专利名称：新城疫病毒重组疫苗a-ndv-lx/i4及构建方法
技术领域：
本发明涉及应用反向遗传技术和免疫学技术，产生一种表达基因VII型F和HN重组新城疫弱毒疫苗A-NDV-LX/I4，用于制造疫苗。
背景技术：
反向遗传操作技术(Reverse genetics manipulation technique)是指在体夕卜通过构建RNA病毒的感染性分子克隆，将病毒基因组RNA逆转录成cDNA，在DNA分子水平上对其进行各种体外人工操作，由病毒基因组cDNA和各种辅助蛋白来组装新的RNA病毒的一项研究技术[Neumann G, Whitt M A, Kawaoka Y. Adecade after the generation of a negative-sense RNA virus from cloned cDNA-what have we learned ？ Journal of General Virology, 2002,83 (11) J635-2662.]，也叫全长感染性cDNA克隆技术，又常被称为“病毒拯救”。由于最终“拯救”出的RNA病毒来源于cDNA克隆，因此，可通过中间过程中人为加入的DNA环节，在DNA水平上对RNA病毒基因组进行各种体外人工操作，如进行基因突变、基因敲除(缺失)、基因插入、基因置换和基因互补(即构建嵌合病毒)等改造，解决了对RNA病毒基因组难以操作这一难题，极大地方便了人们进行病毒各基因的功能、致病机理和病毒病防制策略的研究，同时为新型疫苗的研制和开发提供了新的思路[Huang， Ζ. , Elankumaran, S. , Panda, A. & Samal, S. K. Recombinant Newcastle disease virus as a vaccine vector. Poultry Science，2003，82 :899-906. ]。 0 ;) (Newcastle disease virus, NDV)是新城疫(ND)的病原体。ND是鸡的高度接触性传染病，可引起鸡100%发病和死亡。新城疫病毒在分类上属单链负股RNA病毒目(Mononegavirales)， 副黏病毒科(Paramyxoviridae)、副黏病毒亚科(Paramyxovirinae)的禽腮腺炎病毒属 (Avulavirus)的成员。病毒有囊膜，基因组为单股、负链、不分节段的RNA病毒，基因组结构模式为3' -NP-P-M-F-HN-L-5'，依次编码6种结构蛋白核衣壳蛋白(NP)、磷蛋白(P)、 基质蛋白(M)、融合蛋白(F)、血凝素-神经氨酸酶蛋白(HN)和大分子蛋白(L)即核蛋白 (NP)，P，M，F，HN和L蛋白。另外两个蛋白，V和W蛋白由P基因编辑后表达[Alexander JA. Newcastle disease virus and other avian paramyxoviruses. In Swayne, D., Glisson, J. R. , Jackwood, M. W. , Pearson, J. Ε. , Reed, W. M. (Eds. ). A Laboratory Manual for the Isolation and Identification of Avian Pathogens, fourth ed American Association of Avian Pathologists, Kennett Square, PA 1998.]。根据对鸡的毒力，NDV毒株可以为强毒(Velogenic)、中等毒力(mesogenic) 和弱毒(Lentogen)。已开展广泛的试验来阐明病毒致病性的分子决定因素[Huang Z，Krishnamurthy S，Panda A，Samal SK. Newcastle disease virus V protein is associated with viral pathogenesis and functions as an alpha interferon antagonist. Journal of virology，2003，77 (16) :8676-8685.]。大部分研究是关于 F和 HN 蛋白对致病性的作用，研究结果一致认为F蛋白裂解位点处的氨基酸序列是病毒毒力的主要决定因素[Seal BS. Nucleotide and predicted amino acid sequence analysis of thefusion protein and hemagglutinin-neuraminidase protein genes among Newcastle disease virus isolates. Phylogenetic relationships among the Paramyxovirinae based on attachment glycoprotein sequences.Funct Integr Genomics，2004，4(4) 246-257.]。NDV毒力差异的分子基础主要决定于FO蛋白的蛋白酶裂解位点的氨基酸序列，强毒的裂解位点有聚碱性氨基酸序列，其模式基序为112GR/K-R-Q-K/R-R-F117 ；弱毒的裂解位点则缺少聚碱性氨基酸序列，其模式基序为112-E/G-R/K-Q-E/G-R-L117。在感染过程中，NDV HN蛋白首先与敏感细胞表面的唾液酸受体结合，这种结合作用可以引起吸附蛋白HN和融合蛋白F构象发生变化；于是后者的融合肽被释放出来，使病毒的包膜与细 IfiII^^ffi^ [McGinnes, L. W. ， Sergei, Τ. ， Chen, H. ， Hamo, L. ， Schwertz, S. ， Li, D. & Morrison, Τ. G. Mutational Analysis of the Membrane Proximal Heptad Repeat of the Newcastle Disease Virus Fusion Protein. Virology, 2001, 289 :343-352.],强毒 F 蛋白的裂解位点为多个碱性氨基酸连续排列，可被机体多个组织器官的多种蛋白酶裂解， 因此，可导致全身性感染。弱毒株在该区域的碱性氨基酸则被中性氨基酸所代替，使相应序列由 r/k112-r-q-k/r115-r-l117 变为 g/e112-r-q-g/e115-r-l117，这种 f 蛋白前体仅能被有限的组织或器官分泌的胰样蛋白酶裂解，感染性很低或无感染性。因此，F蛋白是NDV毒力和致病性的主要决定因素[Peeters, B. P.，de Leeuw, 0. S.，Koch, G. & Gielkens, A. L. Rescue of Newcastle disease virus from cloned cDNA :Evidence that cleavability of the fusion protein is a major determinant for virulence. Journal of Virology, 1999,73(6) :5001-5009.]。不少研究已经通过反向遗传技术将弱毒株F蛋白裂解位点突变成强毒株的裂解位点而使弱毒株变成了强毒株，这已被这些重组病毒的致病性试验结果所证实；反之亦然。然而关于HN蛋白对毒力的作用的结果还没有定论。在一些试验中，弱毒骨架中插入编码强毒HN蛋白的嵌合体病毒致病性有了明显增加，例如根据MDT 和ICPI指标判断重组病毒的致病性从弱毒增强为中等毒力；而在另一些试验中用相同的试验方法，在弱毒的骨架中置换强毒HN蛋白，但是重组病毒的毒力没有上升[de Leeuw OS, Koch G，Hartog L，Ravenshorst N，Peeters BP. Virulence of Newcastle disease virus is determined by the cleavage site of the fusion protein and by both the stem region and globular head of the haemagglutinin—neuraminidase protein.The Journal of general virology, 2005,86 (Pt 6) : 1759-1769.]。有人认为，弱毒 ND 病毒载体骨架用于构建重组病毒，很难提供合适的表达强毒HN蛋白基因的全部信息[Estevez C， King D，Seal B，Yu Q. Evaluation of Newcastle disease virus chimeras expressing the Hemagglutinin-Neuraminidase protein of velogenic strains in the context of a mesogenic recombinant virus backbone. Virus research，2007，129(2) :182-190.]。
自1拟6年发现新城疫(ND)以来，ND已发生了四次大的流行，而且每一次流行都有不同基因型的毒株出现，尤其是90年代之后出现了新的基因VII型NDV，给我国的养禽业造成了巨大的经济损失。在控制疫病的过程中，使用疫苗是最有效最经济的方法，新城疫的疫苗已使用了几十年，由于ND疫苗的广泛使用，此病已基本上得到了较好的控制，但是临床上非典型ND的发生十分普遍，ND仍然成为威胁养禽业的主要疾病之一，也就是说，常规的疫苗对于NDV强毒的攻击并不能提供理想的保护。从近十年来的ND流行特点来看， 临床上所分离到的NDV毒株大多数属于基因VII型[Liu XF, Wan HQ, Ni XX，Wu YT & LiuWB. Pathotypical and genotypical characterization of strain of Newcastle disease isolated from outbreaks in chicken and goose flocks in some regions of China during 1985-2001. Archives of Virology, 2003,148(7) : 1387-1403.]，而常规的 ND 疫苗株的基因型主要为I和II型(如V4、LaSota等)，因此，在遗传距离上当前NDV分离株与常规ND疫苗株相差较远。2000年黄勇等在发病的鹅群中，成功分离到了基因VII型新城疫强毒ZJl株， 并进行了全基因组测序，登录号为AF431744[Huang Y，Wang HQ, Liu H Q, Wu YT & Liu XF. Genomic sequence of an isolate of Newcastle disease virus isolated from an out break in geese -.a novel six nucleotide insertion in the non-coding region of the nucleoprotein gene. Archives of Virology, 2004,149 :1445-1457.]。在此基础上， 2005年胡顺林等建立了 NDV强毒株的反向遗传操作平台，成功拯救出了鹅源强毒ZJl株，并对该毒株进行了致弱，但是获救病毒的EID5tl和HA效价均较低，不适合于大规模的生产[胡顺林，孙庆，吴艳涛，刘秀梵.用反向遗传技术致弱基因VIId型鹅源新城疫病毒ZJl株.微生物学报，2007，47 O) :197-200. ] οHuang等人分别以弱毒株LaSota和强毒株Beaudette C(BC)为骨架，通过HN基因置换而构建了两株重组嵌合病毒 rlaSoBCHN 和 rBCLaSoHN[Huang Ζ, Elankumaran S, Yunus AS,Samal SK. A recombinant Newcastle disease virus (NDV) expressing VP2 protein of infectious bursal disease virus (IBDV)protects against NDV and IBDV. Journal of virology, 2004, 78 (18) :10054-10063. ]。rIaSoBCHN 是用弱毒株 LaSota 的 HN 置换了骨架病毒BCHN的重组嵌合病毒。致病性试验结果表明，rlaSoBCHN的毒力比骨架病毒有显著上升，而rBCLaSoHN的毒力比骨架病毒有明显下降，而且重组嵌合病毒的组织嗜性与HN的来源有关，这说明HN是影响NDV毒力的一个重要决定因子[Huang Ζ, Elankumaran S，Panda A, Samal SK. Recombinant Newcastle disease virus as a vaccine vector. Poultry science, 2003,82 (6) :899-906.]。但是 Wakamatsu 等人用 BC 强毒株的 HN 置换 LaSota 骨架病毒而得到的重组嵌合病毒，其致病指数或对鸡致病的严重程度与LaSota相比均未改变 [Wakamatsu N, King DJ, Seal BS, Samal SK, Brown CC. The pathogenesis of Newcastle disease :a comparison of selected Newcastle disease virus wild-type strains and their infectious clones. Virology, 2006, 353 (2) :333-343. ]。Estevez 等人以中毒株 Anhinga为骨架病毒，用嗜内脏和嗜神经强毒株的HN进行置换而得到的重组嵌合病毒，其毒力与骨架病毒相比也没有发生明显改变[Estevez C，King D, Seal B, Yu Q. Evaluation of Newcastle disease virus chimeras expressing the Hemagglutinin-Neuraminidase protein of velogenic strains in the context of a mesogenic recombinant virus backbone. Virus research,2007,129(2) :182-190.]。NDV/LX株是我们从健康鸡群中分离到的一株NDV弱毒。初步研究表明，NDV/ LX具有良好的免疫原性，能在呼吸道和消化道很好的复制，诱导产生高滴度的特异抗体和粘膜免疫应答。NDV/LX病毒的ICPI值为0. 12，MDT为110h，按照OIE标准测得HA效价 10. 51og2。基因VII型强毒分离株JS-5-05-GO分离自发病鸭群，其F和HN基因序列号分别为EU044798、EU044816，其ICPI和MDT分别是1. 91和46小时，HA效价平均为81og2。
发明内容
本发明的第一个目的在于发明一种表达基因VII型F和HN重组新城疫弱毒疫苗， 从而解决当前所用疫苗株与流行株基因型不一致的问题。本发明表达基因VII型F和HN重组新城疫弱毒疫苗A-NDV-LX/I4，于2010年5 月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏号为CGMCC NO 3844。本发明的第二个目的在于发明一种表达基因VII型F和HN重组新城疫弱毒疫苗 A-NDV-LX/14的构建方法本发明在建立鸡源新城疫病毒NDV/LX株(CGMCC NO :3843)的反向遗传操作平台基础上，将中国主要流行的NDV基因VII型分离株JS-5-05-GO的囊膜糖蛋白基因F基因的强毒裂解位点裂解为弱毒位点，再将JS-5-05-GO的致弱的囊膜糖蛋白基因F基因和HN基因片段与NDV/LX株基因组的对应部分进行替换，拯救构建出致弱的表达基因VII型F和HN 重组新城疫弱毒疫苗A-NDV-LX/I4。本发明利用反向遗传技术成功拯救出了基因I型骨架替换上基因VII型流行毒株 JS-5-05-GO致弱的F基因和HN基因，该病毒具有弱毒和在鸡胚上具有较高的繁殖滴度的特性，适合于疫苗的大规模生产，另外，该重组致弱毒株A-NDV-LX/I4的F蛋白和HN蛋白为基因VII型与当前我国NDV流行株的基因型相一致，因此，同常规疫苗(基因I和II型)相比，重组致弱毒株A-NDV-LX/I4在控制当前新城疫的发病和流行方面显示出了广阔的应用前景。本发明所述新城疫弱毒疫苗A-NDV-LX/I4的构建方法如下1)构建重组质粒pA-NDV-LX/I4，构建含有分离株NDV/LX的F基因和HN基因的质粒pLI4，将分离株JS-5-05-GO致弱的F基因和HN基因替换到质粒pLI4上，用Ml I和Spe I将质粒mThl上的酶切片段替换到质粒pLI4中，获得质粒FP ；将质粒FP上裂解位点突变的F基因和HN基因替换NDV/LX株基因组的对应部分，获得质粒pA_NDV_LX/I4 ；2)重组致弱毒株A-NDV-LX/I4的拯救，将质粒PA-NDV-LX/I4与表达NDVZJl毒株 NP、P和L基因的pCI-NP、pCI-P和pCI_L三个真核表达质粒共转染BSR-T7/5细胞，转染 18h后加入终浓度为10%的SPF鸡胚尿囊液，转染60h后将转染样品接种9 11日龄SPF 鸡胚，即获得表达基因VII型F和HN重组新城疫弱毒疫苗A-NDV-LX/I4 ；3)重组致弱毒株A-NDV-LX/I4的免疫保护效率的测定，将A-NDV-LX/I4株与骨架病毒 NDV/LX、供体病毒 JS-5-05-Go 株[Hu, ZL, Hu, SL, Meng C, Wang, XQ, Zhu, J, Liu, XF. Generation of a genotype VII Newcastle disease virus vaccine candidate with high yield in embryonated chicken eggs. " Aviandiseases 55(3) :391-397.)]禾口常规疫苗株进行免疫保护效率的比较。经过囊膜糖蛋白基因的替换和F基因裂解位点的突变，成功拯救出一株毒价高且高度致弱的表达基因VII型F和HN重组新城疫弱毒疫苗A-NDV-LX/I4株。经试验表明本发明构建的致弱病毒A-NDV-LX/I4免疫试验鸡两周后，鸡血清HI 的平均效价为27 ；La Sota免疫组攻毒4天后，SPF鸡喉气管和泄殖腔的棉拭样品的病毒分离率分别为10%和30% ；商品鸡喉气管和泄殖腔的棉拭样品的病毒分离率分别为40%和 20% ；V4免疫组攻毒4天后，SPF鸡喉气管和泄殖腔的棉拭样品的病毒分离率分别为30%和10% ；商品鸡喉气管和泄殖腔的棉拭样品的病毒分离率分别为30%和20%，上述病毒的分离率均显著高于A-NDV-LX/I4免疫组，从而证明与常规疫苗相比，重组弱毒疫苗能够提供更加坚实的免疫保护效率。
图1NDV/LX株全长克隆prLX构建模式图。图2重组质粒ρ LI4构建模式图。图3F蛋白裂解位点突变模式图。图4重组质粒pA-NDV-LX/I4构建模式图。
具体实施例方式本发明表达基因VII型F和HN重组新城疫弱毒疫苗A-NDV-LX/I4，于2010年5月 19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO :3844.实施例一、NDV/LX株全长克隆prLX构建。构建模式如图1所示。步骤一 NDV/LX株的获得从健康家禽肠道分离到一批新城疫病毒弱毒株，对其生物学特性血凝价、ICPI、 EID50进行分析，在这些弱毒株中筛选出血凝价高、复制能力强的疫苗候选株；并对候选株进行免疫原性分析，免疫2周龄SPF鸡，免疫后测定血清中抗新城疫病毒的效价以及消化道和呼吸道粘膜免疫水平，最终获得能在呼吸道和消化道很好的复制，诱导产生高滴度的特异抗体和粘膜免疫应答的新城疫弱毒株NDV/LX (基因I型新城疫病毒弱毒NDV/LX株)。通过EID50 测定，获得 IO8'7EID50/0. ImL NDV/LX 病毒，ICPI 值为 0. 12，MDT 为 IlOh0本发明基因I型新城疫病毒弱毒NDV/LX株，于2010年5月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为=CGMCC NO :3843.步骤二 NDV/LX株基因组的修饰设计8对引物用于扩增NDV/LX株基因组全长序列，并进行测序，每个片段大小约 2000bp左右，引物序列如下CN 102533676 A
权利要求
1.新城疫病毒重组疫苗A-NDV-LX/I4，它的保藏号是CGMCC NO :3844。
全文摘要
本发明涉及一种表达基因VII型F和HN重组新城疫弱毒疫苗A-NDV-LX/I4，它的保藏号是CGMCCNO3844。本发明构建的致弱病毒A-NDV-LX/I4免疫试验鸡两周后，鸡血清HI的平均效价为27；LaSota免疫组攻毒4天后，SPF鸡喉气管和泄殖腔的棉拭样品的病毒分离率分别为10%和30%；商品鸡喉气管和泄殖腔的棉拭样品的病毒分离率分别为40%和20%；V4免疫组攻毒4天后，SPF鸡喉气管和泄殖腔的棉拭样品的病毒分离率分别为30%和10%；商品鸡喉气管和泄殖腔的棉拭样品的病毒分离率分别为30%和20%，与常规疫苗相比，本发明重组弱毒疫苗能够提供更加坚实的免疫保护效率。
文档编号C12N7/01GK102533676SQ20121000069
公开日2012年7月4日 申请日期2012年1月4日 优先权日2012年1月4日
发明者刘慧谋, 刘文博, 刘晓文, 刘秀梵, 王晓泉, 胡顺林 申请人:扬州大学