专利名称：一种采用荧光rt-pcr技术检测牙鲆tlr21基因表达的方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，涉及用于检测牙鲆TLR21基因表达的特异性引物，更具体的说是一种采用荧光RT-PCR技术检测牙鲆TLR21基因表达的方法。主要用于牙鲆 TLR21基因表达调控机理研究和免疫学功能研究，以及牙鲆早期病原感染的监测。
背景技术：
随着世界范围水产养殖规模的扩大，国内外水产品贸易及水产苗种跨区域交流日益频繁，大大增加了水产养殖动物病原传播的机会。同时，由于现代水产养殖的集约化、高密度生产方式及渔业水域环境的恶化，又常会引发养殖动物的应激反应，导致机体的免疫系统受到抑制。正是这些因素相互影响，出现了全球性的水产养殖动物发病率趋于频繁、流行程度日益广泛、经济损失极为巨大的局面。运用现代生物技术作为水产养殖的技术支撑， 掌握病害的免疫防御技术是水产科技急需解决的首要问题，因此，近年来国际上鱼类免疫学的研究逐渐受到重视。
在人类免疫学研究的历史舞台上，细胞免疫和体液免疫一直是两个主角。相比之下，固有免疫的研究由于缺乏对其相应受体的系统认识，明显滞后于获得性免疫研究的进程。20世纪90年代，Janeway等有关“病原体相关分子模式”以及“模式识别受体”概念的提出，标志着固有免疫研究进入了一个崭新的阶段。鱼类虽是低等脊椎动物，但已具备免疫的基本特性，与哺乳动物一样，其体内也存在2种免疫应答类型固有免疫应答和获得性免疫应答。而相对于哺乳动物来说，鱼类的固有免疫研究才刚刚起步。
Toll样受体(Toll-like receptors, TLRs)家族是动物识别入侵病原体的主要 “模式识别受体”，可识别几乎所有病原生物的一些通用结构，是启动固有免疫应答的关键。 一般认为TLR 1、2、4、5和6主要参与细菌成分的识别，而TLR3、TLR7和TLR8主要特异地针对病毒成分，TLR9对这二者均能够识别。TLR14、21 23在某些鱼类中存在，在哺乳动物中还未发现。有研究报道TLR21即可识别细菌成分，也可识别病毒成分。
牙鲆iParalichthys olivaceus)在我国俗称牙片、偏口、比目鱼，是我国北方海水工厂化养殖的主要名贵鱼类品种，同时也是重要的海水增养殖鱼类之一。牙鲆属于鲽形目， 鲆科，牙鲆属。牙鲆属的鱼类在南、北美洲东西岸较多，而亚洲沿岸只有牙鲆一种，主要分布于渤海、黄海、东海、南海以及朝鲜、日本、俄罗斯沿岸海区。近年来，腹水病、病毒性神经坏死症等各种病害的爆发和流行给生产企业造成了巨大的经济损失，严重阻碍了牙鲆养殖产业的发展。腹水病在牙鲆疾病中危害最为严重，该病从苗种到成鱼均有发生，死亡率可达 50%-80%。由于目前对牙鲆免疫机理和机制的了解较少，尚无有效的免疫防治技术和治疗方法。
TLRs是宿主免疫的必需分子之一，通过感知病原微生物体，识别病原相关分子模式，激活天然免疫系统。TLR21作为TLRs家族的成员，参与鱼类免疫调节，在一定程度上反映了鱼类的免疫能力，因此可以作为鱼类疾病防治中免疫监测的指标。
实时荧光PCR技术是在常规PCR技术的基础上发展起来的核酸定量技术。实时荧光PCR不仅实现了常规PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，实时荧光PCR技术由自动化仪器收集荧光信号，避免了肉眼判断的主观性，可进一步提高灵敏度；实时荧光 PCR技术全封闭反应，无须PCR后处理，避免污染，保证了结果的可靠性和重复性。目前，已广泛应用于分子生物学和医学研究等领域。随着实时荧光PCR试剂盒的进一步开发，近年来，实时荧光PCR技术在动物疫病诊断中也得到了广泛的应用。发明内容
本发明的目的是公开一种采用荧光RT-PCR技术检测牙鲆TLR21基因表达的方法。
为实现上述目的，本发明所采用的技术方案如下设计一种采用荧光RT-PCR技术检测牙鲆TLR21基因表达的特异性引物，其特征在于包括符合荧光PCR反应特点的特异上下游引物TLR21-q-F 5' -TAAACTTTGCCTACATCACA-3’ ； TLR21-q-R :5’- AACACGAGCAGAAGAACAT -3’ ；以及作为内参基因的牙鲆β -actin特异上下游引物β -actin-F 5' -AGGTTCCGTTGTC CCG-3' ； β -actin-R 5'-TGGTTCCTCCAGATAGCAC-3’。
本发明所述特异性引物快速检测牙鲆TLR21基因表达的方法，其特征在于按如下步骤进行(1)使用下述引物进行该基因的检测符合荧光PCR反应特点的该序列特异上下游引物 TLR21-q-F 5' -TAAACTTTGCCTACATCACA-3， TLR21-q-R 5' - AACACGAGCAGAAGAACAT -3' 以及作为内参基因的牙鲆β-actin特异上下游引物 β -actin-F 5'-AGGTTCCGTTGTCCCG-3’ β -actin-R 5'-TGGTTCCTCCAGATAGCAC-3，；(2)总RNA提取与纯化采用各种通用的RNA提取方法和纯化方法，从牙鲆头肾中提取得到纯化的牙鲆头肾总RNA ；(3)cDNA第一链合成以牙鲆头肾总RNA为模板合成cDNA第一链，反应体系为20μ L ；(4)实时荧光PCR:以上述合成的cDNA第一链为模板，上述(1)中TLR21_q_F和 TLR21-q_R、β -actin-F和β -actin-R为特异性引物，进行实时荧光PCR扩增反映，每个样品设3个平行管，扩增后所得3个平行管的Ct值取平均数。
(5)牙鲆的头肾组织中TLR21基因的相对表达量计算实时荧光PCR完成后，根据 Ct值计算牙鲆病原感染各时间段下的Δ Ct、2_uet)值、2_(δδ")值，计算方式如下Δ Ct = Ct — Ct 内对照(β -actin) ΔΔ Ct = Δ Ct —Δ Ct (0时健康牙鲆)以2_uct)数值表示牙鲆头肾中TLR21基因相对于β -actin基因的表达量。
以2_(δ Δε )数值表示牙鲆头肾中TLR21基因相对于健康牙鲆TLR21基因的表达量。
本发明所述的检测方法，其中每条引物分别配制成浓度为25 ymol/L的贮存液， 工作浓度为0.5 ymol/L。
本发明更加详细的试验方法如下牙鲆TLR21基因的实时荧光RT-PCR检测方法可通过以下步骤实现 (1)引物设计根据TLR21的全长序列，使用ft~imer 5软件设计适用于实时荧光PCR 检测的特异性引物，引物序列如下TLR21-q-F 5' -TAAACTTTGCCTACATCACA-3， TLR21-q-R 5'- AACACGAGCAGAAGAACAT -3'TLR21的PCR产物预计长度为198 bp，琼脂糖凝胶电泳结果显示扩增后的产物长度与预计产物长度一致，且为单一条带，说明所设计的引物具有很强的特异性，适合用于实时荧光RT-PCR检测；琼脂糖凝胶电泳结果如
图1所示。
同时，根据NCBI里提供的牙鲆β -actin的cds序列(EU090804)设计用于实时荧光PCR内对照的引物，引物序列如下β -actin-F 5'-AGGTTCCGTTGTCCCG-3’ β -actin-R 5'-TGGTTCCTCCAGATAGCAC-3，β-actin的PCR产物预计长度为150 bp。琼脂糖凝胶电泳结果显示扩增后的产物长度与预计产物长度一致，且为单一条带，说明所设计的引物具有很强的特异性，适合用于实时荧光RT-PCR检测时作为内对照扩增。琼脂糖凝胶电泳结果如图2所示。
(2)牙鲆感染实验近期未施用过疫苗的健康牙鲆(体长8-10 cm) 50尾，培养于水族箱内，每尾腹腔注射活菌0.1 mL (IO5个鳗弧菌)，或者每尾腹腔注射Poly (I: C)模拟 RNA病毒200 μ g，继续培养，于不同时间段处死牙鲆解剖分离头肾组织。
(3)总RNA提取与纯化采用各种通用的RNA提取方法和纯化方法，从牙鲆头肾中提取得到纯化的牙鲆头肾总RNA。
(4) cDNA第一链合成cDNA第一链的合成采用上海生工的 Protocol-BS249&BS250 MMLV First Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒，反转录引物使用试剂盒所提供的随机六合引物或Oligo (dT) 18引物，以牙鲆头肾总RNA为模板合成cDNA第一链，反应体系为20 UL0
(5)实时荧光PCR 实时荧光PCR采用上海生工的Hot Start Fluorescent PCR Core Reagent Kits (SYBR Green I)试剂盒进行。以上述合成的cDNA第一链为模板，上述 (1)中TLR21-q_F和TLR21-q_R、β-actin-F和β-actin-R为特异性引物，进行实时荧光 PCR扩增反映，每个样品设3个平行管，扩增后所得3个平行管的Ct值(即每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的反应循环数)取平均数。
实时荧光PCR扩增体系设置如下
权利要求
1.一种采用荧光RT-PCR技术检测牙鲆TLR21基因表达的特异性引物，其特征在于包括符合荧光PCR反应特点的特异性上下游引物TLR21-q-F 5' -TAAACTTTGCCTACATCACA-3'； TLR21-q-R 5'- AACACGAGCAGAAGAACAT -3'；以及作为内参基因的牙鲆β -actin基因特异性上下游引物β -actin-F 5' -AGGTTCC GTTGTCCCG-3' ； β -actin-R 5'-TGGTTCCTCCAGATAGCAC-3‘。
2.一种采用权利要求1所述的特异性引物快速检测牙鲆TLR21基因的方法，其特征在于按如下步骤(1)使用下述引物进行该基因的检测符合荧光PCR反应特点的该序列特异性上下游引物 TLR21-q-F 5'-TAAACTTTGCCTACATCACA-3， TLR21-q-R 5'- AACACGAGCAGAAGAACAT -3' 以及作为内参基因的牙鲆β-actin特异性上下游引物 β -actin-F 5'-AGGTTCCGTTGTCCCG-3’ β -actin-R 5'-TGGTTCCTCCAGATAGCAC-3，；(2)总RNA提取与纯化采用各种通用的RNA提取方法和纯化方法，从牙鲆头肾中提取得到纯化的牙鲆头肾总RNA ；(3)cDNA第一链合成以牙鲆头肾总RNA为模板合成cDNA第一链，反应体系为20μ L ；(4)实时荧光PCR:以上述合成的cDNA第一链为模板，上述(1)中TLR21_q_F和 TLR21-q_R、β -actin-F和β -actin-R为特异性引物，进行实时荧光PCR扩增反映，每个样品设3个平行管，扩增后所得3个平行管的Ct值取平均数；实时荧光PCR扩增体系设置如下
3.如权利要求2所述的检测方法，其中每条引物分别配制成浓度为25 ymol/L的贮存液，工作浓度为0.5 ymol/L。
全文摘要
本发明公开了一种采用荧光RT-PCR技术检测牙鲆TLR21基因相对表达量的方法。本发明中牙鲆TLR21基因实时荧光RT-PCR检测方法的建立，为研究牙鲆TLR21基因表达调控机理及免疫学功能奠定基础。TLR21参与鱼类免疫调节，通过感知病原微生物体，识别病原相关分子模式，激活天然免疫系统，TLR21基因的表达丰度在一定程度上反映了牙鲆免疫系统的活度，可以作为牙鲆疾病防治中免疫监测指标。通过检测牙鲆TLR21基因表达量的变化，可以提早判断牙鲆是否感染病原，及时采取预防治疗措施，避免势态严重发展造成不可挽回的损失。本发明为在mRNA水平对TLR21的相对定量分析提供了技术平台。
文档编号C12Q1/68GK102534000SQ20121000393
公开日2012年7月4日 申请日期2012年1月9日 优先权日2012年1月9日
发明者吴恋, 孙金生, 潘宝平, 耿绪云, 高虹 申请人:天津师范大学