白质抗原的一般免疫方法相比较，DNA免疫期待以下的优越性:
[0153]-维持GPC3这样的膜蛋白质的结构而能够赋予免疫刺激；
[0154]-无需纯化免疫抗原。
[0155]为了通过DNA免疫获得本发明的单克隆抗体，首先，对免疫动物给予表达GPC3蛋白质的DNA。编码GPC3的DNA可以通过PCR等公知的方法来合成。所得DNA被插入到适当的表达载体中，对免疫动物进行给予。作为表达载体，可以适合利用例如PCDNA3.1等市售的表达载体。作为将载体给予活体内的方法，可以利用通常使用的方法。例如，通过将吸附有表达载体的金颗粒用基因枪导入到免疫动物个体的细胞内来进行DNA免疫。并且，识别GPC3的抗体的制作也可以使用国际公开W02003/104453所记载的方法来制作。
[0156]如此对哺乳动物进行免疫，确认到在血清中与GPC3结合的抗体效价提高后，从哺乳动物采取免疫细胞，供给于细胞融合。作为优选的免疫细胞，特别是可以使用脾细胞。
[0157]作为与上述免疫细胞相融合的细胞，可以使用哺乳动物的骨髓瘤细胞。骨髓瘤细胞优选具备用于筛选的适当的选择标记。选择标记是指在特定的培养条件下能够(或者不能够)存活的特性。公知的选择标记有:缺乏次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶(以下省略为缺乏HGPRT)、或者缺乏胸苷 激酶(以下省略为缺乏TK)等。具有缺乏HGPRT或TK的细胞具有次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸苷敏感性(以下省略为HAT敏感性)。HAT敏感性的细胞虽然在HAT选择培养中不能进行DNA合成而死亡，但如果与正常的细胞相融合，则利用正常细胞的补救途径可以持续DNA的合成，因此在HAT选择培养中也可以增殖。
[0158]缺乏HGPRT或缺乏TK的细胞分别可以在含有6_硫鸟嘌呤、8_氮鸟嘌呤(以下省略为8AG)、或者5'-溴脱氧尿苷的培地中选择。将这些嘧啶类似物摄入到DNA中的正常细胞将死亡。同时，不摄入这些嘧啶类似物的、缺乏这些酶的细胞可以在选择培养中存活。此外被称为G418抗性的选择标记通过新霉素抗性基因赋予对2-脱氧链霉胺类抗生素(庆大霉素类似物)的抗性。适合于细胞融合的各种骨髓瘤细胞是公知的。
[0159]作为这样的骨髓瘤细胞，可以适合使用例如:P3 (P3x63Ag8.653) (J.1mmunol.(1979) 123 (4),1548-1550)> P3x63Ag8U.1 (Current Topics in Microbiologyand Immunology(1978)81, 1-7)、NS-1 (C.Eur.J.1mmunol.(1976) 6 (7)，511-519)、MPC-1l (Cell (1976)8 (3)，405-415)、SP2/0(Nature(1978)276(5685)，269-270)、FO (J.1mmunol.Methods(1980) 35(1-2)，1-21)、S194/5.XX0.BU.1(J.Exp.Med.(1978) 148(I)，313-323)、R210 (Nature (1979) 277 (5692)，131-133)等。
[0160]基本上是按照公知的方法、例如Kohler和Milstein等人的方法(MethodsEnzymol.(1981)73,3-46)等，来进行上述免疫细胞与骨髓瘤细胞的细胞融合。
[0161]更具体而言，例如可以在细胞融合促进剂的存在下，在常规的营养培养液中实施上述细胞融合。使用例如聚乙二醇(PEG)、仙台病毒(HVJ)等作为融合促进剂，为了进一步提高融合效率，根据需要可以添加使用二甲亚砜等的辅助剂。
[0162]免疫细胞与骨髓瘤细胞的使用比例可以任意设定。例如，相对于骨髓瘤细胞优选使用I?10倍的免疫细胞。作为用于上述细胞融合的培养液，可以使用例如适合于上述骨髓瘤细胞株增殖的RPMI1640培养液、MEM培养液、以及该种的细胞培养中使用的常规的培养液，并且可以适合添加胎牛血清(FCS)等的血清补液。
[0163]就细胞融合而言，可以将上述免疫细胞与骨髓瘤细胞的规定量在上述培养液中充分混合，再以通常30?60% (w/v)的浓度添加预先加热到37°C左右的PEG溶液(例如平均分子量1000?6000左右)。通过对混合液进行缓慢混合可以形成所需的融合细胞(杂交瘤)。接着，逐渐添加上述例举的适当培养液，通过重复离心、除去上清的操作，可以除去不利于杂交瘤生长的细胞融合剂等。
[0164]如此获得的杂交瘤可以用常规的选择培养液、例如HAT培养液(含有次黄嘌呤、氨基喋呤和胸苷的培养液)进行培养来选择。使用上述HAT培养液的培养持续到所需杂交瘤以外的细胞(非融合细胞)死亡的足够时间(通常，所述足够的时间为数天至数周)。接着，可以利用常规的有限稀释法实施产生所需抗体的杂交瘤的筛选和单一克隆。
[0165]如此获得的杂交瘤可以通过利用基于在细胞融合中使用的骨髓瘤所具有的选择标记的选择培养液来进行选择。例如具有缺乏HGPRT或TK的细胞，可以通过用HAT培养液(含有次黄嘌呤、氨基喋呤和胸苷的培养液)进行培养来选择。即，在将HAT敏感性的骨髓瘤细胞用于细胞融合的情况下，在HAT培养液中，与正常细胞成功进行细胞融合的细胞可以选择性地增殖。使用上述HAT培养液的培养持续到使所需杂交瘤以外的细胞(非融合细胞)死亡的足够时间。具体而言，通常可以通过数天至数周的培养，选择所需的杂交瘤。接着，可以利用常规的有限稀释法实施产生所需抗体的杂交瘤的筛选和单一克隆。
[0166]所需抗体的筛选和单一克隆，可以通过基于公知的抗原抗体反应的筛选方法来适当地实施。例如，结合于GPC3的单克隆抗体，可以结合于在细胞表面表达的GPC3。这样的单克隆抗体，例如可以通过FACS (fluorescence activated cell sorting)进行筛选。FACS是指通过用激光分析与荧光抗体接触的细胞，测定各细胞所发出的荧光进而使结合于细胞表面的抗体的测定成为可能的系统。
[0167]为了通过FACS对产生本发明的单克隆抗体的杂交瘤进行筛选，首先制备表达GPC3的细胞。用于筛选的优选细胞为强制表达GPC3的哺乳动物细胞。通过将作为宿主细胞使用的未转化的哺乳动物细胞用作对照，可以选择性地检测对抗细胞表面的GPC3的抗体的结合活性。即，通过选择不结合于宿主细胞、结合于强制表达GPC3的细胞的产生抗体的杂交瘤，可以获得产生GPC3单克隆抗体的杂交瘤。
[0168]或者，抗体对于固定的表达GPC3的细胞的结合活性可以基于ELISA的原理进行评价。例如，使表达GPC3的细胞固定在ELISA板的孔内。通过使杂交瘤的培养上清与孔内的固定的细胞相接触，来检测结合于固定细胞上的抗体。当单克隆抗体为小鼠由来的情况下，结合于细胞上的抗体可以通过抗小鼠免疫球蛋白抗体来检测。通过上述筛选而选择的、具有抗原结合能的、产生所需抗体的杂交瘤，可以通过有限稀释法等进行克隆。
[0169]如此制作的产生单克隆抗体的杂交瘤可以在常规的培养液中继代培养。另外，该杂交瘤可以在液态氮中长期保存。[0170]将该杂交瘤按照常规的方法进行培养，可以从其培养上清中获得所需的单克隆抗体。或者将杂交瘤给予与其具有适应性的哺乳动物并进行增殖，可以从其腹水中获得单克隆抗体。前者的方法适合于获得高纯度的抗体。
[0171]由从该杂交瘤等的抗体产生细胞克隆的抗体基因所编码的抗体也可以被适合地利用。通过将克隆的抗体基因插入到适当的载体并导入到宿主中，由该基因所编码的抗体得以表达。用于抗体基因的分离、向载体的导入、以及宿主细胞的转化的方法，例如通过Vandamme 等人已经确立(Eur.J.Biochem.(1990) 192 (3), 767-775)。如下所述,重组抗体的制备方法也是公知的。
[0172]例如，可以从产生抗GPC3抗体的杂交瘤细胞中获得编码抗GPC3抗体的可变区(V区)的cDNA。为此,通常先从杂交瘤中提取总RNA。作为用于从细胞提取mRNA的方法,可以利用例如以下所述的方法:_胍超速离心法(Biochemistry (1979) 18 (24) ,5294-5299)；
[0173]-AGPC 法(Anal.Biochem.(1987) 162 (I)，156-159)。
[0174]所提取的mRNA 可以使用 mRNA Purification Kit (提纯试剂盒)(GE HealthcareBioscience 制)等来进行纯化。或者，如 QuickPrep mRNA Purification Kit (GEHealthcare Bioscience制)等这样的用于从细胞直接提取总mRNA的试剂盒也得以市售。可以使用这样的试剂盒从杂交瘤中获得mRNA。可以使用逆转录酶由所得的mRNA合成编码抗体 V 区的 cDNA。cDNA 可以通过 AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNASynthesis Kit (生化学工业社制)等来合成。另外，为了合成和扩增cDNA,可以适当利用SMART RACE cDNA 扩增试剂盒(Clontech 制)和基于 PCR 的 5' -RACE 法(Proc.Natl.Acad.Sc1.USA (1988) 85 (23) ,8998-9002、Nucleic Acids Res.(1989) 17 (8)，2919-2932)。并且，在这样的cDNA的合成的过程中，可以在cDNA的两末端导入后述的适当的限制酶位点。
[0175]由所得PCR产物纯化作为目标的cDNA片段，接着使其与载体DNA相连接。如此操作重组载体得以制作，将其导入到大肠杆菌等中，选择菌落后，可以由形成该菌落的大肠杆菌制备所需的重组载体。而且 ，关于该重组载体是否具有作为目标的cDNA的核苷酸序列，可以利用公知的方法、例如双脱氧核苷酸链终止法等来确认。
[0176]为了获得编码可变区的基因，利用使用了可变区基因扩增用引物的5' -RACE法是简便的。首先以由杂交瘤细胞提取的RNA为模板合成cDNA，获得5' -RACE cDNA文库。
-RACE cDNA文库的合成中可以适当使用SMART RACE cDNA扩增试剂盒等市售的试剂盒。
[0177]以所得5' -RACE cDNA文库为模板，通过PCR法扩增抗体基因。基于公知的抗体基因序列可以设计小鼠抗体基因扩增用引物。这些引物是依赖于免疫球蛋白的亚类而不同的核苷酸序列。因此，预先使用Iso Strip小鼠单克隆抗体同种型试剂盒(RocheDiagnostics)等的市售试剂盒来决定亚类是理想的。
[0178]具体而言，例如当以获得编码小鼠IgG的基因为目的时，可以利用能够扩增编码作为重链的Y 1、Y 2a、Y 2b、Y 3、作为轻链的K链和λ链的基因的引物。为了扩增IgG的可变区基因，通常对于3'侧的引物可以利用在相当于与可变区相近的恒定区的部分退火的引物。另一方面，对于5'侧的引物则可以利用附属于5' RACE cDNA文库制作试剂盒的引物。
[0179]利用如此扩增的PCR产物，可以重构由重链和轻链的组合而组成的免疫球蛋白。以重构的免疫球蛋白的GPC3结合活性为指标，可以筛选所需的抗体。例如以获得对抗GPC3的抗体为目的时，进一步优选抗体与GPC3的结合为特异性的。与GPC3结合的抗体例如可以通过以下方式进行筛选:
[0180](I)将含有由杂交瘤获得的cDNA所编码的V区的抗体与表达GPC3的细胞相接触的步骤；
[0181](2)检测表达GPC3的细胞与抗体结合的步骤；和
[0182](3)选择与表达GPC3的细胞结合的抗体的步骤。
[0183]检测抗体与表达GPC3的细胞结合的方法是公知的。具体而言，可以通过前面所述的FACS等方法检测到抗体与表达GPC3的细胞的结合。为了评价抗体的结合活性可以适当利用表达GPC3的细胞的固定标本。
[0184]作为以结合活性为指标的抗体的筛选方法，也适合使用利用噬菌体载体的淘选方法。由多克隆的抗体表达细胞群将抗体基因以重链和轻链的亚类的文库形式获得的情况下，利用噬菌体载体的筛选方法是有利的。编码重链和轻链的可变区的基因可以通过用适当的接头序列进行连接来形成单链Fv (scFv)。通过将编码scFv的基因插入到噬菌体载体可以获得scFv表达于表面的噬菌体。该噬菌体与所需的抗原接触后，通过回收与抗原结合的噬菌体，可以回收编码具有目标结合活性的scFv的DNA。通过根据需要重复该操作，可以浓缩具有所需结合活性的scFv。
[0185]获得编码目标抗GPC3抗体的V区的cDNA后，通过识别插入到该cDNA两末端的限制酶位点的限制酶，来消化该cDNA。优选的限制酶识别并消化出现在构成抗体基因的核苷酸序列的频率低的核苷酸序列。并且为了将单拷贝的消化片段以正确的方向插入到载体中，优选插入赋予粘性末端的限制酶。通过将如此消化的编码抗GPC3抗体的V区的cDNA插入到适当的表达载体中，可以获得抗体表达载体。此时，若编码抗体恒定区(C区)的基因与上述编码V区的基因符合读框的`融合，则获得嵌合抗体。在此，嵌合抗体是指恒定区和可变区的由来不同。因此，除了小鼠-人等的异种嵌合抗体之外，人-人同种嵌合抗体也包含在本发明的嵌合抗体中。通过向预先具有恒定区的表达载体中插入上述V区基因，可以构建嵌合抗体表达载体。具体而言，例如，可以向持有编码所需抗体恒定区(C区)的DNA的表达载体的5'侧适当配置消化上述V区基因的限制酶的限制酶识别序列。通过使利用相同组合的限制酶消化的两者符合读框的融合来构建嵌合抗体表达载体。
[0186]为了制备抗GPC3单克隆抗体，抗体基因被插入到表达载体中使其在表达控制区的控制下表达。用于表达抗体的表达控制区包含例如增强子和启动子。另外，为了使表达的抗体分泌到细胞外，可以在氨基末端附加适当的信号序列。在后面记载的实施例中，作为信号序列使用了具有氨基酸序列MGWSCIILFLVATATGVHS(SEQ ID NO:72)的肽，此外也附加了适合的信号序列。所表达的多肽在上述序列的羧基末端部分被切割、被切割的多肽可以作为成熟多肽分泌到细胞外。接着，通过用该表达载体来转化适当的宿主细胞，可以获得表达编码抗GPC3抗体的DNA的重组细胞。
[0187]为了表达抗体基因，编码抗体重链(H链)和轻链(L链)的DNA分别被插入到不同的表达载体中。通过用插入有H链和L链的载体共转化(co-transfect)相同的宿主细胞，可以表达具备H链和L链的抗体分子。或者通过使编码H链和L链的DNA插入到单一的表达载体中，可以转化宿主细胞(参照国际公开W094/11523)。
[0188]通过将所分离的抗体基因导入到适当的宿主用来制备抗体的宿主细胞与表达载体的多数组合是公知的。这些表达系均可以应用于本发明的抗原结合结构域和CD3结合结构域的分离。在真核细胞用作宿主细胞的情况下，可以适当使用动物细胞、植物细胞、或者真菌细胞。具体而言，作为动物细胞，可以例示以下细胞:
[0189](I)哺乳类细胞:CH0、C0S、骨髓瘤、BHK (幼仓鼠肾，baby hamster kidney)、Hela、Vero 等；
[0190](2)两栖类细胞:非洲爪蟾卵母细胞等；
[0191](3)昆虫细胞:sf9、sf21、Tn5 等。
[0192]或者，作为植物细胞，烟草(Nicotiana tabacum)等的烟草(Nicotiana)属由来的细胞的抗体基因的表达系是公知的。对于植物细胞的转化，可以适当利用愈伤组织培养的细胞。
[0193]并且，作为真菌细胞，可以利用以下的细胞:
[0194]-酵母:酿酒酵母(Saccharomycesserevisiae)等的酵母(Saccharomyces)属、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)等的毕赤酵母属；
[0195]一丝状菌:黑曲霉(Aspergillus niger)等的曲霉(Aspergillus)属。
[0196]另外，利用原核细胞的抗体基因的表达系也是公知的。例如，使用细菌细胞的情况下，可以适当利用大肠杆菌(E.coli)、枯草杆菌等的细菌细胞。通过转化向这些细胞中导入包含目标抗体基因的表达载体。通过将所转化的细胞在体外进行培养，可以从该转化细胞的培养物中获得所需的抗体。
[0197]对于重组抗体的产生，除了上述宿主细胞之外，也可以利用转基因动物。S卩，从导入了编码所需抗体的基因的动物可以获得该抗体。例如，抗体基因可以通过符合读框的插入到编码乳汁中固有产生的蛋白 质的基因的内部来构建融合基因。作为分泌到乳汁中的蛋白质，可以利用例如山羊β酪蛋白等。含有插入了抗体基因的融合基因的DNA片段被注入到山羊的胚胎中，该经注入的胚胎被导入到雌性山羊体内。由接受了胚胎的山羊生出转基因山羊，从该转基因山羊(或其后代)产生的乳汁中可以作为与乳汁蛋白质的融合蛋白质获得所需抗体。另外，为了使转基因山羊产生的含有所需抗体的乳汁量增加，可以对转基因山羊给予激素(Bio/Technology (1994)，12 (7)，699-702)。
[0198]使本说明书中记载的多肽缔合体给予人的情况下，作为该缔合体中的抗原结合结构域，可以适当地采用以降低对人的异种抗原性等为目的而进行了人工修饰的基因重组型抗体由来的抗原结合结构域。基因重组型抗体包含例如人源化(Humanized)抗体等。这些修饰抗体可以使用公知的方法来适当地制备。
[0199]为了制作本说明书中记载的多肽缔合体中的抗原结合结构域而使用的抗体的可变区通常由夹在4个构架区(FR)的3个互补性决定区(complementarity-determiningregion ;⑶R)构成。⑶R实质上是决定抗体的结合特异性的区。⑶R的氨基酸序列富有多样性。另一方面，构成FR的氨基酸序列，即使在具有不同的结合特异性的抗体之间，也大多显示出高的同一性。因此，通常认为通过移植CDR可以将某抗体的结合特异性移植到其他抗体。
[0200]人源化抗体也被称为重构(reshaped)人抗体。具体而言，将人以外的动物、例如小鼠抗体的CDR移植到人抗体的人源化抗体等是公知的。也已知为了获得人源化抗体的常规的基因重组方法。具体而言，作为将小鼠的抗体的CDR移植到人的FR的方法，例如重叠序列延伸PCR(Overlap Extension PCR)是公知的。在重叠序列延伸PCR中，在用于合成人抗体的FR的引物上附加想要移植的编码小鼠抗体的CDR的核苷酸序列。对于4个FR分别准备引物。通常认为当将小鼠CDR移植到人FR中时，选择与小鼠的FR同一性高的人FR对于维持CDR的功能是有利的。即，通常优选利用由与相邻于想要移植的小鼠CDR的FR的氨基酸序列同一性高的氨基酸序列组成的人FR。
[0201]另外，要连接的核苷酸序列设计成相互符合读框的相接连。利用各自的引物合成各自的人FR。其结果，获得在各FR上附加了编码小鼠CDR的DNA的产物。各产物的编码小鼠CDR的核苷酸序列设计成相互重叠。接着，使以人抗体基因为模板合成的产物的重叠的⑶R部分相互退火来进行互补链合成反应。通过该反应人FR经由小鼠⑶R的序列得以连接。
[0202]最终，3个⑶R和4个FR连接而成的V区基因利用在其Y末端和Y末端退火、附加了适当的限制酶识别序列的引物扩增其全长。通过将如上获得的DNA与编码人抗体C区的DNA以符合读框的融合形式插入到表达载体中，可以制备人源化抗体表达用载体。通过将该重组载体导入到宿主来确立重组细胞后，培养该重组细胞，使编码该人源化抗体的DNA表达，由此使该人源化抗体在 该培养细胞的培养物中产生(参照欧州专利公开EP239400、国际公开 W01996/002576)。
[0203]通过对如上制作的人源化抗体的抗原结合活性进行定性或定量地测定和评价，可以适合选择经由CDR连接时使该CDR形成良好的抗原结合部位的人抗体的FR。根据需要，也可以取代FR的氨基酸残基使重构人抗体的⑶R形成适当的抗原结合部位。例如，应用小鼠CDR移植到人FR所使用的PCR法，可以将氨基酸序列的突变导入到FR中。具体而言，可以将部分核苷酸序列的突变导入到FR退火的引物中。核苷酸序列的突变被导入到利用这样的引物合成的FR中。通过将取代了氨基酸的突变型抗体的抗原结合活性利用上述的方法进行测定和评价，可以选择具有所需性质的突变FR序列(Sato, K.et al., Cancer Res,1993，53，851-856)。
[0204]另外，将具有人抗体基因的所有组成成分(repertorie)的转基因动物(参照国际公开 W01993/012227、W01992/003918、W01994/002602、W01994/025585、W01996/034096、W01996/033735)作为免疫动物，通过DNA免疫可以获得所需的人抗体。
[0205]并且，使用人抗体文库，通过淘选获得人抗体的技术也被认知。例如，人抗体的V区作为单链抗体(scFv)通过噬菌体展示法表达在噬菌体的表面。可以选择与抗原结合的表达scFv的噬菌体。通过分析所选择的噬菌体的基因，可以决定编码与抗原结合的人抗体的V区的DNA序列。决定与抗原结合的scFv的DNA序列后，通过使该V区序列与所需人抗体C区的序列符合读框的融合后插入到适当的表达载体中，可以制作表达载体。将该表达载体导入到上述举出的适合的表达细胞中，通过使编码该人抗体的基因表达来获得该人抗体。这些方法是已经公知的(参照国际公开W01992/001047、W01992/020791、W01993/006213、W01993/011236、TO1993/019172、TO1995/001438、W01995/015388)。
[0206]抗原结合结构域
[0207]在本说明书中，“抗原结合结构域”是指含有与部分或全部抗原特异性地结合且互补的区而成的部分抗体。当抗原的分子量较大时，抗体仅可以与抗原的特定部分结合。该特定部分被称为表位。抗原结合结构域可以由一个或多个抗体的可变结构域提供。优选抗原结合结构域包含抗体轻链可变区(VL)和抗体重链可变区(VH)。作为这样的抗原结合结构域的例子，可以适合举出:“scFv (single chain Fv) ”、“单链抗体(single chainantibody) ”、“Fv”、“scFv2 (single chain Fv2)，，、“Fab” 或 “F (ab' )2”等。
[0208]本发明的多肽缔合体中的抗原结合结构域可以结合在相同的表位上。在此，相同的表位可以存在于由SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4记载的氨基酸序列组成的蛋白质中。或者，本发明的多肽缔合体中的抗原结合结构域可以结合在相互不同的表位上。在此，不同的表位可以存在于由SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4记载的氨基酸序列组成的蛋白质中。
[0209]特异件
[0210]特异性是指，特异性结合的分子的一个分子对于其中一个或多个的相结合的伙伴方的分子以外的分子不显示任何有意结合的状态。另外，抗原结合结构域也用于在某抗原中含有的多个表位中对于特定的表位具有特异性的情况。另外，当抗原结合结构域所结合的表位包含在多个不同抗原中的情况下，具有该抗原结合结构域的多肽缔合体可以与含有该表位的各种抗原相结合。
[0211]技原
[0212]本说明书中对于抗原没有特别的限定，除了 CD3还可以为任何抗原。作为抗原的例子，适合举出例如:受体、癌抗原、MHC抗原、分化抗原等。作为受体的例子，可以举出例如:造血因子受体家族、细胞因子受体家族、酪氨酸激酶型受体家族、丝氨酸/苏氨酸激酶型受体家族、TNF受体家族、G蛋白质共轭型受体家族、GPI锚定型受体家族、酪氨酸磷酸酶型受体家族、粘附因子家族、激素受体家族等的属于受体家族的受体等。关于属于这些受体家族的受体及其特征，记载于多数的文献中，例如:Cooke BA., King RJB., vander Molen HJ.ed.New Comprehesive Biochemistry Vol.18B " Hormones and theirActions Part II" PP.1-46 (1988) Elsevier Science Publishers BV.;或者，宫坂昌之监修，细胞工程学增刊手册系列“ 接着因子〃 > K 7' 々(粘附因子手册)”(1994)(秀润社，东京，日本)等的点评；以及Patthy (Cell (1990)61 (I)，13-14)、Ullrich等人(Cell(1990)61(2)，203-212) ;Massague(e 上附有重音符)(Cell (1992)69 (6)，1067-1070) ；Miyajima 等人(Annu.Rev.1mmunol.(1992) 10,295-331) ；Taga 等人(FASEBJ.(1992)6,3387-3396) ；FantI 等人(Annu.Rev.Biochem.(1993)，62，453-481) ；Smith 等人(Cell (1994)76(6)959-962) ；Flower DR.Biochim.Biophys.Acta, Flower(Biochim.Biophys.Acta (1999) 1422 (3) 207-234 等。
[0213]作为属于上述受体家族的具体的受体，适合例示例如:人或小鼠红细胞生成素(EPO)受体(Blood (1990) 76(1)，31-35、Cell(1989) 57 (2)，277-285)、人或小鼠粒细胞集落刺激因子(G-CSF)受体(Proc.Natl.Acad.Sc1.USA.(1990) 87 (22)，8702-8706、mG-CSFR、Cell (1990) 61 (2)，341-350)、人或小鼠促血小板生成素(TPO)受体(Proc NatlAcad Sci USA.(1992) 89 (12)，5640-5644、EMBO J.(1993) 12 (7)，2645-53)、人或小鼠胰岛素受体(Nature (1985) 313 (6005)，756-761)、人或小鼠 Flt-3 配体受体(Proe.Natl.Acad.Sc1.USA.(1994)91 (2)，459_463)、人或小鼠血小板来源的生长因子(PDGF)受体(Proc.Natl.Acad.Sc1.USA.(1988) 85 (10) 3435-3439)、人或小鼠干扰素(IFN)-α , β 受体(Cell (1990) 60 (2)，225-234.和 Cell (1994) 77 (3)，391-400)、人或小鼠瘦蛋白受体、人或小鼠生长激素(GH)受体、人或小鼠白细胞介素(IL)-1O受体、人或小鼠胰岛素样生长因子(IGF)-1受体、人或小鼠白血病抑制因子(LIF)受体、人或小鼠睫状神经营养因子(CNTF)受体等。
[0214]癌抗原为伴随着细胞的恶性化而表达的抗原，又被称为肿瘤特异性抗原。另外，细胞癌化时，在细胞表面或蛋白质分子上出现的异常的糖链也为癌抗原，也被称为癌糖链抗原。作为癌抗原的例子，适合举出例如:作为上述受体属于GPI锚定型受体家族但在包含肝癌在内的数个癌症中表达的GPC3 (Int J Cancer.(2003) 103 (4)，455-65)、在包含肺癌在内的多个癌症中表达的 EpCAM (Proe Natl Acad Sci USA.(1989) 86 (I)，27-31)(其多核苷酸序列记载于RefSeq检索号NM_002354.2 (SEQ ID NO:3),多肽序列记载于RefSeq检索号NP_002345.2 (SEQ ID NO:4))、EGFR、CA19-9、CA15-3、唾液酸(sialyl) SSEA-1 (SLX)等。
[0215]MHC抗原主要分类为MHC class I抗原和MHC class II抗原，MHC class I抗原包含 HLA-A、-B、-C、-E、-F、-G、-H，MHC class II 抗原包含 HLA-DR、-DQ、-DP。
[0216]分化抗原可以包含CDl、CD2、CD4、CD5、CD6、CD7、CD8、CD10、CDlla、CDllb、CDllc、CD13、CD14、CD15s、CD16、CD18、CD19、CD20、CD21、CD23、CD25、CD28、CD29、CD30、CD32、CD33、CD34、CD35、CD38、CD40、CD41a、CD41b、CD42a、CD42b、CD43、CD44、CD45、CD45R0、CD48、CD49a、CD49b、CD49c、CD49d、CD49e、CD49f、CD51、CD54、CD55、CD56、CD57、CD58、CD61、CD62E、CD62L、CD62P、CD64、CD69、CD71、CD73、CD95、CD102、CD106、CD122、CD126、CDw130 ?
[0217]
[0218]存在于抗原中的抗原决定簇所指的表位，是指在本说明书中公开的多肽缔合体中的抗原结合结构域所结合的抗原上的位点。因此，例如表位可以通过其结构来定义。另外，也可以根据识别该表位的多肽缔合体中的抗原结合活性来定义该表位。当抗原为肽或多肽的情况下，也可以根据构成表位的氨基酸残基来特定表位。另外，当表位为糖链时，也可以根据特定的糖链结构来特定表位。
[0219]线型表位是包含识别 氨基酸一次序列的表位的表位。典型的线型表位在固定序列中含有至少3个、以及最为常见的是至少5个、例如约8?约10个、6?20个的氨基酸。
[0220]与线型表位相对比，立体结构表位是指包含表位的氨基酸的一次序列不是被识别的表位的单一规定成分的表位(例如，氨基酸的一次序列不一定由规定表位的抗体识别的表位)。相对于线型表位，立体结构表位可能包含更多数目的氨基酸。关于立体结构表位的识别，抗体识别肽或蛋白质的三维结构。例如，在蛋白质分子折叠形成三维结构的情况下，形成立体结构表位的某氨基酸和/或多肽主链呈并列状态，使抗体识别表位成为可能。决定表位的立体结构的方法包含例如X射线结晶学、二维核磁共振分光学以及位点特异性的自旋标记和电子顺磁共振分光学，但不限于这些。例如参考Epitope Mapping Protocolsin Methods in Molecular Biology (1996)、第 66 卷、Morris (编)。
[0221]下述例示了通过含有GPC3抗原结合结构域的测试多肽缔合体确认与表位结合的方法，按照下述的例示，也可以适当实施通过含有对于GPC3以外抗原的抗原结合结构域的测试多肽缔合体确认与表位结合的方法。
[0222]例如，含有GPC3抗原结合结构域的测试多肽缔合体识别存在于GPC3分子中的线型表位，这一点例如可以如下进行确认。为了上述目的，由构成GPC3的胞外结构域的氨基酸序列组成的线型肽得以合成。该肽可以化学合成。或者，可以利用编码GPC3的cDNA中的相当于胞外结构域的氨基酸序列的区，通过基因工程学的方法来获得。接着，评价由构成胞外结构域的氨基酸序列组成的线型肽与含有GPC3抗原结合结构域的测试多肽缔合体之间的结合活性。例如，通过以固定的线型肽为抗原的ELISA，可以评价该多肽缔合体与该肽的结合活性。或者，基于该多肽缔合体与表达GPC3的细胞的结合中线型肽的抑制水平，可以明确与线型肽的结合活性。通过这些试验，可以明确该多肽缔合体与线型肽的结合活性。
[0223]另外，含有GPC3抗原结合结构域的测试多肽缔合体识别立体结构表位，这一点可以如以下方式进行确认。为了上述目的，制备表达GPC3的细胞。可以举出:含有GPC3抗原结合结构域的测试多肽缔合体与表达GPC3的细胞接触时，该测试多肽缔合体与该细胞强力结合，而另一方面，该测试多肽缔合体与固定的由构成GPC3的胞外结构域的氨基酸序列组成的线型肽实质上不结合的情况等。在此，实质上不结合是指，相对于表达人GPC3的细胞的结合活性，为80%以下、通常50%以下、优选30%以下、特别优选15%以下的结合活性。
[0224]作为测定含有GPC3抗原结合结构域的测试多肽缔合体与表达GPC3的细胞的结合活性的方法，例如可以举出:Antibodies A Laboratory Manual记载的方法(Ed Har I off,David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory (1988) 359-420) ? 即，可以基于以表达 GPC3的细胞为抗原的ELISA或FACS (fluorescence activated cell sorting)的原理进行评价。
[0225]在ELISA格式中，含有GPC3抗原结合结构域的测试多肽缔合体与表达GPC3的细胞的结合活性，可以通过比较由酶反应生成的信号水平来定量地进行评价。即，在固定有表达GPC3的细胞的ELISA板上加入测试多肽缔合体，与细胞结合的测试多肽缔合体，利用识别测试多肽缔合体的酶标记抗体进行检测。或者，在FACS中，制作测试多肽缔合体的稀释系列，通过决定抗体与表达GPC3的细胞的结合效价(titer)，可以比较测试多肽缔合体与表达GPC3的细胞的结合活性。
[0226]测试多肽缔合体与悬浮于缓冲液等中的在细胞表面上表达的抗原的结合，可以通过流式细胞仪来检测。作为流式细胞仪，已知例如以下的装置:`[0227]FACSCanto? II
[0228]FACSAri a?
[0229]FAC SArray?
[0230]FAC SVantage? SE
[0231]FACSCalibur?(均为 BD Biosciences 社的商品名)
[0232]EPICS ALTRA HyPerSort
[0233]Cytomics FC500
[0234]EPICS XL-MCL ADC EPICS XL ADC
[0235]Cell Lab Quanta/Cell Lab Quanta SC(均为 Beckman Coulter 社的商品名)。
[0236]例如，作为含有GPC3抗原结合结构域的测试多肽缔合体与抗原的结合活性的适合的测定方法的一例，可以举出以下的方法。首先，使用识别与表达GPC3的细胞进行反应的测试多肽缔合体的FITC标记的二次抗体进行染色。通过用适当且适合的缓冲液稀释测试多肽缔合体，将该缔合体制备成所需的浓度而使用。例如，以10 μ g/ml至10ne/ml之间的任意浓度来使用。接着，使用FACSCalibur (BD社)测定荧光强度和细胞数。抗体与该细胞的结合量，反映通过使用CELL` QUEST Software (BD社)进行分析而得到的荧光强度、SPGeometric Mean的值。[!卩，通过得到该Geometric Mean的值,可以测定由测试多肽缔合体的结合量表示的测试多肽缔合体的结合活性。
[0237]含有GPC3抗原结合结构域的测试多肽缔合体，与某种多肽缔合体共有表位，这一点可以通过两者对相同表位的竞争来确认。多肽缔合体之间的竞争由交叉阻断试验(cross-blocking assay)等来检测。例如竞争ELISA法为优选的交叉阻断试验。
[0238]具体而言，在交叉阻断试验中，微量滴定板的孔上包被的GPC3蛋白质在作为候补的竞争多肽缔合体的存在下或非存在下进行预培养后，添加测试多肽缔合体。与孔中的GPC3蛋白质结合的测试多肽缔合体的量、和与相同表位的结合相竞争的作为候补的竞争多肽缔合体的结合能间接性地相关联。即，竞争多肽缔合体与相同表位的亲和性越大，测试多肽缔合体与包被有GPC3蛋白质的孔的结合活性越降低。
[0239]经由GPC3蛋白质与孔结合的测试多肽缔合体的量，通过预先标记多肽缔合体可以容易地测定。例如，生物素标记的多肽缔合体，通过使用抗生物素蛋白过氧化物酶共轭化合物和适当的底物进行测定。利用过氧化物酶等的酶标记的交叉阻断试验特别被称为竞争ELISA法。多肽缔合体可以利用检测或者测定可能的其他标记物质来标记。具体而言，放射标记或者突光标记等是公知的。
[0240]与在候补的竞争多肽缔合体的非存在下实施的对照试验中得到的结合活性相比较，如果竞争多肽缔合体可以将含有GPC3抗原结合结构域的测试多肽缔合体的结合阻断至少20%、优选至少20?50%、进一步优选至少50%，则该测试多肽缔合体为与竞争多肽缔合体实质上结合于相同表位、或为与相同表位的结合相竞争的多肽缔合体。
[0241]在鉴定含有GPC3抗原结合结构域的测试多肽缔合体所结合的表位的结构的情况下，测试多肽缔合体与对照多肽缔合体共有表位，这一点可以通过比较上述两种多肽缔合体对向构成该表位的肽导入有氨基酸突变而成的肽的结合活性来进行评价。
[0242]作为测定这样的结合活性的方法，例如，在上述的ELISA格式中，可以通过比较测试多肽缔合体和对照多肽缔合 体对导入有突变的线型肽的结合活性来测定。作为ELISA以外的方法，对结合于柱上的该突变肽的结合活性，也可以通过定量测试多肽缔合体和对照多肽缔合体流过该柱后在洗脱液中洗脱的多肽缔合体来测定。使突变肽作为例如与GST的融合肽吸附于柱上的方法是公知的。
[0243]另外，在所鉴定的表位是立体表位的情况下，测试多肽缔合体与对照多肽缔合体共有表位，这一点可以通过以下的方法来评价。首先，制备表达GPC3的细胞和在表位导入了突变的表达GPC3的细胞。这些细胞被悬浮于PBS等的适当的缓冲液中，向所得的细胞悬浮液中添加测试多肽缔合体和对照多肽缔合体。接着，向用适当缓冲液洗涤的细胞悬浮液中，添加可以识别测试多肽缔合体和对照多肽缔合体的FITC标记的抗体。用标记抗体染色的细胞的荧光强度和细胞数通过FACSCalibur (BD社)进行测定。测试多肽缔合体和对照多肽缔合体的浓度通过用适合的缓冲液进行适当稀释制备成所需的浓度而使用。例如，以10 μ g/ml至10ng/ml之间的任意浓度来使用。标记抗体与该细胞的结合量，反映通过使用CELL QUEST Software (BD社)进行分析而得到的突光强度、即Geometric Mean的值。SP,通过得到该Geometric Mean的值,可以测定由标记抗体的结合量表示的测试多肽缔合体和对照多肽缔合体的结合活性。
[0244]在本方法中，例如“与表达突变GPC3的细胞实质上不结合”这一点可以通过以下的方法来判断。首先，与表达突变GPC3的细胞结合的测试多肽缔合体和对照多肽缔合体用标记抗体进行染色。接着，检测细胞的荧光强度。在荧光检测中使用FACSCalibur作为流式细胞术的情况下，所得的荧光强度可以使用CELL QUEST Software进行分析。通过从多肽缔合体存在下和非存在下的Geometric Mean的值,基于下述的计算式,算出该比较值(AGeo-Mean)，可以求出由于多肽缔合体的结合而导致的荧光强度的增加比例。
[0245]Δ Geo-Mean = Geo-Mean (多肽缔合体存在下)/Geo-Mean (多肽缔合体非存在下)
[0246]将通过分析得到的反映测试多肽缔合体对表达突变GPC3的细胞的结合量的Geometric Mean比较值(突变GPC3分子Λ Geo-Mean值)，与反映测试多肽缔合体对表达GPC3的细胞的结合量的AGeo-Mean比较值进行比较。在该情况下，在求出对表达突变GPC3的细胞和对表达GPC3的细胞的AGeo-Mean比较值时所使用的测试多肽缔合体的浓度，特别优选制备成彼此相同或实质上相同的浓度。将预先确认了识别GPC3中的表位的多肽缔合体作为对照多肽缔合体得以利用。
[0247]如果测试多肽缔合体对表达突变GPC3的细胞的Λ Geo-Mean比较值较测试多肽缔合体对表达GPC3的细胞的AGeo-Mean比较值的至少80%、优选50%、更优选30%、特别优选15%小，则认为是“与表达突变GPC3的细胞实质上不结合”。求出Geo-Mean值(GeometricMean)的计算式记载于 CELL QUEST Software User' s Guide (BD biosciences 社)中。若通过对比较值进行比较，而其程度为实质上同等，则可以评价为:测试多肽缔合体和对照多肽缔合体的表位是相同的。
[0248]Fv(variable fragment)
[0249]在本说明书中，“Fv (variable fragment) ”这样的用语是指包含一对抗体的轻链可变区(VL(light chain variable region))和抗体的重链可变区(VH(heavy chainvariable region))的抗体由来的抗原结合结构域的最小单位。在1988年Skerra和Pluckthun发现了:通过在细菌的信号序列的下游插入抗体的基因，在大肠杆菌中诱导该基因的表达，可以 在均一且维持活性的状态下由大肠杆菌的周质组分进行制备(Science (1988) 240 (4855)，1038-1041)。由周质组分制备的FV，以与抗原结合的方式缔合7 VH 和 VL0
[0250]在本说明书中，作为Fv，例如为包含以下结构域的多肽缔合体:
[0251](I) 二价的抗原结合结构域，其为二价的scFv，是将二价的scFv中的一价的scFv经由构成⑶3结合结构域的重链Fv片段与构成Fe区的一个多肽相连接，另一个一价的scFv经由构成CD3结合结构域的轻链Fv片段与构成Fe区的另一个多肽相连接而成的二价的抗原结合结构域；
[0252](2)包含Fe区的结构域，其为在IgGl、IgG2a、IgG3或IgG4的构成Fe区的氨基酸中不具有Fe Y受体-结合活性的Fe区；和
[0253](3)至少为一价的⑶3结合结构域，
[0254]在包含上述结构域的多肽缔合体等中，轻链Fv片段和重链FV片段以与抗原⑶3结合的方式缔合而构成CD3结合结构域的一组Fv也适合包含在其中。
[0255]scFv、单链抗.体、或 sc (Fv) 2
[0256]在本说明书中，“ scFv ”、“单链抗体”、或“ sc (Fv) 2 ”这样的用语是指在单一的多肽链内，包含由来于重链和轻链两方的可变区，但缺乏恒定区的抗体片段。通常，单链抗体进一步包含被认为使抗原结合成为可能、使形成所需结构成为可能的、VH结构域和VL结构域之间的多妝接头。单链抗体在 The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, 113 卷,Rosenburg 和 Moore 编，Springer-Verlag, New York, 269 ?315 (1994)中由 Pluckthun 详细地论述。同样地，也可参照国际专利申请公开W01988/001649和美国专利第4，946，778号和同第5，260，203号。在特定的方案中，单链抗体可以为双特异性且/或被人源化。
[0257]scFv是构成Fv的VH和VL由肽接头连接而成的抗原结合结构域(Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.(1988) 85 (16)，5879-5883)。由该肽接头可以维持VH和VL接近的状态。
[0258]sc (Fv) 2为两个VL和两个VH的4个可变区由肽接头等的接头连接而构成一条链的单链抗体(J Immunol.Methods (1999) 231 (1-2)，177-189)。这两个VH和VL也可以由来于不同的单克隆抗体。例如也适合举出:在Journal of Immunology (1994) 152 (11), 5368-5374中所公开的识别存在于相同抗原中的两种的表位的双特异性(bispecific sc (Fv) 2)。sc (Fv) 2可以通过本领域公知的方法来制作。例如，可以通过将scFv用肽接头等的接头连接来制作。
[0259]作为构成本说明书中的sc (Fv) 2的抗原结合结构域的构成，可以举出:两个VH和两个VL以一条链多肽的N末端侧为基点按照VH、VL、VH、VL ([VH]接头[VL]接头[VH]接头[VL])的顺序排列为特征的抗体，但两个VH和两个VL的顺序不特别限于上述的构成，而是以什么样的顺序排列都可以。例如，也可以举出以下这样的顺序的构成。
[0260][VL]接头[VH]接头[VH]接头[VL]；
[0261][VH]接头[VL]接头[VL]接头[VH]；
[0262][VH]接头[VH]接头[VL]接头[VL]；
[0263][VL]接头[VL]接头[VH]接头[VH]；
[0264][VL]接头[VH]接头[VL]接头[VH]。
[0265]关于sc (Fv) 2的分子形态在W02006/132352中也有详细的记载，本领域技术人员根据这些记载，为了制作本说明书中公开的多肽缔合体，可以适当制作所需的sc (Fv)2。
[0266]本发明的多肽缔合体还可以共轭PEG等的载体高分子或抗癌剂等的有机化合物。另外，插入糖链附加序列，能够以糖链获得所需效果为目的适合地附加。
[0267]作为结合抗体的可变区的接头，可以使用通过基因工程学导入的任意的肽接头、或合成化合物接头(参照例如Protein Engineering, 9 (3), 299-305,1996)所公开的接头等，但在本发明中优选肽接头。肽接头的长度没有特别的限定，本领域技术人员可以根据目的适当选择，但优选的长度为5氨基酸以上(对于上限没有特别的限定，通常为30氨基酸以下、优选20氨基酸以下)、特别优选15氨基酸。sc (Fv) 2包含3个肽接头的情况下，可以全部使用相同长度的肽接头，也可以使用不同长度的肽接头。
[0268]例如，肽接头的情况下，可以举出以下序列:
[0269]Ser
[0270]Gly.Ser
[0271]Gly.Gly.Ser
[0272]Ser.Gly.Gly
[0273]Gly.Gly.Gly.Ser (SEQ ID NO:5)
[0274]Ser.Gly.Gly.Gly (SEQ ID NO:6)
[0275]Gly.Gly.Gly.Gly.Ser (SEQ ID NO:7)[0276]Ser.Gly.Gly.Gly.Gly (SEQ ID NO:8)
[0277]Gly.Gly.Gly.Gly.Gly.Ser (SEQ ID NO:9)
[0278]Ser.Gly.Gly.Gly.Gly.Gly (SEQ ID NO:10)
[0279]Gly.Gly.Gly.Gly.Gly.Gly.Ser (SEQ ID NO:11)
[0280]Ser.Gly.Gly.Gly.Gly.Gly.Gly (SEQ ID NO:12)
[0281](Gly.Gly.Gly.Gly.Ser (SEQ ID NO:7) )n
[0282](Ser.Gly.Gly.Gly.Gly (SEQ ID NO:8) )n
[0283][n为I以上的整数]等。但是，肽接头的长度和序列本领域技术人员可以根据目的适当选择。
[0284]合成化学物接头(化学交联剂)是通常用于交联肽的交联剂，例如有:N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、二琥珀酰亚氨基辛二酸酯(DSS)、双(磺基琥珀酰亚氨基)辛二酸酯(BS3)、二硫代双(琥珀酰亚氨基丙酸酯)(DSP)、二硫代双(磺基琥珀酰亚氨基丙酸酯)(DTSSP)、双(琥珀酰亚氨基琥珀酸)乙二醇酯(EGS)、双(磺基琥珀酰亚氨基琥珀酸)乙二醇酯(磺基-EGS)、二琥珀酰亚氨基酒石酸盐(DST)、二磺基琥珀酰亚氨基酒石酸盐(磺基-DST)、双[2-(琥珀酰亚胺氧基羰基氧基)乙基]砜(BS0C0ES)、以及双[2-(磺基琥珀酰亚胺氧基羰基氧基)乙基]砜(磺基-BS0C0ES)等，这些交联剂均有销售。
[0285]连接4个抗体可变区时，通常需要3个接头。多个接头可以使用相同的接头，也可以使用不同的接头。
[0286]Fab、F(ab' ) 2、或 Fab'
[0287]“Fab”由一条轻链、以及一条重链的CHl区和可变区构成。Fab分子的重链不能够与其他重链分子形成二硫键。
[0288]“F(ab' )2”和“Fab' ”是指，通过将免疫球蛋白(单克隆抗体)用作为蛋白质分解酶的胃蛋白酶或者番木瓜蛋白酶等进行处理来制备，在存在于铰链区中的两条H链间的二硫键的前后被消化而生成的抗体片段。例如，可以将IgG用番木瓜蛋白酶处理，在存在于铰链区中的两条H链间的二硫键的上游被切断，制备由VL (L链可变区)和CL (L链恒定区)组成的L链和由VH(H链可变区)和CH Y I (H链恒定区中的Y I区)组成的H链片段在C末端区通过二硫键连接而成的同种的两个抗体片段。这些两个同种的抗体片段分别被称为Fab'。
[0289]“F(ab' ) 2”包含两条轻链和两条重链，所述两条重链包含CHl结构域和部分CH2结构域的恒定区以使链间的二硫键在两条重链间形成。构成本说明书中公开的多肽缔合体的F(ab' ) 2可以适合如下获得:通过将具有所需抗原结合结构域的全长单克隆抗体等用胃蛋白酶等的蛋白质分解酶部分消化后，使Fe片段吸附于蛋白A柱而除去。作为所述的蛋白质分解酶，只要是可以通过适当设定PH等的酶的反应条件来消化全长抗体有选择性地生成F(ab' )2即可，没有特别的限定，例如，可以例示胃蛋白酶或无花果蛋白酶等。
[0290]Fe IX
[0291]构成本说明书公开的多肽缔合体的Fe区可以适合如下获得:通过将单克隆抗体等的抗体用胃蛋白酶等的蛋白质分解酶部分消化后，使片段吸附于蛋白A柱或者蛋白G柱后，用适当的洗脱缓冲液等使其洗脱。作为所述的蛋白质分解酶，只要是可以通过适当设定PH等的酶的反应条件来消化单克隆抗体等的抗体即可，没有特别的限定，例如，可以例示胃蛋白酶或无花果蛋白酶等。
[0292]本说明书所记载的多肽缔合体在IgGl、IgG2、IgG3或IgG4的构成Fe区的氨基酸中含有Fe Y受体-结合活性降低的Fe区。
[0293]抗体的同种型由恒定区的结构决定。IgGl、IgG2、IgG3、IgG4的各同种型的恒定区分别被称为Cy 1、C Y 2、C Y 3、C Y 4。构成人(^1、(^2、(^3、(^4的？0区的多肽的氨基酸序列例示为SEQ ID N0:23、24、25、26。构成各氨基酸序列的氨基酸残基和kabat的EU编号(在本说明书中也被称为EU INDEX)之间的关系显示于图18中。
[0294]Fe区是指包含两条轻链和两条重链的除外F (aY ) 2的区，所述两条重链包含CHl结构域和部分CH2结构域的恒定区以使链间的二硫键在两条重链间形成。构成本说明书中公开的多肽缔合体的Fe区可以适合如下获得:通过将IgGl、IgG2、IgG3、IgG4单克隆抗体等用胃蛋白酶等的蛋白质分解酶部分消化后，将吸附于蛋白A柱上的组分进再洗脱。作为所述的蛋白质分解酶，只要是可以通过适当设定PH等的酶的反应条件来消化全长抗体有选择性地生成F(ab' )2即可，没有特别的限定，例如，可以例示胃蛋白酶或无花果蛋白酶
坐寸ο
[0295]Fe Y 等体
[0296]Fe Y受体是指可以结合于IgGl、IgG2、IgG3、IgG4单克隆抗体的Fe区的受体，实质上也指Fcy受体基因所编码的蛋白质的家族的所有成员。对人而言，该家族中含有:包含亚型 FcyRIa、Fe YRIb 和 Fe YRIc 的 Fe Y RI (CD64);亚型 Fe Y RIIa(包含异型 H131 和R131)、Fe Y RIIb (包含 Fe YRIIb-1 和 Fe Y RIIb-2)和包含 Fe Y RIIc 的 Fe Y RII (CD32)；和包含亚型Fe Y RIIIa (包含异型V158和F158)和Fe Y RIIIb (包含异型Fe y RIIIb-NAl和Fe Y RIIIb-NA2)的Fe Y RIII (CD16)、以及也包含所有未发现的人Fe Y R类或Fe Y R亚型或异型，但不限于这些。Fe Y R含有人、小鼠、大鼠、兔和猴，但不限于这些，可以由来于任何生物。对小鼠 FcyR 类而言，也含有 Fe Y RI (CD64)、Fe y RII (CD32)、Fe y RIII (CD16)和Fe Y RII1-2 (⑶16-2)、以及所有未发现的小鼠Fe Y R类或Fe Y R亚型或异型，但不限于这些。作为这样的Fe Y受体的适合的例子，可以举出:人Fe Y I (⑶64)、Fe Y IIA(⑶32)、Fe Y IIB(CD32)、Fc y IIIA(CD16)和 / 或Fe Y IIIB (CD16)。Fe Y I 的多核苷酸序列和氨基酸序列分别记载于SEQ ID NO:13(NM_000566.3)和 14(ΝΡ_000557.I)中、Fe y IIA的多核苷酸序列和氨基酸序列分别记载于SEQ ID NO:15(BC020823.1)和16 (AAH20823.1)中、Fe y IIB的多核苷酸序列和氨基酸序列分别记载于SEQ ID NO:17(BC146678.1)和18(AAI46679.1)中、Fe Y IIIA的多核苷酸序列和氨基酸序列分别记载于SEQ ID NO: 19 (BC033678.1)和20 (AAH33678.1)中、以及Fe Y IIIB的多核苷酸序列和氨基酸序列分别记载于SEQ ID NO:21(BC128562.1)和 22 (AA128563.1)中(括号内表示 RefSeq 检索号)。Fcy 受体在 IgGl、IgG2、IgG3、IgG4单克隆抗体的Fe区是否具有结合活性可以通过上述所记载的FACS或ELISA 格式、以及利用 ALPHA screen (Amplified Luminescent Proximity HomogeneousAssay)或表面等离子共振(SPR)现象的BIACORE法等来确认(Proc.Natl.Acad.Sc1.USA(2006)103(11),4005-4010)。
[0297]另外，“Fe配体”或“效应配体”是指结合于抗体的Fe区形成Fc/Fc配体复合体的、由来于任意生物的分子优选为多肽。Fe配体与Fe的结合优选诱发一个或其以上的效应机能。Fe配体包含Fe受体、Fe YR、FcaR、Fc ε R、FcRn、Clq、C3、甘露聚糖结合凝集素、甘露糖受体、葡萄球菌的蛋白A、葡萄球菌的蛋白质G和病毒的Fcy R，但不限于这些。Fe配体还包含与Fe Y R同种的为Fe受体家族的Fe受体同系物(FcRH) (Davis et al.，(2002)Immunological Reviewsl90,123-136)。Fe配体还可以包含结合于Fe的未发现的分子。
[0298]FcY等体-结合活件
[0299]Fe 区对 Fe Y 1、Fe Y IIA, Fe Y IIB, Fe Y IIIA 和 / 或 Fe Y IIIB 中任一个的 Fe Y受体-结合活性降低，这一点可以通过上述所记载的FACS或ELISA格式、以及利用ALPHAscreen (Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay)或表面等离子共振(SPR)现象的 BIACORE 法等来确认(Proc.Natl.Acad.Sc1.USA (2006) 103 (11)，4005-4010)。
[0300]ALPHA screen通过使用供体和受体的两个珠的ALPHA技术，基于下述原理进行实施。结合于供体珠的分子与结合于受体珠的分子生物学上相互作用，仅在两个珠接近的状态时，检测到发光信号。由激光激发的供体珠内的光敏剂将周边的氧气变换为激发状态的单态氧。单态氧向供体珠周边扩散，当到达接近的受体珠时引起珠内的化学发光反应，最终放出光。结合于供体珠的分子与结合于受体珠的分子不相互作用时，供体珠产生的单态氧不到达受体珠，因此不引起化学发光反应。
[0301]例如，使生物素标记的多肽缔合体结合在供体珠上，使用谷胱甘肽S转移酶(GST)进行标签化的Fe Y受体结合在受体珠上。在具有竞争的突变Fe区的多肽缔合体的非存在下，具有野生型Fe区的多肽缔合体与Fe Y受体相互作用，产生520-620nm的信号。具有非标签化的突变Fe区的多肽缔合体和具有野生型Fe区的多肽缔合体竞争与Fe Y受体间的相互作用。通过定量竞争的结果出现的荧光的减少，可以决定相对的结合亲和性。将抗体等的多肽缔合体使用Sulfo-NHS-生物素等进行生物素化是公知的。作为将Fe Y受体用GST进行标签化的方法，可以适当采用以下方法:将编码Fe Y受体的多核苷酸和编码GST的多核苷酸符合读框的融合，使所得融合基因在持有表达可能的载体的细胞等中表达，使用谷胱甘肽柱进行纯化的方法等。所得信号适合通过使用例如GRAPHPAD PRISM(GraphPad社、San Diego)等的软件使其适 应于利用非线性回归分析的单位点竞争(one-sitecompetition)模型来进行分析。
[0302]若将观察相互作用的物质的一方(配体)固定于传感器芯片的金薄膜上，从传感器芯片的背侧照射光使其在金薄膜和玻璃的界面得以全反射，则在反射光的一部分形成反射强度降低的部分(SPR信号)。若将观察相互作用的物质的另一方(分析物)流至传感器芯片的表面，使配体与分析物相结合，则得以固定的配体分子的质量增加，传感器芯片表面的溶剂的折射率发生变化。由于该折射率的变化，SPR信号的位置发生移动(相反，若结合解离，则信号的位置还原)。Biacore系统将上述的移动的量、即在传感器芯片表面的质量变化作为纵轴，将质量的时间变化作为测定数据来表示(传感图)。由传感图的曲线求得动力学参数:结合速率常数(ka)和解离速率常数(kd)，由该常数之比求得亲和力(KD)。在BIACORE法中也适合使用抑制测定法。抑制测定法的例子记载于Proc.Natl.Acad.Sc1.USA (2006) 103(11)，4005-4010 中。
[0303]在本说明书中，Fe Y受体-结合活性降低是指，例如，基于上述的分析方法，与作为对照的多肽缔合体的竞争活性相比较，测试多肽缔合体的竞争活性显示50%以下、优选45%以下、40%以下、35%以下、30%以下、20%以下、15%以下、特别优选10%以下、9%以下、8%以下、7%以下、6%以下、5%以下、4%以下、3%以下、2%以下、I %以下的结合活性。[0304]作为对照的多肽缔合体，可以适当利用具有IgGl、IgG2、IgG3或IgG4单克隆抗体的Fe区的多肽缔合体。该Fe区的结构记载于SEQ ID NO:23 (在RefSeq检索号AAC82527.1的N末端附加A)、24 (在RefSeq检索号AAB59393.1的N末端附加A)、25 (在RefSeq检索号CAA27268.1的N末端附加A)、26 (在RefSeq检索号AAB59394.1的N末端附加A)。另夕卜，将具有某特定的同种型的抗体的Fe区的突变体的多肽缔合体作为测试物质使用的情况下，通过将具有该特定的同种型的抗体的Fe区的多肽缔合体作为对照使用，验证该突变体所具有的突变对Fe Y受体-结合活性的效果。如上所述，可以适当制作Fe Y受体-结合活性降低得以验证的具有Fe区突变体的多肽缔合体。
[0305]作为这样的突变体的例子，按照EU编号特定的氨基酸即231A-238S的缺失(W02009/011941)、C226S, C229S, P238S, (C220S) (J.Rheumatol (2007) 34，11)、C226S,C229S(Hum.Antibod.Hybridomas (1990) 1 (1),47-54), C226S, C229S, E233P, L234V,L235A(Blood(2007) 109，1185-1192)等的突变体为公知的。
[0306]S卩，适合举出:在构成特定的同种型抗体的Fe区的氨基酸中，具有按照EU编号特定的下述任一种氨基酸:220位、226位、229位、231位、232位、233位、234位、235位、236位、237 位、238 位、239 位、240 位、264 位、265 位、266 位、267 位、269 位、270 位、295 位、296位、297 位、298 位、299 位、300 位、325 位、327 位、328 位、329 位、330 位、331 位、332 位被取代的Fe区的多肽缔合体。作为Fe区起源的抗体的同种型没有特别限定，可以适当利用以IgGU IgG2、IgG3或IgG4单克隆抗体为起源的Fe区，但适合利用以IgGl抗体为起源的Fe区。
[0307]例如，也可以适当使用:在构成IgGl抗体的Fe区的氨基酸中，具有施行了按照EU编号特定的下述任意取代(数字表示按照EU编号特定的氨基酸残基的位置；位于数字前的单字母的氨基酸符号表示取代前的氨基酸残基；位于数字后的单字母的氨基酸符号表示取代前的氨基酸残基)的Fe区、或缺失231位?238位的氨基酸序列的Fe区的多肽缔合体:
[0308](a)L234F、L235E`、P331S、
[0309](b)C226S、C229S、P238S、
[0310](c)C226S、C229S、
[0311 ] (d) C226S、C229S、E233P、L234V、L235A。
[0312]另外，也可以适当使用:在构成IgG2抗体的Fe区的氨基酸中，具有施行了按照EU编号特定的下述任意取代(数字表示按照EU编号特定的氨基酸残基的位置；位于数字前的单字母的氨基酸符号表示取代前的氨基酸残基；位于数字后的单字母的氨基酸符号表示取代前的氨基酸残基)的Fe区的多肽缔合体:
[0313](e) H268Q、V309L、A330S、P331S
[0314](f) V234A
[0315](g) G237A
[0316](h)V234A、G237A
[0317](i)A235E、G237A
[0318](j)V234A、A235E、G237A。
[0319]另外，也可以适当使用:在构成IgG3抗体的Fe区的氨基酸中，具有施行了按照EU编号特定的下述任意取代(数字表示按照EU编号特定的氨基酸残基的位置；位于数字前的单字母的氨基酸符号表示取代前的氨基酸残基；位于数字后的单字母的氨基酸符号表示取代前的氨基酸残基)的Fe区的多肽缔合体:
[0320](k) F241A
[0321](1)D265A
[0322](m)V264A。
[0323]另外，也可以适当使用:在构成IgG4抗体的Fe区的氨基酸中，具有施行了按照EU编号特定的下述任意取代(数字表示按照EU编号特定的氨基酸残基的位置；位于数字前的单字母的氨基酸符号表示取代前的氨基酸残基；位于数字后的单字母的氨基酸符号表示取代前的氨基酸残基)的Fe区的多肽缔合体:
[0324](n)L235A、G237A、E318A
[0325](ο) L235E
[0326](p)F234A、L235A。
[0327]作为其他优选的例子，可以举出:在构成IgGl抗体的Fe区的氨基酸中，具有按照EU编号特定的下述任一种氨基酸:233位、234位、235位、236位、237位、327位、330位、331位被对应的IgG2或IgG4中其EU编号所对应的氨基酸取代的Fe区的多肽缔合体。
[0328]作为其他优选的例子，可以适合举出:在构成IgGl抗体的Fe区的氨基酸中，具有按照EU编号特定的下述任意一个或其以上的氨基酸:234位、235位、297位被其他氨基酸取代的Fe区的多肽缔合体。对于 取代后存在的氨基酸的种类没有特别的限定，但特别优选具有234位、235位、297位的任意一个或其以上的氨基酸被丙氨酸取代的Fe区的多肽缔合体。
[0329]作为其他优选的例子，可以适合举出:在构成IgGl抗体的Fe区的氨基酸中，具有按照EU编号特定的下述任一种氨基酸:265位被其他氨基酸取代的Fe区的多肽缔合体。对于取代后存在的氨基酸的种类没有特别的限定，但特别优选具有265位的氨基酸被丙氨酸取代的Fe区的多肽缔合体。
[0330]以双特异性抗体为起源的Fe区
[0331]在本说明书中，作为Fe Y受体-结合活性降低的Fe区，也适当使用以双特异性抗体(bispecific抗体)为起源的Fe区。双特异性抗体是指,具有两个不同的特异性的抗体。IgG型的双特异性抗体可以通过融合产生IgG抗体的两种杂交瘤而生成的杂交的杂交瘤(hybrid hybridoma) (quadroma)来分泌(Milstein C et al.Nature (1983) 305, 537-540)。
[0332]另外，IgG型的双特异性抗体通过向细胞导入构成目标的两种IgG的L链和H链的基因、总计四种基因并使它们共表达来分泌。然而，通过这些方法产生的IgG的H链和L链的组合理论上具有10种。从10种的IgG中纯化由目标组合的H链和L链组成的IgG是困难的。并且即使是目标的组合，理论上分泌量也明显低下，因此需要较大的培养规模，制备上的成本将进一步增大。
[0333]此时，可以通过在构成H链Fe区的CH3区上施行适当的氨基酸取代，使H链的异种组合的IgG优先分泌。具体而言，为下述方法:通过将存在于一个H链的CH3区的氨基酸侧链取代成更大的侧链(knob (指“突起”))，将存在于另一个H链的CH3区的氨基酸侧链取代成更小的侧链(hole (指“空隙”))，使突起可以配置于空隙内而引起异种H链形成的促进和同种H链形成的抑制的方法(W01996/027011、Ridgway JB et al., ProteinEngineering(1996)9,617-621、Merchant AM et al.Nature Biotechnology (1998) 16,677-681)。
[0334]另外，关于L链，与H链可变区相比，L链可变区的多样性较低，因此期待获得可以对两H链赋予结合能的共同的L链。通过将该共同L链和两H链基因导入细胞，使IgG表达，使高效率的双特异性IgG的表达成为可能(Nature Biotechnology (1998) 16,677-681)。然而，在任意选择两种抗体的情况下，含有相同的L链的可能性较低，实行上述的想法是困难的，因此选择对任意不同的H链显示较高的结合能的共同L链的方法也被提案(TO2004/065611)。
[0335]另外，还已知通过将多肽的缔合、或由多肽构成的异种多聚体的缔合的控制方法利用于构成Fe区的两个多肽的缔合来制作双特异性抗体的技术。即，控制多肽缔合的方法可以用于双特异性抗体的制作，所述方法是通过改变构成Fe区的形成两个多肽内的界面的氨基酸残基，来控制使具有相同序列的构成Fe区的多肽的缔合得以抑制，使序列不同的两个构成Fe区的多肽缔合体形成的方法(W02006/106905)。
[0336]作为本发明涉及的包含Fe区的结构域，可以适当使用以上述的双特异性抗体为起源的构成Fe区的两个多肽。更具体而言，适合使用具有以下特征的两个多肽:为构成Fe区的两个多肽，其中一个多肽的氨基酸序列中，按照EU编号特定的349位的氨基酸为半胱氨酸、366位的氨基酸为色氨酸；另一个多肽的氨基酸序列中，按照EU编号特定的356位的氨基酸为半胱氨酸、366位的氨基酸为丝氨酸、368位的氨基酸为丙氨酸、407位的氨基酸为缬氨酸。
[0337]在另一个方案中，作为本发明涉及的包含Fe区的结构域，适合使用具有以下特征的两个多肽:为构成Fe区的两个多肽，其中一个多肽的氨基酸序列中，按照EU编号特定的409位的氨基酸为天冬氨酸，另一个多肽的氨基酸序列中，按照EU编号特定的399位的氨基酸为赖氨酸。在上述方案中，409位的氨基酸可以是代替天冬氨酸的谷氨酸，399位的氨基酸可以是代替赖氨酸的精氨酸。另外，除了 399位的赖氨酸外，也可以适合追加360位的天冬氨酸或392位的天冬氨酸。
[0338]在另一方案中，作为本发明涉及的包含Fe区的结构域，可以适合使用具有以下特征的两个多肽:为构成Fe区的两个多肽，其中一个多肽的氨基酸序列中，按照EU编号特定的370位的氨基酸为谷氨酸，另一个多肽的氨基酸序列中，按照EU编号特定的357位的氨基酸为赖氨酸。
[0339]并且，在另一方案中，作为本发明涉及的包含Fe区的结构域，可以适合使用具有以下特征的两个多肽:为构成Fe区的两个多肽，其中一个多肽的氨基酸序列中，按照EU编号特定的439位的氨基酸为谷氨酸，另一个多肽的氨基酸序列中，按照EU编号特定的356位的氨基酸为赖氨酸。
[0340]并且，作为本发明涉及的包含Fe区的结构域，适合使用下述的使它们组合的方案:
[0341]两个多肽，其特征在于:为构成Fe区的两个多肽，其中一个多肽的氨基酸序列中，按照EU编号特定的409位的氨基酸为天冬氨酸、370位的氨基酸为谷氨酸，另一个多肽的氨基酸序列中，按照EU编号特定的399位的氨基酸为赖氨酸、357位的氨基酸为赖氨酸(在本方案中，370位的谷氨酸可以代替为天冬氨酸，370位的谷氨酸可以代替为392位的天冬氨酸)；
[0342]两个多肽，其特征在于:为构成Fe区的两个多肽，其中一个多肽的氨基酸序列中，按照EU编号特定的409位的氨基酸为天冬氨酸、439位的氨基酸为谷氨酸，另一个多肽的氨基酸序列中，按照EU编号特定的399位的氨基酸为赖氨酸、356位的氨基酸为赖氨酸(在本方案中，439位的谷氨酸可以代替为360位的天冬氨酸、392位的天冬氨酸或439位的天冬氨酸)；
[0343]两个多肽，其特征在于:为构成Fe区的两个多肽，其中一个多肽的氨基酸序列中，按照EU编号特定的370位的氨基酸为谷氨酸、439位的氨基酸为谷氨酸，另一个多肽的氨基酸序列中，按照EU编号特定的357位的氨基酸为赖氨酸、356位的氨基酸为赖氨酸；或者，
[0344]两个多肽，其特征在于:为构成Fe区的两个多肽，其中一个多肽的氨基酸序列中，按照EU编号特定的409位的氨基酸为天冬氨酸、370位的氨基酸为谷氨酸、439位的氨基酸为谷氨酸，另一个多肽 的氨基酸序列中，按照EU编号特定的399位的氨基酸为赖氨酸、357位的氨基酸为赖氨酸、356位的氨基酸为赖氨酸(在本方案中，可以不将370位的氨基酸取代为谷氨酸，并且在不将370位的氨基酸取代为谷氨酸的基础上，439位的谷氨酸可以代替为天冬氨酸或439位的谷氨酸可以代替为392位的天冬氨酸)。
[0345]并且，在另一方案中，作为本发明涉及的包含Fe区的结构域也适合使用两个多肽，所述两个多肽的特征在于:为构成Fe区的两个多肽，其中一个多肽的氨基酸序列中，按照EU编号特定的356位的氨基酸为赖氨酸，另一个多肽的氨基酸序列中，按照EU编号特定的435位的氨基酸为精氨酸、439位的氨基酸为谷氨酸。
[0346]作为本发明涉及的包含Fe区的结构域，通过使用以上述的双特异性抗体为起源的构成Fe区的两个多肽，可以使本发明涉及的抗原结合结构域和/或CD3结合结构域按照所需的组合进行配置。
[0347]C末端的异质性得以改善的Fe区
[0348]在本说明书中，作为Fe Y受体-结合活性降低的Fe区，除了上述的特征外，可以适当使用Fe区的C末端的异质性得以改善的Fe区。更具体而言，提供以IgGl、IgG2、IgG3或IgG4为起源的构成Fe区的两个多肽的氨基酸序列中，按照EU编号特定的446位的甘氨酸和447位的赖氨酸缺失的Fe区。
[0349]T细胞受体复合体结合结构域
[0350]在本说明书中，“T细胞受体复合体结合结构域”是指，包含与部分或全部T细胞受体复合体特异性结合、且互补的区而成的部分T细胞受体复合体抗体。T细胞受体复合体可以为T细胞受体本身，也可以为与T细胞受体共同构成T细胞受体复合体的接合体分子。适合作为接合体的为CD3。
[0351]T细胞受体结合结构域
[0352]在本说明书中，“T细胞受体结合结构域”是指，包含与部分或全部T细胞受体特异性结合且互补的区而成的部分T细胞受体抗体。
[0353]作为T细胞受体，可以为可变区也可以为恒定区，但优选的CD3结合结构域所结合的表位为存在于恒定区的表位。作为恒定区的序列，例如可以举出=RefSeq检索号CAA26636.1的T细胞受体α链(SEQ ID NO:67)、RefSeq检索号C25777的T细胞受体β链(SEQ ID NO:68)、RefSeq 检索号 Α26659 的 T 细胞受体 Y I 链(SEQ ID NO:69)、RefSeq检索号 AAB63312.1 的 T 细胞受体 Y 2 链(SEQ ID NO:70) ,RefSeq 检索号 AAA61033.1 的 T细胞受体δ链(SEQ ID Ν0:71)的序列。
[0354]CD3结合结构域
[0355]在本说明书中，“CD3结合结构域”是指，包含与部分或全部CD3特异性结合且互补的区而成的部分CD3抗体。CD3结合结构域可以由一个或多个抗体的可变结构域提供。优选CD3结合结构域包含CD3抗体的轻链可变区(VL)和CD3抗体的重链可变区(VH)。作为这样的⑶3结合结构域的例子,适合举出:“scFv(single chain Fv) ”、“单链抗体(singlechain antibody) ”、“Fv”、“scFv2 (single chain FV2)，，、“Fab” 或 “F (ab' )2”等。
[0356]本发明涉及的CD3结合结构域，只要是构成人CD3的存在于Y链、δ链或ε链序列的表位即可，可以与任意表位结合。在本发明中，优选适合使用与存在于人CD3复合体的ε链的胞外域上的表位结合的、包含CD3抗体的轻链可变区(VL)和CD3抗体的重链可变区(VH)的CD3结合结构域。作为这样的⑶3结合结构域，适合使用包含0ΚΤ3抗体(Proc.Natl.Acad.Sc1.USA(1980) 77，4914-4917)或各种公知的CD3抗体的轻链可变区(VL)和⑶3抗体的重链可变区(VH)的⑶3结合结构域。另外，可以适当使用:以通过将构成人⑶3的Y链、δ链或ε链利用上述方法对所需动物进行免疫而获得的具有所需性质的CD3抗体为起源的CD3结合结构域。成为CD3结合结构域起源的CD3抗体适当使用如上述进行适当人源化的抗体或人抗体。关于构成CD3的Y链、δ链或ε链的结构，其多核苷酸序列记载于 SEQ ID NO:27(ΝΜ_000073.2)、29(ΝΜ_000732.4)和 31 (ΝΜ_000733.3)中，其多肽序列记载于 SEQ ID NO:28(ΝΡ_000064.1)、30 (ΝΡ_000723.I)和 32 (ΝΡ_000724.I)中(括号内表示RefSeq检索号)。
[0357]多狀缔合体
[0358]本发明涉及的多肽缔合体只要包含下述的结构域即可，对其结构没有限定:
[0359](I)抗原结合结构域 ；
[0360](2)含有Fe区的结构域，其中，该Fe区为Fe Y受体-结合活性降低的Fe区；和
[0361](3) T细胞受体复合体结合结构域。
[0362]在本发明中，T细胞受体复合体结合结构域优选为T细胞受体结合结构域或者CD3结合结构域。上述的各结构域可以通过肽键直接连接。例如，(I)作为抗原结合结构域使用F(ab' )2, (2)作为含有Fe Y受体-结合活性降低的Fe区的结构域使用这些Fe区的情况下，将(I)记载的抗原结合结构域和(2)记载的包含Fe区的结构域用肽键连接时，被连接的多肽形成抗体的结构。为了制作这样的抗体，除了从前述的杂交瘤的培养液中进行纯化之外，还可以从编码构成该抗体的多肽的多核苷酸得以稳定维持的所需宿主细胞的培养液中纯化该抗体。
[0363]在将(3) CD3结合结构域与该抗体结构结合的情况下，该CD3结合结构域可以经由肽键与该抗体结构的恒定区的C末端结合。作为另一方案，该CD3结合结构域可以经由肽键与该抗体结构的重链可变区或轻链可变区的N末端结合。作为其他方案，该CD3结合结构域可以经由肽键与该抗体结构的轻链恒定区的C末端结合。结合的CD3结合结构域可以采用具有所需结构的CD3结合结构域，但适当使用优选Fv、更优选scFv。对结合于该抗体结构的CD3结合结构域的价数不进行限定。为了将二价的CD3结合结构域与该抗体结构结合，可以经由肽键使各为一价的CD3结合结构域与构成该抗体结构的恒定区的两个Fe区的各C末端结合。另外，为了将二价的CD3结合结构域与该抗体结构结合，可以经由肽键使二价的scFv即sc (Fv) 2与两个Fe区中的一个Fe区的C末端结合。该情况下,通过使用以上述的双特异性抗体为起源的Fe区，可以高效率地获得仅在构成该抗体结构的恒定区的两个Fe区中的一个Fe区的C末端上结合二价的scFv即sc (Fv) 2的多肽缔合体。另外,为了将一价的CD3结合结构域与该抗体结构结合,可以经由肽键使一价的scFv与两个Fe区中的一个Fe区的C末端结合。该情况下，通过使用以上述的双特异性抗体为起源的Fe区，可以高效率地获得仅在构成该抗体结构的恒定区的两个Fe区中的一个Fe区的C末端上结合一价的scFv的本发明涉及的多肽缔合体。
[0364]另外，使(3) CD3结合结构域经由肽键与该抗体结构的恒定区的C末端结合的情况下，也可以适当利用:使构成CD3结合结构域的重链Fv片段与构成Fe区的一个恒定区的C末端(CH3结构域)相连接，使构成CD3结合结构域的轻链Fv片段与构成Fe区的另一个恒定区的C末端(CH3结构域)相连接的多肽缔合体。该情况下，将重链Fv片段或轻链Fv片段与恒定区的C末端(CH3结构域)相连接时，适当插入Gly.Gly.Gly.Gly.Ser (SEQID N0:7)等的接头。接头的重复数目不被限定，可以适当插入从I?10、优选2?8、进一步优选2?6数目中选择的、即由1，2，3，4，5，6，7，8，9或10的重复组成的Gly.Gly.Gly.Gly.Ser (SEQ ID NO:7)等的接头。
[0365]并且，在制作使构成CD3结合结构域的重链Fv片段与构成Fe区的一个恒定区的C末端(CH3结构域)相连接，使构成CD3结合结构域的轻链Fv片段与构成Fe区的另一个恒定区的C末端(CH3结构域)相连接的多肽缔合体的情况下，为了强化该重链Fv片段和轻链Fv片段之间的缔合，可以适当实施使在该重链Fv片段和轻链Fv片段间形成二硫键这样的氨基酸残基的修饰。
[0366]在另一方案中，在制作使构成CD3结合结构域的重链Fv片段与构成Fe区的一个恒定区的C末端(CH3结构域)相连接，使`构成CD3结合结构域的轻链Fv片段与构成Fe区的另一个恒定区的C末端(CH3结构域)相连接的多肽缔合体的情况下，为了强化该重链Fv片段和轻链Fv片段之间的缔合,可以使抗体的CHl结构域和CL结构域与该重链Fv片段和轻链Fv片段的各自相连接。
[0367]并且，在另一方案中，为了将二价的CD3结合结构域与该抗体结构结合，可以经由肽键使各自为一价的CD3结合结构域与该抗体结构的两个轻链恒定区的各C末端或轻链可变区的各N末端结合。另外，为了将二价的CD3结合结构域与该抗体结构结合，可以经由肽键使二价的scFv即sc (Fv)2与两个轻链恒定区的各C末端或轻链可变区的各N末端结合。该情况下，通过使用以上述的双特异性抗体为起源的Fe区，可以高效率地获得在该抗体结构的两个轻链可变区中的一个轻链可变区的C末端或N末端上结合二价的scFv即sc (Fv) 2的多肽缔合体。另外，为了将一价的CD3结合结构域与该抗体结构结合，可以经由肽键使一价的scFv与两个轻链可变区中的一个轻链可变区的C末端或N末端结合。该情况下，通过使用以上述的双特异性抗体为起源的Fe区，可以高效率地获得在该抗体结构的两个轻链可变区中的一个轻链可变区的N末端或C末端上结合一价的scFv的本发明涉及的多肽缔合体。
[0368]在另一方案中，为了将二价的CD3结合结构域与该抗体结构结合，可以经由肽键使各自为一价的CD3结合结构域与该抗体结构的两个重链可变区的各N末端结合。另外，为了将二价的CD3结合结构域与该抗体结构结合,可以经由肽键使二价的scFv即sc (Fv) 2与两个重链可变区中的一个重链可变区的N末端结合。该情况下，通过使用以上述的双特异性抗体为起源的Fe区，可以高效率地获得仅在该抗体结构的两个重链可变区中的一个重链可变区的N末端上结合二价的scFv即sc (Fv) 2的多肽缔合体。另外，为了将一价的CD3结合结构域与该抗体结构结合,可以经由肽键使一价的scFv与两个重链可变区中的一个重链可变区的N末端结合。该情况下，通过使用以上述的双特异性抗体为起源的Fe区，可以高效率地获得在该抗体结构的两个重链可变区中的一个重链可变区的N末端上结合一价的scFv的本发明涉及的多肽缔合体。
[0369]另外，在制作上述的多肽缔合体时，各结构域可以直接通过肽键结合，此外，各结构域可以通过经由肽接头的肽键结合。该情况下，作为所采用的接头，除了在上述记载中例示的接头之外，还可以适当使用例如His标签、HA标签、myc标签、FLAG标签等的具有肽标签的接头。另外，还可以适合利用基于氢键、二硫键、共价键、离子性相互作用或这些键合的组合而相互结合的性质。例如，利用抗体的CHl与CL间的亲和性，或者在异种Fe区的缔合时使用以上述的双特异性抗体为起源的Fe区。并且，如同实施例中所记载的那样，还可以适合利用在结构域间形成的二硫键。
[0370]作为本发明涉及的多肽缔合体的其他结构，例如，作为(I)抗原结合结构域，还适合使用为一价的Fv和一价的Fab的结构。该情况下,可以使用下述结构:一价的Fv中的重链Fv片段(VH)或轻链Fv片段(VL)经由肽键连接在重链CHl区上，所述重链CHl区经由肽键连接在本发明涉及的构成多肽缔合体的(2)Fcy受体-结合活性降低的两个Fe区中的一个Fe区上；一价的Fv中的另一个VL或VH片段经由肽键连接在轻链CH区上，所述轻链CH区经由二硫键连接在该重链CHl区上，由此重链CHl区和轻链CL区的末端结合的VH和VL形成抗体结合结构域的结构。在两个Fe区中上述的不同的另一个Fe区的N末端上经由肽键可以连接(I)抗体结合 结构域和(3)形成CD3结合结构域的sc (Fv) 2。该情况下，通过使用以上述的双特异性抗体为起源的Fe区，可以制作具有下述结构的多肽缔合体:经由肽键在构成该多肽缔合体的两个Fe区中的一个Fe区上连接重链CHl区，在另一个Fe区上连接sc(Fv)2而成的结构。制作上述多肽缔合体时，各结构域可以直接通过肽键结合，此夕卜，各结构域可以通过经由肽接头的肽键结合。该情况下，作为所采用的接头，除了上述记载中所例示的接头之外，还可以适当使用例如His标签、HA标签、myc标签、FLAG标签等的具有肽标签的接头。
[0371]作为本发明涉及的多肽缔合体的其他结构，例如，作为(I)抗原结合结构域，还可以适合使用为二价的scFv的结构。作为这样的结构的方案，可以制作具有下述结构的多肽缔合体:二价的scFv中的一个通过肽键经由构成(3)⑶3结合结构域的VH与(2)Fc Y受体-结合活性降低的两个Fe区中的一个Fe区相连接,二价的scFv中的另一个通过肽键经由构成(3)CD3结合结构域的VL与(2)Fe Y受体-结合活性降低的两个Fe区中的另一个Fe区相连接而成的结构。该情况下，也可以使用以上述的双特异性抗体为起源的Fe区。制作上述多肽缔合体时，各结构域可以直接通过肽键结合，此外，各结构域可以通过经由肽接头的肽键结合。该情况下，作为所采用的接头，除了上述记载中所例示的接头之外，还可以适当使用例如His标签、HA标签、myc标签、FLAG标签等的具有肽标签的接头。
[0372]作为(I)抗原结合结构域使用二价scFv的结构的另一个方案，可以制作具有下述结构的多肽缔合体:二价的scFv中的一个通过肽键经由构成(3)⑶3结合结构域的scFv与(2) Fe Y受体-结合活性降低的两个Fe区中的一个Fe区相连接，二价的scFv中的另一个通过肽键与(2)Fe Y受体-结合活性降低的两个Fe区中的另一个Fe区相连接而成的结构。该情况下，通过使用以上述的双特异性抗体为起源的Fe区，可以制作具有下述结构的多肽缔合体:通过肽键使构成抗原结合结构域的scFv经由构成CD3结合结构域的scFv与构成该多肽缔合体的两个Fe区中的一个Fe区相连接,使构成抗原结合结构域的scFv与另一个Fe区相连接而成的结构。制作上述多肽缔合体时，各结构域可以直接通过肽键结合，此外，各结构域可以通过经由肽接头的肽键结合。该情况下，作为所采用的接头，除了上述记载所例示的接头之外，还可以适当使用例如His标签、HA标签、myc标签、FLAG标签等的具有肽标签的接头。
[0373]作为本发明涉及的多肽缔合体的其他结构，例如，还可以适合使用抗原结合结构域和T细胞受体复合体结合结构域分别为一价Fab的结构。作为这样的结构的方案，可以制作具有下述结构的多肽缔合体:构成抗原结合结构域的一价的Fab的重链Fv片段经由CHl区与构成Fe区的一个多肽相连接，该Fab的轻链Fv片段与CL区相连接；构成T细胞受体结合结构域的Fab的重链Fv片段经由CHl区与构成Fe区的另一个多肽相连接,该Fab的轻链Fv片段与CL区相连接而成的结构。
[0374]作为这样的结构的其他方案，可以制作具有下述结构的多肽缔合体:构成抗原结合结构域的一价的Fab的重链Fv片段经由CHl区与构成Fe区的一个多肽相连接,该Fab的轻链Fv片段与CL区相连接；构成T细胞受体结合结构域的Fab的轻链Fv片段经由CHl区与构成Fe区的另一个多肽相连接，该Fab的重链Fv片段与CL区相连接而成的结构。另夕卜，还可以制作具有下述结构的多肽缔合体:构成T细胞受体结合结构域的一价的Fab的重链Fv片段经由CHl区与构成Fe区的一个多肽相连接，该Fab的轻链Fv片段与CL区相连接；构成抗原结合结构域的Fab的轻链Fv片段经由CHl区与构成Fe区的另一个多肽相连接，该Fab的重链Fv片段与CL区相连接而成的结构。
[0375]并且，作为这样 的结构的其他方案，可以制作具有下述结构的多肽缔合体:构成抗原结合结构域的一价的Fab的重链Fv片段经由CHl区与构成Fe区的一个多肽相连接,该Fab的轻链Fv片段与CL区相连接；构成T细胞受体结合结构域的Fab的重链Fv片段经由CL区与构成Fe区的另一个多肽相连接，该Fab的轻链Fv片段与CHl区相连接而成的结构。另外，还可以制作具有下述结构的多肽缔合体:构成T细胞受体结合结构域的一价的Fab的重链Fv片段经由CHl区与构成Fe区的一个多肽相连接，该Fab的轻链Fv片段与CL区相连接；构成抗原结合结构域的Fab的重链Fv片段经由CL区与构成Fe区的另一个多肽相连接，该Fab的轻链Fv片段与CHl区相连接而成的结构。
[0376]本发明涉及的多肽缔合体的其他结构即抗原结合结构域和T细胞受体复合体结合结构域分别为一价Fab的结构的一个方案，适合举出包含下述结构域的多肽:
[0377](I)抗原结合结构域，其中，结合在抗原上的一价Fab结构的重链Fv片段经由CHl区与上述构成Fe区的一个多肽相连接，该Fab结构的轻链Fv片段与CL区相连接；和
[0378](2) T细胞受体复合体结合结构域，其中，结合在T细胞受体复合体上的一价Fab结构的重链Fv片段经由CHl区与构成Fe区的另一个多肽相连接，该Fab结构的轻链Fv片段与CL区相连接，[0379]并且，控制CHl区和CL区的电荷，使抗原结合结构域中的重链Fv片段与抗原结合结构域中的轻链Fv片段、或T细胞受体结合结构域中的重链Fv片段与T细胞受体结合结构域中的轻链Fv片段相缔合。在本方案中，只要可以控制CHl区和CL区的电荷使抗原结合结构域中的重链Fv片段与抗原结合结构域中的轻链Fv片段、或者T细胞受体结合结构域中的重链Fv片段与T细胞受体结合结构域中的轻链Fv片段相缔合即可，对其多肽缔合体的结构(缔合控制结构)不限于特定的一种结构。
[0380]作为该缔合控制结构的一个方案，可以制作下述多肽缔合体:连接于该T细胞受体复合体结合结构域中的重链Fv片段的CHl区的氨基酸残基和连接于抗原结合结构域中的轻链Fv片段的CL区的氨基酸残基相互具有同种的电荷。
[0381]作为该缔合控制结构的另一方案，可以制作下述多肽缔合体:连接于该抗原结合结构域中的重链Fv片段的CHl区的氨基酸残基和连接于T细胞受体复合体结合结构域中的轻链Fv片段的CL区的氨基酸残基相互具有同种的电荷。
[0382]作为该缔合控制结构的另一方案，可以制作下述多肽缔合体:连接于该T细胞受体复合体结合结构域中的重链Fv片段的CHl区的氨基酸残基和连接于该抗原结合结构域中的轻链Fv片段的CL区 的氨基酸残基相互具有同种的电荷，连接于抗原结合结构域中的重链Fv片段的CHl区的氨基酸残基和连接于T细胞受体复合体结合结构域中的轻链Fv片段的CL区的氨基酸残基相互具有同种的电荷。
[0383]另外，作为该缔合控制结构的一个方案，可以制作下述多肽缔合体:连接于该T细胞受体复合体结合结构域中的重链Fv片段的CHl区的氨基酸残基和连接于该抗原结合结构域中的轻链Fv片段的CL区的氨基酸残基相互具有同种的电荷，连接于该T细胞受体复合体结合结构域中的重链Fv片段的CHl区的氨基酸残基和连接于该T细胞受体结合结构域中的轻链Fv片段的CL区的氨基酸残基相互具有不同种的电荷。
[0384]另外，作为该缔合控制结构的另一方案，可以制作下述多肽缔合体:连接于该T细胞受体复合体结合结构域中的重链Fv片段的CHl区的氨基酸残基和连接于该抗原结合结构域中的轻链Fv片段的CL区的氨基酸残基相互具有同种的电荷，连接于该抗原结合结构域中的重链Fv片段的CHl区的氨基酸残基和连接于该T细胞受体复合体结合结构域中的轻链Fv片段的CL区的氨基酸残基相互具有同种的电荷，连接于该T细胞受体复合体结合结构域中的重链Fv片段的CHl区的氨基酸残基和连接于该T细胞受体结合结构域中的轻链Fv片段的CL区的氨基酸残基相互具有不同种的电荷。
[0385]并且，作为该缔合控制结构的一个方案，可以制作下述多肽缔合体:连接于该抗原结合结构域中的重链Fv片段的CHl区的氨基酸残基和连接于该T细胞受体复合体结合结构域中的轻链Fv片段的CL区的氨基酸残基相互具有同种的电荷，连接于该抗原结合结构域中的重链Fv片段的CHl区的氨基酸残基和连接于该抗原结合结构域中的轻链Fv片段的CL区的氨基酸残基也具有不同种的电荷。
[0386]并且，作为该缔合控制结构的另一方案，可以制作下述多肽缔合体:连接于该T细胞受体复合体结合结构域中的重链Fv片段的CHl区的氨基酸残基和连接于该抗原结合结构域中的轻链Fv片段的CL区的氨基酸残基相互具有同种的电荷，连接于该抗原结合结构域中的重链Fv片段的CHl区的氨基酸残基和连接于该T细胞受体复合体结合结构域中的轻链Fv片段的CL区的氨基酸残基相互具有同种的电荷，连接于该抗原结合结构域中的重链Fv片段的CHl区的氨基酸残基和连接于该抗原结合结构域中的轻链Fv片段的CL区的氣基酸残基也具有不同种的电荷。
[0387]此外，作为该缔合控制结构的不同的一个方案，可以制作下述多肽缔合体:连接于该T细胞受体复合体结合结构域中的重链Fv片段的CHl区的氨基酸残基和连接于该抗原结合结构域中的轻链Fv片段的CL区的氨基酸残基相互具有同种的电荷，连接于该抗原结合结构域中的重链Fv片段的CHl区的氨基酸残基和连接于该T细胞受体复合体结合结构域中的轻链Fv片段的CL区的氨基酸残基相互具有同种的电荷，连接于该T细胞受体复合体结合结构域中的重链Fv片段的CHl区的氨基酸残基和连接于该T细胞受体结合结构域中的轻链Fv片段的CL区的氨基酸残基相互具有不同种的电荷，连接于抗原结合结构域中的重链Fv片段的CHl区的氨基酸残基和连接于抗原结合结构域中的轻链Fv片段的CL区的氨基酸残基相互具有不同种的电荷。
[0388]控制CHl区和C L区的电荷
[0389]在希望获得通过T细胞受体结合结构域的重链和轻链识别T细胞受体结合结构域的表位、且通过抗原结合结构域的重链和轻链识别抗原的表位这样的双特异性多肽缔合体的情况下，当生产该多肽缔合体时使4种链分别表达，则理论上可以生产10种多肽缔合体分子。
[0390]该情况下，例如，只要控制T细胞受体结合结构域的重链与抗原结合结构域的轻链和/或抗原结合结构域的重链与T细胞受体结合结构域的轻链之间的缔合使其抑制，则可以优先获得所需的多肽缔合体分子。
[0391]例如，可以举出:将形成T细胞受体结合结构域的重链CHl与抗原结合结构域的轻链CL间的界面的氨基酸残基修饰为具有正电荷的氨基酸残基，将形成抗原结合结构域的重链CHl与T细胞受体结合结构域的轻链CL间的界面的氨基酸残基修饰为具有负电荷的氨基酸残基的例子。通过该修饰，不作为目标的T细胞受体结合结构域的重链CHl与抗原结合结构域的轻链CL 的缔合因形成界面的氨基酸残基均为正电荷而被抑制，不作为目标的抗原结合结构域的重链CHl与T细胞受体结合结构域的轻链CL的缔合因形成界面的氨基酸残基均为负电荷而被抑制。其结果，可以高效率地获得生成作为目标的T细胞受体结合结构域的重链CHl与T细胞受体结合结构域的轻链CL的缔合和作为目标的抗原结合结构域的重链CHl与抗原结合结构域的轻链CL的缔合的本发明的多肽缔合体。另外，适合地，作为目标的T细胞受体结合结构域的重链与T细胞受体结合结构域的轻链的缔合，因形成界面的氨基酸残基相互具有不同种的电荷而得以促进，作为目标的抗原结合结构域的重链与抗原结合结构域的轻链的缔合也因形成界面的氨基酸残基相互具有不同种的电荷而得以促进。其结果，可以高效率地获得生成作为目标的缔合的本发明的多肽缔合体。
[0392]另外，通过利用本发明的缔合控制，也可以抑制CHl之间(T细胞受体结合结构域的重链与抗原结合结构域的重链)、或者CL之间(T细胞受体结合结构域的轻链与抗原结合结构域的轻链)的缔合。
[0393]关于希望通过本发明控制缔合的所需多肽缔合体，本领域技术人员可以适当发现缔合时在CHl和CL的界面中接近的氨基酸残基的种类。
[0394]另外，在人、猴、小鼠和兔等的生物中，本领域技术人员可以利用公共的数据库等适当获得可作为抗体的CHl或CL利用的序列。更具体而言，可以通过后述的实施例中记载的方法获得CHl或CL的氨基酸序列信息。
[0395]例如，如后述的实施例中所示的那样，作为分别连接于构成T细胞受体结合结构域或抗原结合结构域的VH和VL的CHl与CL缔合时在CHl和CL的界面中接近(相对或接触)的氨基酸残基的具体例，可以举出以下的组合:
[0396].CHl的EU编号147位(例如，SEQ ID NO:1记载的氨基酸序列中的147位)的赖氨酸⑷和、相对(接触)的CL的EU编号180位的苏氨酸⑴；
[0397].CHl的EU编号147位的赖氨酸⑷和、相对(接触)的CL的EU编号131位的丝氨酸⑶；
[0398].CHl的EU编号147位的赖氨酸⑷和、相对(接触)的CL的EU编号164位的苏氨酸⑴；
[0399].CHl的EU编号147位的赖氨酸⑷和、相对(接触)的CL的EU编号138位的天冬酰胺(N)；
[0400].CHl的EU编号147位的赖氨酸⑷和、相对(接触)的CL的EU编号123位的谷氨酸(E)；
[0401].CHl的EU编号175位的谷氨酰胺(Q)和、相对(接触)的CL的EU编号160位的谷氨酰胺(Q)；
[0402].CHl的EU编号213位的赖氨酸⑷和、相对(接触)的CL的EU编号123位的谷氨酸(E)。
[0403]另外，关于这些部位的编号，以Kabat等人的文献(Kabat EA et al.1991.Sequence of Proteins of Immunological Interest.NIH)作为参考。
[0404]另外，本发明中的作为EU编号所记载的编号是按照EU numbering (EU编号)(Sequences of proteins of immunological interest,NIH Publication N0.91-3242)记载的。另外，在本发明中，“EU编号X位的氨基酸残基”、“EU编号X位的氨基酸”(X为任意的数)也可以读为“相当于EU编号X位的氨基酸残基”、“相当于EU编号X位的氨基酸”。
[0405]如后述的实施例中所示的那样，通过修饰这些氨基酸残基，并实施本发明的方法，可以优先获得所需的多肽缔合体。
[0406]已知这些氨基酸残基在人和小鼠中高度保守(J.Mol.Recognit.(2003) 16，113-120)，因此关于实施例所示的多肽缔合体以外的CHl和CL的缔合，也可以通过修饰对应于上述氨基酸残基的氨基酸残基来控制本发明的多肽缔合体的恒定区的缔合。
[0407]即，本发明提供多肽缔合体，其为重链和轻链的缔合得以控制的多肽缔合体，选自由以下(a)?(f)所示的氨基酸残基的组构成的组合的I组或2组以上的氨基酸残基具有同种的电荷:
[0408](a)为CHl所含有的氨基酸残基且EU编号147位的氨基酸残基、和为CL所含有的氨基酸残基且EU编号180位的氨基酸残基、
[0409](b)为CHl所含有的氨基酸残基且EU编号147位的氨基酸残基、和为CL所含有的氨基酸残基且EU编号131位的氨基酸残基、
[0410](c)为CHl所含有的氨基酸残基且EU编号147位的氨基酸残基、和为CL所含有的氨基酸残基且EU编号164位的氨基酸残基、
[0411](d)为CHl所含有的氨基酸残基且EU编号147位的氨基酸残基、和为CL所含有的氨基酸残基的且EU编号138位的氨基酸残基、
[0412](e)为CHl所含有的氨基酸残基且EU编号147位的氨基酸残基、和为CL所含有的氨基酸残基且EU编号123位的氨基酸残基、
[0413](f)为CHl所含有的氨基酸残基且EU编号175位的氨基酸残基、和为CL所含有的氨基酸残基且EU编号160位的氨基酸残基。
[0414]作为本发明的另一方案，进一步提供以下的(g)所示的氨基酸残基的组的氨基酸残基为同种电荷的抗体:
[0415](g)为CHl所含有的氨基酸残基且EU编号213位的氨基酸残基、和为CL所含有的氨基酸残基且EU编号123位的氨基酸残基。
[0416]上述组合中记载的各自的氨基酸残基，如后述的实施例中所示的那样，在缔合时相互接近。关于所需的CHl或CL，本领域技术人员可以通过使用市售的软件的同源性仿真法(homology modeling)等,发现对应于上述(a)?(g)中记载的氨基酸残基的部位,该部位的氨基酸残基可以供于适当修饰。
[0417]在上述抗体中，“具有电荷的氨基酸残基”优选选自例如以下的⑴或⑴的任一组合中所含有的氨基酸残基:
[0418](X)谷氨酸(E)、天冬氨酸⑶、
[0419](Y)赖氨酸⑷、精氨酸 (R)、组氨酸⑶。
[0420]在上述多肽缔合体中，“具有同种的电荷”是指，例如两个以上的氨基酸残基的任一个具有上述⑴或⑴的任一组合所含有的氨基酸残基。“具有相反的电荷”是指，例如两个以上的氨基酸残基中的至少I个氨基酸残基具有上述(X)或(Y)的任一组合所含有的氨基酸残基的情况下，剩余的氨基酸残基具有不同的组合所含有的氨基酸残基。
[0421]另外，上述的多肽缔合体的制备方法、和修饰上述(a)?(g)所示的氨基酸残基的组的氨基酸残基使其成为具有同种电荷的氨基酸残基的本发明的缔合控制方法，也均为本发明的优选的方案。
[0422]在本发明中，作为供于“修饰”的氨基酸残基，不限于上述的恒定区的氨基酸残基。关于多肽突变体或异种多聚体，本领域技术人员可以通过使用市售的软件的同源性仿真法等，发现形成界面的氨基酸残基，该部位的氨基酸残基可以供于修饰以便控制缔合。
[0423]在重链可变区和轻链可变区的界面导入电荷排斥来抑制不作为目标的重链和轻链的缔合的技术中，作为在重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的界面接触的氨基酸残基，例如可以举出:重链可变区FR2的39位(例如，在W02006/106905中记载为SEQ ID NO:6的氨基酸序列中的第39号)的谷氨酰胺(Q)和、相对(接触)的轻链可变区FR2的38位(例如，在W02006/106905中记载为SEQ ID NO:8的氨基酸序列中的第44号)的谷氨酰胺(Q)。并且，可以适合例示:重链可变区FR2的45位(例如，在W02006/106905中记载为SEQ ID NO:6的氨基酸序列中的第45号)的亮氨酸(L)和、相对的轻链可变区FR2的44位(例如，在W02006/106905中SEQ ID NO:8记载的氨基酸序列中的第50号)的脯氨酸(P) ο另外，关于这些部位的编号，以Kabat等人的文献(Kabat EA et al.1991.Sequenceof Proteins of Immunological Interest.NIH)作为参考。
[0424]已知这些氨基酸残基在人和小鼠中高度保守(J.Mol.Recognit.(2003) 16，113-120)，因此关于实施例中所示的多肽缔合体以外的VH和VL的缔合也可以通过修饰对应于上述氨基酸残基的氨基酸残基来控制抗体的可变区的缔合。
[0425]更具体而言，在含有重链可变区和轻链可变区的抗体中，可以举出以下的(I)和(2)、或者、(3)和⑷的氣基酸残基为具有同种电荷的氣基酸残基的抗体:
[0426](I)为重链可变区所含有的氨基酸残基且相当于EU编号39位的氨基酸残基、
[0427](2)为轻链可变区所含有的氨基酸残基且相当于EU编号38位的氨基酸残基、
[0428](3)为重链可变区所含有的氨基酸残基且相当于EU编号45位的氨基酸残基、
[0429](4)为轻链可变区所含有的氨基酸残基且相当于EU编号44位的氨基酸残基。
[0430]上述⑴和(2)、(3)和(4)中记载的各自的氨基酸残基，在缔合时相互接近。关于所需的重链可变区或轻链可变区，本领域技术人员可以通过使用市售的软件的同源性仿真法等，发现对应于上述(I)?(4)中记载的氨基酸残基的部位，该部位的氨基酸残基可以供于适当修饰。
[0431]在上述抗体中，“具有电荷的氨基酸残基”优选选自例如以下的⑴或⑴的任一组合中所含有的氨基酸残基:
[0432](X)谷氨酸(E)、天冬氨酸⑶、
[0433](Y)赖氨酸⑷、精氨酸(R)、组氨酸⑶。
[0434]上述(I)?⑷中记载的氨基酸残基，通常，在人和小鼠中分别为:
[0435](I)谷氨酰 胺(Q)、
[0436](2)谷氨酰胺(Q)、
[0437](3)亮氨酸(L)、
[0438](4)脯氨酸⑵。
[0439]因此，在本发明的优选的方案中，这些氨基酸残基供于修饰(例如，取代为电荷氨基酸)。另外，上述(I)?(4)的氨基酸残基的种类未必限于上述的氨基酸残基，也可以是相当于该氨基酸的其他氨基酸。例如，作为相当于轻链可变区上的EU编号38位的氨基酸，人的情况下例如可以为组氨酸(H)。本领域技术人员通过参照公知文献等(例如，J.Mol.Recognit.(2003) 16，113-120)，关于轻链的任意的位置可以知道相当于该位置的氨基酸残基的种类，可以适当对该氨基酸残基进行修饰(例如，取代为电荷氨基酸)。
[0440]在将存在于重链可变区和轻链可变区的界面的形成疏水核的氨基酸残基修饰为具有电荷的极性氨基酸，抑制不作为目标的重链和轻链的缔合的技术中，作为可以在重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的界面形成疏水核的氨基酸残基，例如可以适合例示:重链可变区上的45位的亮氨酸(L)和、相对的轻链可变区上的44位的脯氨酸(P)。
[0441]通常疏水核(hydrophobic core) ”是指,在缔合了的多肽的内侧集合疏水性氨基酸的侧链而形成的部分。疏水性氨基酸包含例如丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、缬氨酸等。另外，疏水核的形成可能也有疏水性氨基酸以外的氨基酸残基(例如酪氨酸)参与。该疏水核与亲水性氨基酸的侧链向外侧暴露的亲水性表面一起成为促进水溶性多肽的缔合的驱动力。若两个不同的结构域的疏水性氨基酸存在于分子表面，且向水分子暴露，则熵增加而使自由能增加。因此，两个结构域使自由能减少，为了安定化而相互缔合，界面的疏水性氨基酸埋在分子内部，形成了疏水核。
[0442]发生多肽的缔合时，被认为通过从形成疏水核的疏水性氨基酸修饰为带有电荷的极性氨基酸，抑制了疏水核的形成，其结果，抑制了多肽的缔合。[0443]本发明的多肽缔合体可以进一步适用其他公知技术。例如，使第一的VH(VHl)与第一的VL(VLl)、和/或第二的VH(VH2)与第二的VL(VL2)的缔合促进，加上本发明的“修饰”，通过将存在于一个H链的可变区的氨基酸侧链取代成较大的侧链(knob ;突起)，将存在于另一个H链的相对应的可变区的氨基酸侧链取代成较小的侧链(hole ;空隙)，使突起可以配置在空隙内，从而促进VHl与VL1、和/或VH2与VL2的缔合，结果可以进一步抑制VHl 与VL2、和/或VH2与VLl 的多肽间的缔合(W01996/027011、Ridgway JB et al.,ProteinEngineering(1996)9,617-621> Merchant AM et al.Nature Biotechnology(1998) 16,677-681)。
[0444]制作上述的多肽缔合体时，各结构域可以直接通过肽键结合，此外，各结构域可以通过经由肽接头的肽键结合。该情况下，作为所采用的接头，除了在上述例示的接头之外，还可以适当使用例如His标签、HA标签、myc标签、FLAG标签等的具有妝标签的接头。另外，还可以适合利用基于氢键、二硫键、共价键、离子性相互作用或这些键合的组合而相互结合的性质。例如，利用抗体的CHl和CL间的亲和性，或者在异种Fe区的缔合时使用以上述的双特异性抗体为起源的Fe区。并且，如同实施例中所记载的那样，还可以适合利用在结构域间形成的二硫键。
[0445]作为本发明涉及的多肽缔合体，可以举出例如图17、图19和图24所记载的方案。
[0446]本发明涉及的多肽缔合体通过与上述重组抗体的制备方法相同的方法来制作。
[0447]另外，本发明涉及编码本发明的多肽缔合体的多核苷酸。本发明的多肽缔合体可以插入到任意的表达载体中。用表达载体转化适当的宿主，可以获得表达多肽缔合体的细胞。若培养表达多肽缔合体的细胞，从培养上清中回收表达产物，则可以获得由该多核苷酸所编码的多肽缔合体。即，本发明涉及包含多核苷酸的载体，所述多核苷酸编码本发明的多肽缔合体；持有该载体的细胞；以及多肽缔合体的制备方法，该制备方法包含:培养该细胞，从培养上清中回收多肽缔合体。这些可以通过例如与上述重组抗体同样的方法来获得。
[0448]药物纟目合物`
[0449]在其他观点中，本发明提供含有多肽缔合体作为有效成分的药物组合物，所述多肽缔合体包含下述结构域:(I)抗原结合结构域；(2)含有Fe区的结构域，其中，该Fe区为Fcy受体-结合活性降低的Fe区；和(3)CD3结合结构域。另外，本发明涉及含有该缔合体作为有效成分的诱导细胞毒的治疗剂(细胞毒诱导治疗剂)、细胞增殖抑制剂和抗癌剂。本发明的药物组合物还可以用作癌症治疗剂或者癌预防剂。本发明的细胞毒诱导治疗剂、细胞增殖抑制剂和抗癌剂优选给予患有癌症的对象或者有复发可能的对象。
[0450]另外，在本发明中，以含有包含下述⑴?(3):
[0451](I)抗原结合结构域；
[0452](2)含有Fe区的结构域，其中，该Fe区为Fe Y受体-结合活性降低的Fe区；和
[0453](3)⑶3结合结构域
[0454]的多肽缔合体作为有效成分的细胞毒诱导治疗剂、细胞增殖抑制剂和抗癌剂也可以描述为:预防或治疗癌症的方法，该方法包含将该多肽缔合体给予对象的步骤；或者，该多肽缔合体在制备细胞毒诱导治疗剂、细胞增殖抑制剂和抗癌剂中的应用。
[0455]在本发明中，“以含有包含(I)抗原结合结构域；(2)含有Fe区的结构域，其中，该Fe区为Fe Y受体-结合活性降低的Fe区；和(3)CD3结合结构域的多肽缔合体作为有效成分”是指，将该多肽缔合体作为主要的活性成分含有，不限制该多肽缔合体的含量。
[0456]并且，在本发明的药物组合物、或者细胞毒诱导治疗剂、细胞增殖抑制剂和抗癌剂中，根据需要可以配合多种的多肽缔合体。例如，通过制成与相同抗原结合的多个的本发明多肽缔合体的鸡尾酒(cocktail)，可以增强对表达该抗原的细胞的细胞毒作用。或者，在包含一个对于抗原的抗原结合结构域的本发明多肽缔合体的基础上，通过配合包含与其他癌抗原结合的抗原结合结构域的本发明多肽缔合体，可以提高治疗效果。
[0457]另外，根据需要，本发明的多肽缔合体可以封入到微胶囊(羟甲基纤维素、明胶、聚甲基丙烯酸甲酯等的微胶囊)中，可以制成胶体给药系统(colloidal drugdelivery systems)(脂质体、白蛋白微球体、微乳状液、纳米粒子和纳米胶囊等)(参照"Remington' s Pharmaceutical Science 16thedition" , Oslo Ed.(1980)等)。并且，将药剂制成持续释放性药剂的方法也是公知的，该方法可以适用于本发明的多肽缔合体(J.Biomed.Mater.Res.(1981) 15，267-277、Chemtech.(1982) 12，98-105、美国专利第3773719 号、欧州专利公开公报EP58481 号、EP133988 号、Biopolymers (1983) 22，547-556)。
[0458]本发明的药物组合物、或者细胞增殖抑制剂和抗癌剂可以通过口服、胃肠外给予的任一方式向患者给予。优选胃肠外给予。作为所述的给予方法，具体可以举出:注射给予、经鼻给予、经肺给予、经皮给予等。作为注射给予，例如可以举出:静脉内注射、肌肉内注射、腹腔内注射、皮下注射等。例如，通过注射给予可以使本发明的药物组合物、或者细胞毒诱导治疗剂、细胞增殖抑制剂和抗癌剂全身或局部地给予。另外，可以根据患者的年龄、症状来选择适当的给予方法。作为给予量，例如可以在每次每kg体重0.0OOlmg?IOOOmg的范围选择给予量。或者，例如可以在每位患者0.0Olmg/身体(body)?IOOOOOmg/身体(body)的范围选择给予量。但本发明的药物组合物不限于这些的给予量。
[0459]本发明的药物组合物可以按照常规方法制成制剂(例如，Remington ' sPharmaceutical Science,latest edition,Mark Publishing Company,Easton,U.S.A),可以同时包含药学上可接受的载体或添加物。例如可以举出:表面活性剂、赋形剂、着色剂、调味剂、防腐剂、安定剂、缓冲 剂、悬浮剂、等渗剂、结合剂、崩解剂、润滑剂、流动性促进剂、矫味剂等。但是不限于这些，可以适当使用其他常用的载体。具体而言，可以举出:将轻质无水硅酸、乳糖、结晶纤维素、甘露醇、淀粉、羧甲醚纤维素钙、羧甲醚纤维素钠、羟基丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、聚乙烯缩醛二乙基氨基乙酸酯、聚乙烯吡咯烷酮、明胶、中链脂肪酸三甘油酯、聚氧乙烯氢化蓖麻油60、蔗糖、羧甲基纤维素、玉米淀粉、无机盐类等作为载体。
[0460]另外，本发明提供通过使表达某癌抗原的细胞和与该癌抗原结合的本发明的多肽缔合体相接触来对表达该癌抗原的细胞引起伤害的方法、或抑制细胞增殖的方法。与该癌抗原结合的单克隆抗体如上所述作为包含于本发明的细胞毒诱导治疗剂、细胞增殖抑制剂和抗癌剂中的与该癌抗原结合的本发明的多肽缔合体。与该癌抗原结合的本发明的多肽缔合体所结合的细胞，只要是表达该癌抗原的细胞即可不特别限定。本发明中优选的表达该癌抗原的细胞，具体而言，适合举出:卵巢癌、前立腺癌、乳腺癌、子宫癌、肝癌、肺癌、胰腺癌、胃癌、膀胱癌、和大肠癌细胞等。癌抗原为GPC3的情况下，只要是表达GPC3的癌细胞即可没有限定，可以举出肝细胞癌、肺癌、卵巢癌等作为适合的癌细胞。
[0461]在本发明中，“接触”为例如通过向在试验管内培养的表达癌抗原的细胞的培养液中添加与该癌抗原结合的本发明的多肽缔合体来进行。该情况下，作为所添加的多肽缔合体的形状，可以适当使用通过溶液或冷冻干燥等获得的固体等的形状。作为水溶液添加的情况下，可以是仅含有本发明的多肽缔合体的纯水溶液，也可以是含有例如上述记载的表面活性剂、赋形剂、着色剂、调味剂、防腐剂、安定剂、缓冲剂、悬浮剂、等渗剂、结合剂、崩解齐U、润滑剂、流动性促进剂、矫味剂等的溶液。对于添加的浓度没有特别限定，但作为培养液中的最终浓度，可以适合使用:优选lpg/ml?lg/ml的范围、更优选lng/ml?lmg/ml、进一步优选 I μ g/ml ?lmg/ml。
[0462]并且，在本发明的另一方案中，“接触”还可以通过向体内移植有表达癌抗原的细胞的非人动物、或者内在地具有表达该癌抗原的癌细胞的动物给予来进行。给予方法可以通过口服、胃肠外给予的任一方式来实施。特别优选的是胃肠外给予的给予方法，作为所述的给予方法，具体而言，可以举出:注射给予、经鼻给予、经肺给予、经皮给予等。作为注射给予,可以举出例如:静脉内注射、肌肉内注射、腹腔内注射、皮下注射等。例如,通过注射给予可以使本发明的药物组合物、或者细胞毒诱导治疗剂、细胞增殖抑制剂和抗癌剂全身或局部地给予。另外，可以根据测试动物的年龄、症状来选择适当的给予方法。作为水溶液给予的情况下，可以是仅含有本发明的多肽缔合体的纯水溶液，也可以是例如含有上述记载的表面活性剂、 赋形剂、着色剂、调味剂、防腐剂、安定剂、缓冲剂、悬浮剂、等渗剂、结合剂、崩解剂、润滑剂、流动性促进剂、矫味剂等的溶液。作为给予量，例如可以在每次每kg体重0.0OOlmg?IOOOmg的范围选择给予量。或者，例如可以在每位患者0.0Olmg/身体(body)?IOOOOOmg/身体(body)的范围选择给予量。但本发明的多肽缔合体给予量不限于这些的给予量。
[0463]作为评价或测定通过接触本发明的多肽缔合体对表达构成该多肽缔合体的抗原结合结构域所结合的抗原的细胞所引起的细胞毒的方法，适合使用以下的方法。作为在试验管内评价或测定该细胞毒活性的方法，可以举出细胞毒性T细胞活性等的测定法。本发明的多肽缔合体是否具有T细胞介导的细胞毒活性可以通过公知的方法来测定(例如，Current protocols in Immunology,Chapter7.1mmunologic studies in humans,Editor,John E, Coligan et al.，John ffiley&Sons, Inc.，(1993)等)。测定活性时，将与本发明的抗原结合结构域所结合的抗原为不同的抗原、且与用于试验的细胞未表达的抗原结合的多肽缔合体、和本发明的多肽缔合体同样作为对照来使用，本发明的多肽缔合体较作为对照使用的多肽缔合体显示更强的细胞毒活性，可以判定活性。
[0464]另外，为了在活体内评价或测定细胞毒活性，例如，将表达构成本发明的多肽缔合体的抗原结合结构域所结合的抗原的细胞移植到非人测试动物的皮内或皮下后，从当天或第二天起以每天或间隔数天静脉或腹腔内给予测试多肽缔合体。通过经日性地测定肿瘤的大小可以将该肿瘤的大小变化的差异规定为细胞毒活性。与在试验管内的评价同样，给予作为对照的多肽缔合体，当本发明的多肽缔合体的给予组中的肿瘤大小较对照多肽缔合体的给予组中的肿瘤大小明显小时，可以判定为具有细胞毒活性。
[0465]作为评价或测定通过接触本发明的多肽缔合体对于表达构成该多肽缔合体的抗原结合结构域所结合的抗原的细胞增殖的抑制效果的方法，适合使用使同位素标记的胸腺嘧啶核苷摄入到细胞内的测定或MTT法。另外，作为在活体内评价或测定细胞增殖抑制活性的方法，可以适合使用与上述记载的在活体内评价或测定细胞毒活性的方法相同的方法。[0466]本发明还提供用于本发明方法的试剂盒，所述试剂盒包含本发明的多肽缔合体或通过本发明的制备方法制备的多肽缔合体。此外，该试剂盒中，还可以包装药学上可接受的载体、溶剂、记载有使用方法的操作说明书等。
[0467]本发明还涉及用于本发明方法的、本发明的多肽缔合体或通过本发明的制备方法制备的多肽缔合体。
[0468]另外，在本说明书中引用的所有现有技术文献均作为参照援引到本说明书中。
[0469]实施例
[0470]以下通过实施例对本发明进行更详细地说明，但是这些实施例不限定本发明的范围。
[0471]〔实施例1〕GPC3ERY2的制作和研究
[0472](I)概述
[0473]作为延长给予活体内后的蛋白质的血中半衰期的方法，对目标蛋白质附加抗体的Fe结构域，利用FcRn介导的再循环机能的方法已经广为人知。然而，此时，被认为:若将天然型的Fe附加于BiTE，则单一分子经由BiTE部分的抗⑶3scFv与T细胞结合的同时，经由Fe部分与NK细胞、巨噬细胞等细胞膜上的FcgR(Fe Y受体)结合，由此通过癌抗原非依赖性地交联这些细胞而使之活性，进而可能诱导各种细胞因子。因此，制作了经由多肽接头使Fe Y受体-结合活性降低的Fe区(沉默型Fe)与BiTE相连接的分子、ERY2，并进行了将其活性与BiTE相比较的验证。通过将已知在肝癌细胞中高度表达的作为GPI锚定蛋白的对抗Glypican3 (GPC3)的抗体的scFv与对抗CD3epsilon的抗体的scFv用短的肽接头相连接，制作了对抗GPC3的BiTE(GPC3BiTE)(图17A)。接着，制作了在其上连接有沉默型Fe的对抗GPC3的ERY2 (GPC3ERY 2)(图17C)。另外，作为比较制作了常规的IgG型抗GPC3抗体。此时，IgG型抗GPC3抗体，作为已知ADCC活性更加增强的糖链部分中降低了岩藻糖含量的抗体、即低岩藻糖型抗体得以制备。
[0474](2)GPC3BiTE 的制作
[0475]将抗GPC3抗体的表达载体用作模板，通过PCR法进行扩增，分别获得了编码H链可变区(抗-GPC3VH)、L链可变区(抗-GPC3VL)的cDNA。通过使用附加有适当序列的引物和以该cDNA为模板的PCR法，制作了编码抗-GPC3scFV的cDNA片段，所述抗-GPC3scFV具有抗-GPC3VH 和抗-GPC3VL 通过由三次重复 Gly.Gly.Gly.Gly.Ser (SEQ ID NO:7)的序列组成的接头连接而成的氨基酸序列。
[0476]另外，制作了具有编码抗CD3抗体(M12)的H链可变区(M12VH)、和L链可变区(M12VL)的部分序列的核苷酸序列、且其末端序列具有互补序列的一系列的寡核苷酸。被设计成通过聚合酶反应使这些一系列的寡核苷酸经由其互补的序列部分相连接，合成相当于该H链可变区(M12VH)和L链可变区(M12VL)的多核苷酸。该寡核苷酸被混合后，通过PCR法这些寡核苷酸相连接，从而获得了编码各可变区的氨基酸序列的两个cDNA。通过使用附加有适当序列的引物和以这些cDNA为模板的PCR法，制作了编码M12scFv的cDNA片段,所述 M12scFv 具有 M12VL 和 M12VH 通过由三次重复 Gly.Gly.Gly.Gly.Ser (SEQ IDNO:7)的序列组成的接头连接而成的氨基酸序列。
[0477]接着，通过使用附加有适当序列的引物和以分别编码抗-GPC3scFV和Ml2scFv的cDNA片段为模板的PCR法，制作了编码氨基酸序列的cDNA片段，所述氨基酸序列为抗-GPC3scFv 和 M12scFv 通过由 Gly.Gly.Gly.Gly.Ser 序列(SEQ ID NO:7)组成的接头相连接，且在其C末端附加有His标签(8个的His)(除外SEQ ID NO:33记载的氨基末端的19氨基酸)。
[0478]通过使用附加有适当序列的引物和以编码除外SEQ ID NO:33记载的氨基末端的19氨基酸的氨基酸序列的cDNA片段为模板的PCR法，制作了在该cDNA片段的5'侧附加有EcoRI切割序列、kozac序列、和编码分泌信号序列的核苷酸序列，且在其3'侧附加有NotI切割序列的cDNA片段。通过将该cDNA片段用EcoR1、NotI切割，插入到哺乳动物细胞用表达载体，获得了 GPC3BiTE(SEQ ID NO:33，作为信号序列的氨基末端19氨基酸不包含在成熟序列中)的表达载体。
[0479]该载体通过电穿孔法基因导入到CHO细胞DG44株中。有限稀释后，在lmg/mL遗传霉素存在下培养基因导入的细胞，由此分离出耐药细胞株。通过使用对抗His标签的抗体，对所得细胞株的培养上清进行蛋白质印迹分析，选择了表达GPC3BiTE的细胞株。
[0480]通过大量培养上述细胞株而获得的培养上清被添加到SP Sepharose FF柱(GEHealthcare社)。洗涤该柱后，包含GPC3BiTE的组分用NaCl的浓度梯度洗脱。进一步地，该组分被添加到HisTrap HP柱(GE Healthcare社)。洗涤该柱后，包含GPC3BiTE的组分用咪唑的浓度梯度洗脱。该组分通过超滤膜浓缩后，浓缩液被添加到Superdex200柱(GEHealthcare社)。通过仅回收单体的GPC3BiTE组分，获得了纯化GPC3BiTE。
[0481]⑶GPC3ERY2 的制作
[0482]通过使用与上述方法同样的附加有适当序列的引物的PCR法、和使用QuikChangeSite-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene社)的方法等的本领域公知的方法,制作了插入有多核苷酸的表达载体，所述多核苷酸分别编码GPC3ERY2_Hk(SEQ ID N0:34，作为信号序列的氨基末端19氨基酸不包含在成熟序列中)和GPC3ERY2_Hh(SEQ ID NO:35，作为信号序列的氨基末端19氨基酸不包含在成熟序列中)。
[0483]这些表达载体被共导入到FreeStyle293_F细胞(Invitrogen社)，使GPC3ERY2瞬时表达。所得培养上清被添加到抗FLAG M2柱(Sigma社)，洗涤该柱后，实施了用0.lmg/mLFLAG肽(Sigma社)的洗脱。包含GPC3ERY2的组分被添加到HisTrap HP柱(GE Healthcare社)，洗涤该柱后，实施了用咪唑浓度梯度的洗脱。包含GPC3ERY2的组分通过超滤膜浓缩后，浓缩液被添加到Superdex200柱(GE Healthcare社)，通过仅回收该洗脱液的单体的GPC3ERY2 组分，获得了 纯化 GPC3ERY2。
[0484](4)低岩藻糖型抗GPC3抗体的制作
[0485]抗GPC3抗体(在W02006/006693中记载为人源化GC33抗体)的表达载体通过电穿孔法基因导入到⑶P岩藻糖敲除CHO细胞DXBll株(Cancer Sc1.(2010)101(10),2227-33)。有限稀释后，在0.5mg/mL遗传霉素存在下进行培养，由此选择出耐药株，获得了低岩藻糖型抗GPC3抗体表达株。由培养该细胞而制备的培养上清，通过使用Hitrap(R)ProteinA(Pharmacia社)的常规亲和纯化制备了抗体组分。接着，该抗体组分供给到使用Superdex20026/60 (Pharmacia社)的凝胶过滤纯化,通过分取洗脱液的单体组分，获得了低岩藻糖型GPC3抗体。
[0486](5)使用人外周血单核细胞测定细胞毒活性
[0487](5-1)人外周血单核细胞(PBMC)溶液的制备[0488]使用预先注入了 100 μ LI, 000单位/mL肝素溶液(Novo-肝素注5千单位，NovoNordisk社)的注射器，由健康人志愿者(成人)采取了外周血50mL。用PBS(-)稀释2倍后被4等分的外周血加入到预先注入15mL的Ficoll-Paque PLUS进行了离心操作的Leucosep 淋巴细胞分离管(Cat.N0.227290>Greiner bio-one 社)。离心分离(2,150rpm>10分钟、室温)该分离管后，单核细胞组分层被分取。用包含10% FBS的Dulbecco' sModified Eagle' s Medium (SIGMA社、以下10% FBS/D-MEM)洗涤单核细胞组分的细胞一次后，该细胞使用10% FBS/D-MEM制备成使其细胞密度为4X106/mL。如此制备的细胞溶液作为人PBMC溶液用于以后的试验。
[0489](5-2)细胞毒活性的测定
[0490]细胞毒活性基于使用xCELLigence实时细胞分析仪(Roche Diagnostics社)的细胞增殖抑制率进行评价。靶细胞使用了使人GPC3在SK-HEP-1细胞株强制表达而确立的 SK_pcal3a 细胞株。将 SK_pcal3a 从培养皿上剥离，在 E_Plate96 (Roche Diagnostics社)检测板接种I X IO4细胞/well (100 μ L/well)，然后使用xCELLigence实时细胞分析仪开始进行活细胞的测定。第二天从xCELLigence实时细胞分析仪中取出检测板，向该检测板添加了制备成各浓度(0.004,0.04,0.4、4nM)的各抗体50 μ L。在室温下反应15分钟后，加入(5-1)中制备的人PBMC溶液50 μ L (2 X IO5细胞/well)，通过将该检测板再次放入xCELLigence实时细胞分析仪中，开始进行活细胞的测定。反应在5%二氧化碳气体、37°C的条件下进行，由人PBMC添加72小时后的Cell Index值，通过下式求出细胞增殖抑制率(% )。另外，用于计算的Cell Index值使用了使刚刚添加抗体前的Cell Index值为I而标准化后的数值。
[0491]细胞增殖抑制率)= (A-B) X 100/(A-1)
[0492]A表示未添加抗体的孔中的Cell Index值的平均值(仅为靶细胞和人PBMC)，B表示各孔中的Cell Index值的平均值。试验以一式三份来进行。
[0493]在将由人血液制备的PBMC(Peripheral Blood Mononuclear Cell)作为效应细胞测定GPC3BiTE、GPC3ERY2和IgG型GPC3抗体的细胞毒活性时，GPC3BiTE显示出极强的活性(图1)。该活性是远比低岩藻糖型抗GPC3抗体强的活性，因此认为GPC3BiTE可以成为超越IgG型抗体的优异的癌治疗药。另一方面，虽然GPC3ERY2可见高于IgG型抗GPC3抗体的活性，但是未及GPC3BiTE的活性。由此认为只将Fe附加到BiTE不能够创制目标分子。
[0494]〔实施例2〕GPC3ERY5、GPC3ERY6、GPC3ERY7 的制作和研究
[0495]接着，将癌抗原(GPC3)的结合结构域制成2价，通过进一步提高对癌细胞的结合活性来尝试提高比活性。分别制作了在GPC3ERY2上进一步附加有另一个对抗GPC3的scFv的型的GPC3ERY5(图17D)，将附加的对抗GPC3的结合结构域不设为scFv而设为Fab的型的GPC3ERY7(图17F)。另外，还制作了将GPC3ERY5的对抗CD3印silon的scFv分离为两臂的型的 GPC3ERY6 (图 17E)。
[0496]S卩，通过使用与上述方法同样的附加有适当序列的引物的PCR法等的本领域公知的方法，制作了插入有多核苷酸的一系列的表达载体，所述多核苷酸分别编码GPC3ERY5_Hh、GPC3ERY6_Hk、GPC3ERY6_H`h、GPC3ERY7_Hh、GPC3ERY7_L。
[0497]以下所示组合的表达载体被导入到FreeStyle293-F细胞，使各目标分子瞬时表达。[0498]A.目标分子:GPC3ERY5
[0499]由插入有表达载体的多核苷酸所编码的多肽:GPC3ERY5_Hh(SEQ ID N0:36，作为信号序列的氨基末端19氨基酸不包含在成熟序列中)、GPC3ERY2_Hk。
[0500]B.目标分子:GPC3ERY6
[0501]由插入有表达载体的多核苷酸所编码的多肽:GPC3ERY6_Hk(SEQ ID N0:37，作为信号序列的氨基末端19氨基酸不包含在成熟序列中)、GPC3ERY6_Hh(SEQ ID NO:38，作为信号序列的氨基末端19氨基酸不包含在成熟序列中)。
[0502]C.目标分子:GPC3ERY7
[0503]由插入有表达载体的多核苷酸所编码的多肽:GPC3ERY7_Hh(SEQ ID N0:39，作为信号序列的氨基末端19氨基酸不包含在成熟序列中)、GPC3ERY7_L(SEQ ID NO -A0,作为信号序列的氨基末端19氨基酸不包含在成熟序列中)、GPC3ERY2_Hk。
[0504]所得培养上清被添加到抗FLAG M2柱(Sigma社)，洗漆该柱后,进行了用0.lmg/mLFLAG肽(Sigma社)的洗脱。包含目标分子的组分被添加到HisTrap HP柱(GE Healthcare社)，洗涤该柱后，实施了用咪唑的浓度梯度的洗脱。包含目标分子的组分通过超滤膜浓缩后，该组分被添加到Superdex200柱(GE Healthcare社)，通过仅回收洗脱液的单体组分，获得了得以纯化的各目标分子。
[0505]进行了这些多肽缔合体与GPC3BiTE的细胞毒活性的比较。其结果，明确了这些多肽缔合体的细胞毒活性均达不到GPC3BiTE的活性(图2?4)。由此认为，仅为在BiTE的结构或模拟其的结构上附加Fe、且 对癌抗原呈2价结合的构成时不能够创制目标分子。
[0506]〔实施例3〕GPC3ERY8-2、GPC3ERY9-1、GPC3ERY10-1 的制作和研究
[0507](1)GPC3ERY8-2、GPC3ERY9-1、GPC3ERY10-1 的制作
[0508]接着，尝试了不具有BiTE的结构而具有目标活性的分子的创制。制作了以对抗癌抗原(GPC3)的IgG为基本骨架，在其上附加对抗⑶3印silon的s cFv的型的分子。此时，对于作为基本骨架的IgG的Fe，与上述的情况同样，使用了 FcgR (Fcy受体)的结合性得以减弱的沉默型Fe。分别制作了对抗CD3印silon的scFv附加于抗GPC3抗体IgG的H链的N末的GPC3ERY8-2 (图17G)、附加于H链的C末的GPC3ERY10-1 (图171)、附加于L链的C末的 GPC3ERY9-1 (图 17H)。
[0509]S卩，通过使用与上述方法同样的附加有适当序列的引物的PCR法等的本领域公知的方法，制作了插入有多核苷酸的一系列的表达载体，所述多核苷酸分别编码GPC3ERY8-2_Hk(SEQ ID NO:41，作为信号序列的氨基末端19氨基酸不包含在成熟序列中)、GPC3ERY8-2_Hh(SEQ ID NO:42，作为信号序列的氨基末端19氨基酸不包含在成熟序列中)、GPC3ERY9-1_H(SEQ ID NO:43，作为信号序列的氨基末端19氨基酸不包含在成熟序列中)、GPC3ERY9-l_L-His(SEQ ID NO:44，作为信号序列的氨基末端19氨基酸不包含在成熟序列中)、GPC3ERY9-1_L-FLAG(SEQ ID NO:45，作为信号序列的氨基末端19氨基酸不包含在成熟序列中)、GPC3ERY10-l_Hh(SEQ ID NO:46，作为信号序列的氨基末端19氨基酸不包含在成熟序列中)。
[0510]以下所示组合的表达载体被导入到FreeStyle293-F细胞，使各目标分子瞬时表达。
[0511]D.目标分子:GPC3ERY8-2[0512]由插入有表达载体的多核苷酸所编码的多肽:GPC3ERY8-2_Hk(SEQ ID N0:41，作为信号序列的氨基末端19氨基酸不包含在成熟序列中)、GPC3ERY8-2_Hh(SEQ ID NO:42，作为信号序列的氨基末端19氨基酸不包含在成熟序列中)、GPC3ERY7_L。
[0513]E.目标分子:GPC3ERY9-1
[0514]由插入有表达载体的多核苷酸所编码的多肽:GPC3ERY9-1_H(SEQ ID N0:43，作为信号序列的氨基末端19氨基酸不包含在成熟序列中)、GPC3ERY9-1_L-His (SEQ ID NO:44，作为信号序列的氨基末端19氨基酸不包含在成熟序列中)、GPC3ERY9-1_L-FLAG(SEQ IDNO:45，作为信号序列的氨基末端19氨基酸不包含在成熟序列中)。
[0515]F.目标分子:GPC3ERY10-1
[0516]由插入有表达载体的多核苷酸所编码的多肽GPC3ERY10-l_Hh(SEQ ID N0:46，作为信号序列的氨基末端19氨基酸不包含在成熟序列中)、GPC3ERY8-2_Hk、GPC3ERY7_L。
[0517]所得培养 上清被添加到抗FLAG M2柱(Sigma社)，洗漆该柱后，实施了用0.lmg/mLFLAG肽(Sigma社)的洗脱。包含目标分子的组分被添加到HisTrap HP柱(GE Healthcare社)，洗涤该柱后，实施了用咪唑的浓度梯度的洗脱。包含目标分子的组分通过超滤浓缩后，该组分被添加到Superdex200柱(GE Healthcare社),通过仅回收洗脱液的单体组分,获得了得以纯化的各目标分子。
[0518]对于这些分子研究体外的细胞毒活性时，明确了所有分子均显示出与GPC3BiTE同等以上的细胞毒活性(图5)。特别是GPC3ERY9-1、GPC3ERY10-1明显观察到高于GPC3B i TE的细胞毒活性。在本发明中，首次明确了在对抗癌抗原的I gG上附加对抗⑶3印silon的scFv的分子中，也具有与BiTE同等以上的细胞毒活性。特别是在GPC3ERY9-1、GPC3ERY10-1这样的癌抗原-结合结构域与CD3印silon-结合结构域的距离较大的分子中，可见明显比BiTE强的细胞毒活性，这是意想不到的结果。
[0519](2)评价 GPC3ERY8-2 和 GPC3ERY10-1 的体内药效:
[0520]对(I)中记载的在体外分析中观察到与GPC3BiTE同等以上的细胞毒活性的GPC3ERY8-2和GPC3ERY10-1的体内的药效进行了评价。使作为表达GPC3的人肺癌细胞株的PC-1O与人PBMC混合，移植到NOD scid小鼠。对于该小鼠进行了给予GPC3ERY8-2或者GPC3ERY10-1的治疗(被称为预混(pre-mix)模型)。
[0521]S卩，在GPC3ERY8-2的PC-10预混模型的药效试验中，实施了如下述的试验。从由采自健康人志愿者的血液分离的PBMC中，使用Q)56MicroBeads, human(MCAS Miltenyibiotec社)除去了 NK细胞。使人肺扁平上皮癌细胞株PC-10 (免疫生物研究所)5X IO6细胞与除去了 NK细胞的人PBMC4.5X IO6细胞、和Matrigel Basement Membrane Matrix(基底膜基质)(BD社)混合，移植到NOD scid小鼠(日本CLEA、雌、7W)的腹股沟区的皮下。将移植日设为第O天。对于小鼠则在移植前一天使抗脱唾液酸GMl抗体(和光纯药)以0.2mg/只给予到腹腔内。移植2小时后使GPC ERY8-2以30 μ g/只腹腔内给予。GPC ERY8-2的给予在第O?4天之间进行了共5次。
[0522]另外，在GPC3ERY10-1的PC-10预混模型的药效试验中，实施了如下述的试验。从由采自健康人志愿者的血液分离的PBMC中，使用Q)56MicroBeads, human (MACS Miltenyibiotec社)除去了 NK细胞。使人肺扁平上皮癌细胞株PC-10 (免疫生物研究所)5X IO6细胞与除去了 NK 细胞的人 PBMC4.5X IO6 细胞、和 Matrigel Basement Membrane Matrix(BD社)混合，移植到NOD scid小鼠(日本CLEA、雌、7W)的腹股沟区的皮下。将移植日设为第O天。对于小鼠则在移植前一天使抗脱唾液酸GMl抗体(和光纯药)以0.2mg/只给予到腹腔内。移植2小时后使GPC ERYlO-1以30 μ g/只腹腔内给予。GPC ERY10-1的给予在第O?4天、第7?11天、第14?16天之间共进行了 13次。
[0523]其结果，明确了在GPC3ERY8-2或者GPC3ERY10-1给予组中，与作为对照的溶媒(PBS)给予组相比较，肿瘤的增殖明显得到抑制(图6和7)。
[0524]另外，在其他模型中也对GPC3ERY10-1的体内药效进行了评价。即，向确认到由移植的PC-?ο形成肿瘤的NOD scid小鼠中，移入了通过在体外培养人PBMC而增殖的T细胞。进行了对于该小鼠给予GPC3ERY10-1的治疗(被称为T细胞移入模型)。
[0525]S卩，在GPC3ERY10-1的PC-10T细胞移入模型的药效试验中，进行了如下述的试验。使用由采自健康人志愿者的血液分离的PBMC和T cell activation/expansion kit/human (MACS Miltenyi biotec社)进行了 T细胞的扩大培养。使人肺扁平上皮癌细胞株PC-10 (免疫生物研究所)I X IO7 细胞与 Matrigel Basement Membrane Matrix (BD 社)混合，移植到NOD scid小鼠(日本CLEA、雌、7W)的腹股沟区的皮下。移植日设为第O天。对于小鼠则在移植前一天、和第6、8、12、16、20天使抗脱唾液酸GMl抗体(和光纯药)以0.2mg/只给予到腹腔内。在移植后第6天按照肿瘤大小和体重进行分组后，使通过上述扩大培养获得的T细胞以IXlO7细胞/只移植到腹腔内。在移植的2小时后，使GPC ERY10-1以30yg/只腹腔内给予。GPC ERY10-1的给予在第7、8、12、16、17天进行了共5次。
[0526]其结果，在该模型中也观察到在GPC3ERY10-1给予组中与溶媒给予组相比具有明显的抗肿瘤作用(图8)。
[0527]由此显示出，将以具有沉默型Fe的IgG为基本骨架，在其上附加一个对抗CD3epsilon的抗体的scFv的型的一系列的分子在体内发挥明显的抗肿瘤效果。
[0528](3)血浆中滞留性的评价
[0529]为了验证 GPC3ERY8-2、GPC3ERY9-1、GPC3ERY10-1 等的一系列的分子与 GPC3BiTE相比较是否具有显著长的血浆中半衰期，经时性地测定了对于未移植癌细胞的NOD scid小鼠以30 μ g/只给予的GPC3ERY9-1、GPC3ERY10-1的血浆中浓度。
[0530]即，实施了如下述的PK分析试验。使GPC3ERY9-1、GPC3ERY10-1以30 μ g/只给予到NOD scid小鼠(日本CLEA、雌、8W)的腹腔内。给予后，在15分钟、2小时、I天、2天、7天的各时间点使用血细胞比容毛细管(Temmo)由小鼠的颊静脉进行采血，制备了其血浆。
[0531]向表达GPC3 的 Ba/F3 细胞(GPC3/BaF)和表达人 CD3印si1n 的 Ba/F3 细胞(CD3/BaF)中加入适当稀释的 GPC3ERY9-1、GPC3ERY10-1,使 GPC3ERY9-1 或 GPC3ERY10-1、与GPC3/BaF或⑶3/BaF进行反应。洗涤这些细胞后，加入了 FITC标记的2次抗体，使该二次抗体进一步反应。洗漆该细胞后，利用Epics XL流式细胞仪(Beckman coulter社)测定了标记于该细胞上的荧光强度，制作了对于各抗体的标准曲线。
[0532]从由给予了 GPC3ERY9-1、GPC3ERY10-1的小鼠经时性采取的血液制备的血浆被适当稀释。与上述的标准曲线制作的情况下同样地使该血浆与GPC3/BaF、CD3/BaF进行反应，测定了存在于血浆中的GPC3ERY9-1和GPC3ERY10-1与各细胞的结合量。使用测定的值和上述的标准曲线，算出了血浆中的各抗体浓度。
[0533]其结果，明确了 GPC3ERY9-1和GPC3ERY10-1在给予2天后均维持着IOnM以上的血中浓度(图9和10)。该结果显示出，GPC3ERY9-1和GPC3ERY10-1等的一系列的分子的血浆中半衰期与BiTE相比得到显著改善。
[0534](4)在癌抗原非依赖性细胞因子诱导中沉默Fe的效果
[0535](4-1)具有 FcgR 结合型 Fe 的 GPC3ERY15-1 的制作
[0536]为了验证GPC3ERY8-2、GPC3ERY9-1、GPC3ERY10-1等的一系列的分子是否引起癌抗原非依赖性的细胞因子的诱导，制作了具有FcgR结合型Fe的GPC3ERY15-1 (图17J)。
[0537]S卩，通过使用与上述方法同样的附加有适当序列的引物的PCR法和使用QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene 社)的方法等的本领域公知的方法，制作了插入有多核苷酸的表达载体，所述多核苷酸分别编码GPC3ERY15-l_Hh(SEQ IDNO:47，作为信号序列的氨基末端19氨基酸不包含在成熟序列中)、GPC3ERY15-l_Hk(SEQID NO:48，作为信号序列的氨基末端19氨基酸不包含在成熟序列中)。
[0538]GPC3ERY15-l_Hh(SEQ ID NO:47，作为信号序列的氨基末端19氨基酸不包含在成熟序列中)、GPC3ERY15-l_Hk(SEQ ID NO:48，作为信号序列的氨基末端19氨基酸不包含在成熟序列中)、和GPC3ERY7_L的表达载体一起被导入到FreeStyle293-F细胞，使GPC3ERY15-1瞬时表达。所得培养上清被添加到抗FLAG M2柱(Sigma社)，洗涤该柱后，实施了用0.lmg/mL FLAG肽(Sigma社)的洗脱。包含GPC3ERY15-1的组分被添加到HisTrap HP柱(GE Healthcare社)，洗涤该柱后，实施了用咪唑的浓度梯度的洗脱。包含GPC3ERY15-1的组分通过超滤浓缩后，该组分被添加到Superdex200柱(GE Healthcare社),通过仅回收洗脱液的单体的GPC3ERY15-1组分，获得了纯化GPC3ERY15-1。
[0539](4-2)癌抗原非依赖性的细胞因子诱导能的测定
[0540]GPC3ERY15-1的癌抗原非依赖性的细胞因子诱导能与GPC3BiTE、GPC3ERY9-1、GPC3ERY10-1、和卡妥索单抗的 癌抗原非依赖性的细胞因子诱导能进行了比较。通过上述的方法，由采自健康人志愿者的血液制备了 PBMC。向人PBMC溶液50 μ L(2X IO5细胞/孔)中，添加了制备成40nM的各抗体50 μ L，并且加入了 100 μ L的10% FBS/D-MEM。反应液在5%二氧化碳气体、37°C条件下得以培养。培养72小时后，回收培养上清，通过使用HumanThl/Th2/Thl7Kit (BD 社)的 Cytometric Beads Array (CBA)法,对分泌到培养上清中的细胞因子进行了定量。按照附加规程(添附7 口卜-一>)的测定方法的试验以一式三份来进行。
[0541]其结果，在具有FcgR结合型Fe的GPC3ERY15-1、卡妥索单抗中观察到了明显的细胞因子诱导，相对于此，在不具有Fe的GPC3BiTE、和具有沉默型Fe的GPC3ERY9-1、GPC3ERY10-1中未观察到细胞因子诱导(图11)。由此认为，具有沉默型Fe的GPC3ERY8-2、GPC3ERY9-UGPC3ERY10-1等的一系列的分子不引起癌抗原非依赖性的细胞因子诱导，是具有非常高的安全性的分子。
[0542]〔实施例4〕GPC3ERY18L1、L2、L3、L4、SI 的制作和研究
[0543]对具有与scFv结构不同的CD3结合结构域的分子进行了研究。制作了在对抗癌抗原(GPC3)的IgG的两条H链的C末端分别结合有CD3抗体的VH区、VL区的分子型即GPC3ERY18(图17K)。此时，制作了将间隔处的接头(Gly.Gly.Gly.Gly.Ser)的个数改变为I个?4个的一系列的分子(GPC3ERY18L1?L4)。另外，还同时制作了将适当部位的氨基酸取代为Cys而使导入二硫键成为可能的分子(GPC3ERY18S1)。[0544]S卩，通过使用与上述方法同样的附加有适当序列的引物的PCR法等的本领域公知的方法，制作了插入有多核苷酸的一系列的表达载体，所述多核苷酸分别编码GPC3ERY18Ll_Hh(SEQ ID NO:49，作为信号序列的氨基末端19氨基酸不包含在成熟序列中)、GPC3ERY18Ll_Hk(SEQ ID NO:50，作为信号序列的氨基末端19氨基酸不包含在成熟序列中)、GPC3ERY18L2_Hh(SEQ ID NO:51，作为信号序列的氨基末端19氨基酸不包含在成熟序列中)、GPC3ERY18L2_Hk(SEQ ID NO:52，作为信号序列的氨基末端19氨基酸不包含在成熟序列中)、GPC3ERY18L3_Hh(SEQ ID NO:53，作为信号序列的氨基末端19氨基酸不包含在成熟序列中)、GPC3ERY18L3_Hk(SEQ ID NO:54，作为信号序列的氨基末端19氨基酸不包含在成熟序列中)、GPC3ERY18L4_Hh(SEQ ID NO:55，作为信号序列的氨基末端19氨基酸不包含在成熟序列中)、GPC3ERY18L4_Hk(SEQ ID NO:56，作为信号序列的氨基末端19氨基酸不包含在成熟序列中)、GPC3ERY18Sl_Hh(SEQ ID NO:57，作为信号序列的氨基末端19氨基酸不包含在成熟序列中)、GPC3ERY18Sl_Hk(SEQ ID NO:58，作为信号序列的氨基末端19氨基酸不包含在成熟序列中)。
[0545]以下所示组合的表达载体被导入到FreeStyle293-F细胞，使各目标分子瞬时表达。
[0546]G.目标分子:GPC3ERY18L1
[0547]表达载体:GPC3ERY18Ll_Hh(SEQ ID NO:49，作为信号序列的氨基末端19氨基酸不包含在成熟序列中)、GPC3ERY18Ll_Hk(SEQ ID NO:50，作为信号序列的氨基末端19氨基酸不包含在成熟序列中)、和GPC3ERY7L。
[0548]H.目标分子:GPC3ERY18L2
[0549]表达载体:GPC3ERY18L2_Hh(SEQ ID NO:51，作为信号序列的氨基末端19氨基酸不包含在成熟序列中)、GPC3ERY18L2_Hk(SEQ ID NO:52，作为信号序列的氨基末端19氨基酸不包含在成熟序列中 ) 、和GPC3ERY7L。
[0550]1.目标分子:GPC3ERY18L3
[0551]表达载体:GPC3ERY18L3_Hh(SEQ ID NO:53，作为信号序列的氨基末端19氨基酸不包含在成熟序列中)、GPC3ERY18L3_Hk(SEQ ID NO:54，作为信号序列的氨基末端19氨基酸不包含在成熟序列中)、和GPC3ERY7L。
[0552]J.目标分子:GPC3ERY18L4
[0553]表达载体:GPC3ERY18L4_Hh(SEQ ID NO:55，作为信号序列的氨基末端19氨基酸不包含在成熟序列中)、GPC3ERY18L4_Hk(SEQ ID NO:56，作为信号序列的氨基末端19氨基酸不包含在成熟序列中)、和GPC3ERY7L。
[0554]K.目标分子:GPC3ERY18S1
[0555]表达载体:GPC3ERY18Sl_Hh(SEQ ID NO:57，作为信号序列的氨基末端19氨基酸不包含在成熟序列中)、GPC3ERY18Sl_Hk(SEQ ID NO:58，作为信号序列的氨基末端19氨基酸不包含在成熟序列中)、和GPC3ERY7L。
[0556]所得培养上清被添加到抗FLAG M2柱(Sigma社)，洗漆该柱后，实施了用0.lmg/mLFLAG肽(Sigma社)的洗脱。包含目标分子的组分被添加到HisTrap HP柱(GE Healthcare社)，洗涤该柱后，实施了用咪唑的浓度梯度的洗脱。包含目标分子的组分通过超滤浓缩后，该组分被添加到Superdex200柱(GE Healthcare社),通过仅回收洗脱液的单体组分,获得了得以纯化的各目标分子。
[0557]对GPC3ERY18L1、GPC3ERY18L2、GPC3ERY18L3、GPC3ERY18L4、GPC3ERY18S1 的各分子评价了体外的细胞毒活性(图12和13)。其结果发现了:除了 GPC3ERY18L1外的各分子也均与GPC3ERY10-1具有同等的活性。显示出具有非scFv结构的分子具有同等的细胞毒活性。期待在对抗癌抗原(GPC3)的IgG的两条H链的C末端上分别结合有CD3抗体的VH区、VL区的结构对于本申请发明涉及的多肽缔合体分子的安定化的贡献。
[0558]〔实施例5〕GPC3ERY19-3的制作和研究
[0559]接着,对CD3结合结构域为Fab样结构的分子进行了研究。制作了在对抗癌抗原(GPC3)的IgG抗体的两条H链的C末端上分别结合有⑶3抗体的VH区与CHl区、和VL区与CL区的分子型即GPC3ERY19-3(图17L)。即，通过使用与上述方法同样的附加有适当序列的引物的PCR法等的本领域公知的方法，制作了插入有多核苷酸的表达载体，所述多核苷酸分别编码GPC3ERY19-3_Hh(SEQ ID NO:59，作为信号序列的氨基末端19氨基酸不包含在成熟序列中)、GPC3ERY19-3_Hk(SEQ ID NO:60，作为信号序列的氨基末端19氨基酸不包含在成熟序列中)。
[0560]GPC3ERY19-3_Hh(SEQ ID NO:59，作为信号序列的氨基末端19氨基酸不包含在成熟序列中)、GPC3ERY19-3_Hk(SEQ ID NO:60，作为信号序列的氨基末端19氨基酸不包含在成熟序列中)、和GPC3ERY7_L的表达载体一起被导入到FreeStyle293-F细胞，使GPC3ERY19-3瞬时表达。所得培养上清被添加到HiTrap rProtein A FF柱(GE Healthcare社)，洗涤该柱后，实施了用酸的洗脱。包含GPC3ERY19-3的组分通过超滤浓缩后，该组分被添加到Superdex200柱(GEHealthcare社),通过仅回收洗脱液的单体的GPC3ERY19-3组分，获得了纯化GPC3ERY19-3。
[0561]评价了 GPC3ERY19-3分子的体外的细胞毒活性。其结果显示出与GPC3BiTE具有同等的活性(图14)。期待具有Fab样结构的CD3结合结构域对于本申请发明涉及的多肽缔合体分子的安定化的贡献 。
[0562]〔实施例6〕通过向GPC3ERY10-1的CH3结构域导入突变仅使用蛋白A纯化步骤来制备多肽缔合体
[0563](I)概要
[0564]在实施例3制备的GPC3ERY10-1中，作为CH3结构域的结构使用了knobs-1nto-hole。在各自的H链的C末端附加有His标签和FLAG标签，通过进行使用这些标签的两种亲和纯化，纯化了作为目标的两种H链异种缔合化的GPC3ERY10-1分子。将GPC3ERY10-1分子作为药物制备的情况下，从表达GPC3ERY10-1的细胞的培养上清，使用蛋白A层析，首先纯化具有Fe结构域的多肽缔合体。并且，使用His标签亲和层析和FLAG标签亲和层析的两种层析的纯化步骤是必要的，存在纯化步骤的成本变高的问题。因此，在本实施例中，通过不使用His标签和FLAG标签、仅使用蛋白A层析来使作为目标的两种H链异种缔合化的GPC3ERY10-1分子纯化成为可能的分子修饰进行了研究。
[0565]具体而言，对两种H链中的一种H链丧失与蛋白A结合的修饰进行了研究。通过该修饰，丧失与蛋白A结合的H链同源缔合化的分子，因不能够与蛋白A结合，因此流过蛋白A层析。另一方面，认为通过利用丧失与蛋白A结合的H链和维持与蛋白A结合的H链异种缔合化的分子、和维持与蛋白A结合的H链同源缔合化的分子对蛋白A的结合性的差异，利用蛋白A层析可以分离这些分子。此时，在抗体的Fe结构域中，蛋白A与对抗体的血浆中滞留性起重要作用的FcRn相结合的部位发生重复，因此有必要在维持与FcRn的结合性的同时，仅选择性地降低与蛋白A的结合性。作为这样的修饰，发现了将EU编号435番目的His取代为Arg的突变。除了该突变外，作为促进两种H链的异种缔合化的修饰，还通过组合W02006/106905记载的突变(一个H链的EU编号356番目的Asp取代为Lys、另一个H链的EU编号439番目的Lys取代为Glu)，验证了是否可以仅用蛋白A层析来纯化GPC3ERY10-1等的多肽缔合体分子。
[0566](2)抗体基因表达载体的制作和各抗体的表达
[0567]作为抗体H链可变区，编码GC33(2)H(抗人Glypican-3抗体H链可变区、SEQ IDNO:61，作为信号序列的氨基末端19氨基酸不包含在成熟序列中)的基因通过本领域公知的方法来制作。同样，作为抗体L链，编码GC33-kO (抗人Glypican-3抗体L链，SEQ ID NO:62，作为信号序列的氨基末端19氨基酸不包含在成熟序列中)的基因通过本领域公知的方法来制作。接着，作为抗体H链恒定区，以下所示的基因通过本领域公知的方法来制作。
[0568]L 目标分子:LALA-Gld
[0569]IgGl的序列中导入了 EU编号234番目和235番目的Leu取代为Ala、297番目的Asn取代为Ala的突变，且除去了 C末端的Gly和Lys而成的LALA-Gld (SEQ ID NO:63，作为信号序列的氨基末端19氨基酸不包含在 成熟序列中)。
[0570]M.目标分子:LALA-Gld-CD3
[0571]使⑶3的scFv (抗人⑶3抗体H链可变区与抗人⑶3抗体L链可变区经由多肽接头结合所得)与LALA-Gld(SEQ ID NO:63，作为信号序列的氨基末端19氨基酸不包含在成熟序列中)的C末端结合而成的LALA-Gld-⑶3 (SEQ ID NO:64，作为信号序列的氨基末端19氨基酸不包含在成熟序列中)。
[0572]N.目标分子:LALA-G3S3E_Gld
[0573]LALA-Gld(SEQ ID NO:63，作为信号序列的氨基末端19氨基酸不包含在成熟序列中)的序列中导入EU编号435番目的His取代为Arg的突变和EU编号439番目的Lys取代为Glu的突变而成的LALA-G3S3E-Gld(SEQ ID NO:65，作为信号序列的氨基末端19氨基酸不包含在成熟序列中)。
[0574]0.目标分子:LALA-S3K-Gld_CD3
[0575]LALA-Gld-CD3 (SEQ ID NO:64,作为信号序列的氨基末端19氨基酸不包含在成熟序列中)的序列中导入EU编号356番目的Asp取代为Lys的突变而成的LALA-S3K-Gld-CD3(SEQ ID NO:66，作为信号序列的氨基末端19氨基酸不包含在成熟序列中)。
[0576]通过在GC33⑵H的下游连接LALA-Gld_CD3或者LALA-Gld，制作了抗人GPC3抗体H链基因NTAlL或者NTA1R。通过在GC33(2)H的下游连接LALA-S3K_Gld-⑶3或者LALA-G3S3E-Gld,制作了抗人GPC3抗体H链基因NTA2L或者NTA2R。
[0577]通过将NTA1L、NTA1R、NTA2L、NTA2R(H链)和GC33_kO (L链)的各基因插入到动物细胞表达载体，制作了该基因的表达载体。利用以下所示的组合，这些载体通过本领域公知的方法导入到FreeStyle293细胞(invitrogen社)，从而使下述所示的各多肽缔合体瞬时表达。如下所不，将导入的基因的组合以第一 H链/第二 H链/L链的顺序表不，由此表记为多肽缔合体的名称，
[0578]NTAlL/NTAlR/GC33-kO ；
[0579]NTA2L/NTA2R/GC33_kO。
[0580](3)表达样本的纯化和异种缔合体形成的评价
[0581]包含下述所示的多肽缔合体的FreeStyle293细胞的培养上清(以下被称为CM)作为试料得以使用，
[0582]NTAlL/NTAlR/GC33-kO ；
[0583]NTA2L/NTA2R/GC33-k0o
[0584]在用D-PB S进行平衡化的rProtein A Sepharose Fast Flow柱(GE Healthcare)上负荷用φ0.22μιη过滤器过滤的CM，利用表I所示的缓冲液实施了洗涤1、2、和洗脱I的各步骤。调节CM的负荷量使负荷的抗体量为20mg/mL resine。被分取的洗脱组分通过尺寸排阻层析分析，鉴定了洗脱组分中所含的成分。
[0585][表 I]
[0586]
【权利要求】
1.多肽缔合体，其包含下述的结构域: (1)抗原结合结构域； (2)含有Fe区的结构域，其中，该Fe区为FeY受体-结合活性降低的Fe区；和 (3)T细胞受体复合体结合结构域。
2.权利要求1所述的多肽缔合体，其中，T细胞受体复合体结合结构域为T细胞受体结合结构域。
3.权利要求1所述的多肽缔合体，其中，T细胞受体复合体结合结构域为CD3结合结构域。
4.权利要求1?3中任一项所述的多肽缔合体，其中，抗原结合结构域为二价的抗原结合结构域。
5.权利要求4所述的多肽缔合体，其中，二价的抗原结合结构域为具有F(ab' )2结构的结构域。
6.权利要求5所述的多肽缔合体，其中，构成具有F(ab' )2结构的结构域的重链恒定区的两个多肽与构成Fe区的两个多肽分别相连接。
7.权利要求6所述的多肽缔合体，其中，CD3结合结构域与构成Fe区的一个或两个的CH3相连接。
8.权利要求7所述的多肽缔合体，其中，构成CD3结合结构域的重链Fv片段与构成Fe区的一个CH3相连接，构成⑶3结合结构域的轻链Fv片段与构成Fe区的另一个CH3相连接。
9.权利要求8所述的多肽缔合体，其中，构成CD3结合结构域的重链Fv片段上连接有抗体的CHl结构域、和轻链Fv片段上连接有抗体的CL结构域。
10.权利要求6所述的多肽缔合体，其中，CD3结合结构域与构成F(aY)2的一个或两个的CL相连接。
11.权利要求6所述的多肽缔合体，其中，CD3结合结构域与构成F(aV)2的一个或两个的VH相连接。
12.权利要求6所述的多肽缔合体，其中，CD3结合结构域与构成F(aY)2的一个或两个的VL相连接。
13.权利要求1?12中任一项所述的多肽缔合体，其中，⑶3结合结构域为Fv。
14.权利要求1?7和10?12中任一项所述的多肽缔合体，其中，⑶3结合结构域为Fab0
15.权利要求1?7和10?12中任一项所述的多肽缔合体，其中，CD3结合结构域为ScFv0
16.权利要求1?15中任一项所述的多肽缔合体，其中，CD3结合结构域为一价。
17.权利要求1?3中任一项所述的多肽缔合体，其中，抗原结合结构域为一价的scFv和一价的Fab。
18.权利要求17所述的多肽缔合体，其中，一价的scFv经由构成CD3结合结构域的scFv与构成Fe区的一个多肽相连接,一价的Fab的重链Fv片段经由CHl区与构成Fe区的一个多肽相连接，该Fab的轻链Fv片段与CL区相连接。
19.权利要求1?3中任一项所述的多肽缔合体，其中，抗原结合结构域为二价的scFvo
20.权利要求19所述的多肽缔合体，其中，一价的scFv经由构成⑶3结合结构域的重链Fv片段与构成Fe区的一个多肽相连接,另一个一价的scFv经由构成⑶3结合结构域的轻链Fv片段与构成Fe区的另一个多肽相连接。
21.权利要求19所述的多肽缔合体，其中，一价的scFv经由构成CD3结合结构域的scFv与构成Fe区的一个多肽相连接,另一个一价的scFv与构成Fe区的另一个多肽相连接。
22.权利要求1?3中任一项所述的多肽缔合体，其中，抗原结合结构域和T细胞受体复合体结合结构域分别为一价的Fab。
23.权利要求22所述的多肽缔合体，其中，构成抗原结合结构域的一价的Fab的重链Fv片段经由CHl区与构成Fe区的一个多肽相连接，该Fab的轻链Fv片段与CL区相连接；构成T细胞受体结合结构域的Fab的重链Fv片段经由CHl区与构成Fe区的另一个多肽相连接，该Fab的轻链Fv片段与CL区相连接。
24.权利要求22所述的多肽缔合体，其中，构成抗原结合结构域的一价的Fab的重链Fv片段经由CHl区与构成Fe区的一个多肽相连接，该Fab的轻链Fv片段与CL区相连接；构成T细胞受体结合结构域的Fab的轻链Fv片段经由CHl区与构成Fe区的另一个多肽相连接，该Fab的重链Fv片段与CL区相连接。
25.权利要求22所述的多肽缔合体，其中，构成抗原结合结构域的一价的Fab的重链Fv片段经由CHl区与构成Fe区的一个多肽相连接，该Fab的轻链Fv片段与CL区相连接；构成T细胞受体结合结构域的Fab的重链Fv片段经由CL区与构成Fe区的另一个多肽相连接，该Fab的轻链Fv片段与CHl区相连接。
26.权利要求22所述的多肽缔合体，其中，构成T细胞受体结合结构域的一价的Fab的重链Fv片段经由CHl区与构成Fe区的一个多肽相连接，该Fab的轻链Fv片段与CL区相连接；构成抗原结合结构域的Fab的轻链Fv片段经由CHl区与构成Fe区的另一个多肽相连接，该Fab的重链Fv片段与CL区相连接。
27.权利要求22所述的多肽缔合体，其中，构成T细胞受体结合结构域的一价的Fab的重链Fv片段经由CHl区与构成Fe区的一个多肽相连接，该Fab的轻链Fv片段与CL区相连接；构成抗原结合结构域的Fab的重链Fv片段经由CL区与构成Fe区的另一个多肽相连接，该Fab的轻链Fv片段与CHl区相连接。
28.权利要求22所述的多肽缔合体，该多肽缔合体包含下述的结构域: (1)抗原结合结构域，其中，结合在抗原上的一价Fab结构的重链Fv片段经由CHl区与上述构成Fe区的一个多肽相连接,该Fab结构的轻链Fv片段与CL区相连接；和 (2)T细胞受体复合体结合结构域，其中，结合在T细胞受体复合体上的一价Fab结构的重链Fv片段经由CHl区与构成Fe区的另一个多肽相连接，该Fab结构的轻链Fv片段与CL区相连接， 并且，控制CHl区和CL区的电荷，使抗原结合结构域中的重链Fv片段与抗原结合结构域中的轻链Fv片段、或T细胞受体结合结构域中的重链Fv片段与T细胞受体结合结构域中的轻链Fv片段相缔合。
29.权利要求28所述的多肽缔合体，其中，连接于T细胞受体复合体结合结构域中的重链Fv片段的CHl区的氨基酸残基和连接于抗原结合结构域中的轻链Fv片段的CL区的氨基酸残基相互具有同种的电荷。
30.权利要求28所述的多肽缔合体，其中，连接于抗原结合结构域中的重链Fv片段的CHl区的氨基酸残基和连接于T细胞受体复合体结合结构域中的轻链Fv片段的CL区的氨基酸残基相互具有同种的电荷。
31.权利要求28所述的多肽缔合体，其中，连接于T细胞受体复合体结合结构域中的重链Fv片段的CHl区的氨基酸残基和连接于抗原结合结构域中的轻链Fv片段的CL区的氨基酸残基相互具有同种的电荷、连接于抗原结合结构域中的重链Fv片段的CHl区的氨基酸残基和连接于T细胞受体复合体结合结构域中的轻链Fv片段的CL区的氨基酸残基相互具有同种的电荷。
32.权利要求29或31所述的多肽缔合体，其中，连接于T细胞受体复合体结合结构域中的重链Fv片段的CHl区的氨基酸残基和连接于T细胞受体结合结构域中的轻链Fv片段的CL区的氨基酸残基相互具有不同种的电荷。
33.权利要求30或31所述的多肽缔合体，其中，连接于抗原结合结构域中的重链Fv片段的CHl区的氨基酸残基与连接于抗原结合结构域中的轻链Fv片段的CL区的氨基酸残基也具有不同种的电荷。
34.权利要求22?33中任一项所述的多肽缔合体，其中，T细胞受体复合体结合结构域为T细胞受体结合结构域。
35.权利要求34所述的多肽缔合体，其中，T细胞受体结合结构域为CD3结合结构域。
36.权利要求32或33所述的多肽缔合体，其中，CHl区的氨基酸残基和CL区的氨基酸残基为选自由以下(a)?(f)所示的I组或2组以上氨基酸残基的组构成的组合: (a)CHl区的氨基 酸残基且EU编号147位的氨基酸残基、和CL区的氨基酸残基且EU编号180位的氨基酸残基； (b)CHl区的氨基酸残基且EU编号147位的氨基酸残基、和CL区的氨基酸残基且EU编号131位的氨基酸残基； (c)CHl区的氨基酸残基且EU编号147位的氨基酸残基、和CL区的氨基酸残基且EU编号164位的氨基酸残基； (d)CHl区的氨基酸残基且EU编号147位的氨基酸残基、和CL区的氨基酸残基且EU编号138位的氨基酸残基； (e)CHl区的氨基酸残基且EU编号147位的氨基酸残基、和CL区的氨基酸残基且EU编号123位的氨基酸残基； (f)CHl区的氨基酸残基且EU编号175位的氨基酸残基、和CL区的氨基酸残基且EU编号160位的氨基酸残基， 并且，CHl区的氨基酸残基和CL区的氨基酸残基为相互具有不同种电荷的氨基酸残基。
37.权利要求36所述的多肽缔合体，其中，进一步选自包含以下的(g)所示氨基酸残基的组的组合: (g)CHl区的氨基酸残基且EU编号213位的氨基酸残基、和CL区的氨基酸残基且EU编号123位的氨基酸残基。
38.权利要求36或37所述的多肽缔合体，其中，上述具有不同种电荷的氨基酸残基为选自以下的(X)或(Y)的任一组合中所含有的氨基酸残基: (X)谷氨酸(E)、天冬氨酸(D)； (Y)赖氨酸(K)、精氨酸(R)、组氨酸(H)。
39.权利要求36?38中任一项所述的多肽缔合体，其中，上述具有不同种电荷的氨基酸残基是=CHl区的氨基酸残基且EU编号175位的氨基酸残基为Lys，CL区的氨基酸残基且EU编号180位、131位和160位的氨基酸残基均为Glu。
40.权利要求36?38中任一项所述的多肽缔合体，其中，上述具有不同种电荷的氨基酸残基是=CHl区的氨基酸残基且EU编号147位和175位的氨基酸残基为Glu，CL区的氨基酸残基且EU编号180位、131位和160位的氨基酸残基均为Lys。
41.权利要求40所述的多肽缔合体，其中，进一步地，CHl区的氨基酸残基且EU编号213位的氨基酸残基为Glu，CL区的氨基酸残基且EU编号123位的氨基酸残基为Lys。
42.权利要求1?41中任一项所述的多肽缔合体，其中，Fe区是对FeY 1、Fe γ IIA、Fe Y IIB、Fe Y IIIA和/或Fe Y IIIB中任一项的Fe Y受体-结合活性降低的Fe区。
43.权利要求1?42中任一项所述的多肽缔合体，其特征在于:Fc区为构成SEQIDNO:23记载的Fe区、SEQ ID NO:24记载的Fe区、SEQ ID NO:25记载的Fe区、或SEQ IDNO:26记载的Fe区的氨基酸发生突变的Fe区。
44.权利要求43所述 的多肽缔合体，其中，Fe区为构成Fe区的氨基酸中按照EU编号特定的下述任一种氨基酸的Fe区: 118位?260位的氨基酸序列为SEQ ID NO:24记载的序列；261位?447位的氨基酸序列为SEQ ID NO:26记载的序列。
45.权利要求43所述的多肽缔合体，其中，Fe区为构成Fe区的氨基酸中按照EU编号特定的下述任一个氨基酸发生突变的Fe区: 220 位、226 位、229 位、231 位、232 位、233 位、234 位、235 位、236 位、237 位、238 位、239位、240 位、264 位、265 位、266 位、267 位、269 位、270 位、295 位、296 位、297 位、298 位、299位、300 位、325 位、327 位、328 位、329 位、330 位、331 位、332 位。
46.权利要求45所述的多肽缔合体，其特征在于:Fc区为构成SEQID NO:23记载的Fe区的氨基酸发生突变的Fe区。
47.权利要求46所述的多肽缔合体，其中，Fe区为构成Fe区的氨基酸中按照EU编号特定的下述任一个氨基酸:即233位、234位、235位、236位、237位、327位、330位、331位在对应的IgG2或IgG4中被其EU编号对应的氨基酸取代的Fe区。
48.权利要求46所述的多肽缔合体，其特征在于:Fc区为构成Fe区的氨基酸中按照EU编号特定的下述任一个氨基酸:即234位、235位、297位发生突变的Fe区。
49.权利要求48所述的多肽缔合体，其特征在于:234位的氨基酸突变为丙氨酸、235位的氨基酸突变为丙氨酸、和/或、297位的氨基酸突变为丙氨酸。
50.权利要求43?49中任一项所述的多肽缔合体，其特征在于:构成Fe区的两个多肽序列相互具有不同的序列。
51.权利要求1?50中任一项所述的多肽缔合体，其特征在于:构成Fe区的两个多肽的一个多肽的氨基酸残基中按照EU编号特定的349位氨基酸突变为半胱氨酸、366位氨基酸突变为色氨酸，另一个多肽的氨基酸残基中按照EU编号特定的356位氨基酸突变为半胱氨酸、366位氨基酸突变为丝氨酸、368位氨基酸突变为丙氨酸、407位氨基酸突变为缬氨酸。
52.权利要求1?50中任一项所述的多肽缔合体，其特征在于:构成Fe区的两个多肽的一个多肽的氨基酸残基中按照EU编号特定的356位氨基酸突变为赖氨酸，另一个多肽的氨基酸残基中按照EU编号特定的439位氨基酸突变为谷氨酸，其中任意一个多肽的氨基酸残基中按照EU编号特定的435位氨基酸突变为精氨酸。
53.权利要求51或52所述的多肽缔合体，其特征在于:存在于构成Fe区的两个多肽的羧基末端的序列GK缺失。
54.权利要求1?53中任一项所述的多肽缔合体，其中，抗原结合结构域在相同的表位μ奸么丄彡口口 O
55.权利要求54所述的多肽缔合体，其中，相同的表位存在于由SEQID NO:2记载的氨基酸序列组成的蛋白质中。
56.权利要求54所述的多肽缔合体，其中，相同的表位存在于由SEQID NO:4记载的氨基酸序列组成的蛋白质中。
57.权利要求1?53中任一项所述的多肽缔合体，其中，抗原结合结构域在相互不同的表位上结合。
58.权利要求57所述的多肽缔合体，其中，不同的表位存在于由SEQID NO:2记载的氨基酸序列组成的蛋白质中。`
59.权利要求57所述的多肽缔合体，其中，不同的表位存在于由SEQID NO:4记载的氨基酸序列组成的蛋白质中。
60.多核苷酸,该多核苷酸编码权利要求1?59中任一项所述的多肽缔合体。
61.载体,该载体包含权利要求60所述的多核苷酸。
62.细胞，该细胞持有权利要求61所述的载体。
63.多肽缔合体的制备方法，该制备方法包含:将权利要求62所述的细胞进行培养，从培养上清中回收多肽缔合体。
64.细胞毒诱导治疗剂，该治疗剂含有权利要求1?59中任一项所述的多肽缔合体作为有效成分。
65.权利要求64所述的治疗剂，其中，细胞毒诱导治疗剂为癌症治疗剂。
66.权利要求65所述的治疗剂,其中，癌症为肝癌或肺癌。
67.癌症的治疗或预防方法，其特征在于:将权利要求1?59中任一项所述的多肽缔合体给予需要治疗的患者。
68.权利要求67所述的治疗或预防方法，其中，癌症为肝癌或肺癌。
【文档编号】C12N1/21GK103429737SQ201180068471
【公开日】2013年12月4日 申请日期:2011年11月30日 优先权日:2010年11月30日
【发明者】根津淳一, 石黑敬弘, 成田敦, 坂本昭久, 川合由美子, 井川智之, 仓持太一 申请人:中外制药株式会社