专利名称：一种新型的无动物源、无饲养层的人多能干细胞培养系统的制作方法
技术领域：
本发明细胞培养技术领域，特别涉及一种新型的无动物源、无饲养层的人多能干细胞培养系统，适用于人多能干细胞的长时间培养。
背景技术：
人多能干细胞典型特点是，在体外不断自我更新，同时保持向各个胚层细胞分化的潜能。由于人胚胎干细胞建立涉及伦理与法律等问题，其研究与应用受到一定的限制。而诱导多能干细胞很好地解决了人胚胎干细胞存在的伦理争议，同时由于其具有与人胚胎干细胞相似的特性，即自我更新与分化潜能，因而为再生医学尤其是个性化的治疗带来了希望。人多能干细胞不仅为基础研究提供了独特的模型，而且在细胞移植治疗方面具有巨大的应用价值。然而在培养人多能干细胞时，其与动物源制品(如动物血清或动物蛋白) 的接触会提高这种细胞吸收非人源代谢产物或被非人源病原污染的风险。例如，在有动物源成分存在的培养体系中，细胞会吸收并表达唾液酸Neu5Gc。由于人类循环系统中存在识别Neu5Gc的抗体，当含有Neu5Gc的细胞或组织移植入人体时，机体会识别这些非人源的抗原，从而对移植细胞或组织产生排斥反应，造成移植失败。同时饲养层的存在导致耗费大量的人力和物力，且饲养层细胞的批次性也会导致系统的不稳定性。因此，确定培养系统中的各种成分则有利于优化培养系统并具有较高的可重复性。近年，研究者们研究发展出如下不同的人多能干细胞的培养系统(一)饲养层培养体系的发展人多能干细胞最初在以小鼠的胚胎干细胞的培养系统衍化而来的条件下建立并进行培养的，即含有鼠胚胎成纤维细胞的饲养层以及含有胎牛血清的培养基。为降低培养系统中非人源成分，研究者尝试不同组织来源的人源细胞作为饲养层培养人多能干细胞。 Richard(Richards, Μ. , Fong, C. Y. , Chan, ff. K. , Wong, P. C. &Bongso, A.、Human feeders support prolonged undifferentiated growth of human inner cell masses and embryonic stem cells、Nat Biotechnol、2002、20、9、933_6。)等首次以胎儿 / 成人成纤维细胞作为饲养层，以人血清作为培养基，建立首个无动物源的培养系统。随后人骨髓来源间充质细胞，新生儿包皮细胞，人胚胎干细胞分化来源的成纤维样细胞，胎盘来源的间充质干细胞等被尝试用作人多能干细胞的饲养层。虽然各种人源细胞用于培养人多能干细胞， 但是其支持人多能干细胞不分化的能力各不相同。这可能与细胞来源，培养条件的不同等因素有关。同时，制备饲养层的细胞也需要大量的人力、物力，其批次之间的差异性也无法解决。因此，发展无饲养层的培养系统具有更大的应用价值。( 二)无饲养层培养体系的发展Xu(Xu,C. ,et al. >Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells,Nat Biotechnol、2001、19、10、971_4。)等首次报道将人多能干细胞培养在由 Matrigel (BD公司)作为细胞外基质以及鼠胚胎成纤维细胞来源的条件培养基构成的无饲养层的培养系统内。两种培养系统内人胚胎干细胞的mRNA表达谱相似,说明在此无饲养层的培养系统内，细胞不会受到额外的刺激。Matrigel是鼠EHS瘤细胞的提取物，因其来源提高人多能干细胞临床应用的风险以及其成分的不确定性，因此研究者们尝试以纯化的蛋白或人工合成物替代Matrigel。在胚胎成纤维细胞来源的条件培养基作为培养基以及含牛血白蛋白的无血清培养基中，层黏连蛋白(Laminin)、纤维连接蛋白(Fibronectin)和重组表达的玻璃粘连蛋白(Vitronectin)均被报道能够代替Matrigel长期维持人多能干细胞的增殖。2006 年，Ludwig (Ludwig, T. E. , et al.、Derivation of human embryonic stem cells in defined conditions、Nat Biotechnol、2006、24、2、185-7。)等报道在成分明确的培养基TeSR中使用四种大分子的混合物包括层黏连蛋白、纤维连接蛋白、玻璃粘连蛋白和胶原IV (Colagen IV)等成功培养人多能干细胞并在此培养系统中建立新的人多能干细胞细胞株。但由于此培养系统的高昂费用不便于推广应用。(三)培养基的发展在含有胎牛血清的培养体系中，很多干细胞死亡并大量分化。随后，Amit(Amit， M. , et al.、ClonalIy derived human embryonic stem cell lines maintain pluripotency and proliferative potential for prolonged periods of culture、 Dev Biol、2000、227、2、271-8。)等尝试用 KO SR(Invitrogen)代替胎牛血清降低了因血清批次间差异带来的不稳定性。随后Xu(Xu, C. , et al.、Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells、Nat Biotechnol、2001、19、10、971_4o ) 等应用鼠胚胎成纤维细胞来源的条件培养基，以Matrigel作为细胞外基质成分能长期维持人多能干细胞不分化的状态，也就是现在最广泛应用的培养方法。但是该培养直接接触到鼠源、牛源的物质，对将来应用的临床应用上会有很大的障碍。
发明内容
多能干细胞的培养需要有细胞外基质的支持，同时需要适合的培养基，然而现有的培养系统含有动物源制品，显然提高了多能干细胞吸收非人源代谢产物或被非人源病原污染的风险。鉴于现有技术的不足，本发明旨在克服这个难点，通过应用胃蛋白酶消化以及尿素提取的方法从胎盘组织中提取了能够支持人胚胎干细胞长期培养的细胞外基质蛋白即人源化基质，同时以人血浆为原料，以NaCl沉淀的方法获得的组分配制成的人源化培养基，与人源化基质共同构成无动物源、无饲养层的培养系统。为实现该目的，本发明提供了一种新型的无动物源、无饲养层的人多能干细胞培养系统，它包括支持人多能干细胞长期培养的人源化基质和人源化培养基，所述的人源化基质富含人IV型胶原、纤维粘连蛋白和层粘连蛋白，所述的人源化培养基富含纤维粘连蛋白和玻璃连接蛋白。优选地，所述的人多能干细胞培养系统中的人源化基质按如下步骤制备而成(I)新鲜胎盘去掉羊膜与脐带后，剪成不超过O. 3X0. 3X0. 3cm大小的组织块，以冷水将组织块悬起，4°C搅拌，12h后，用ImmXlmm的筛网过滤，将截留的组织仍用冷水悬起，以冷水洗2天，每12h换水一次，第三次过滤后，将截留的组织用冷的IM NaCl缓冲液悬起，4°C搅拌；其中所述的NaCl缓冲液按如下方法配制58. 5g NaCl与25ml Tris缓冲液，溶于Milli-Q水中，调节pH至7. 5，定容至IL ;所述的Tris缓冲液按如下方法配制242. 28gTris碱溶于800ml Milli-Q水中，调节pH至7. 5，加Milli-Q水定容至IL ；(2)以冷的IM NaCl缓冲液洗4天，每12h换液一次，第八次更换NaCl缓冲液时， 用1_X1_的筛网过滤，将截留的组织用冷的O. 5M醋酸溶液悬起，4°C搅拌；(3)以冷的O. 5M醋酸溶液洗3天，每12h换液一次，第六次换O. 5M醋酸溶液时， 用ImmXlmm的筛网过滤，将截留的组织称重；以胃蛋白酶组织为I : 400的质量比加入胃蛋白酶，同时以200g/L将酶与组织块悬起于O. 5M醋酸溶液中，4°C搅拌24h ；(4)7100g，4°C离心lh，去掉上清，收集沉淀并称重，以质量体积比为I : I的条件加入2M尿素缓冲液，4°C搅拌24h ;其中所述的尿素缓冲液按如下方法配制240. Og尿素、 12. Ig Tris 碱、18. Og NaCl 溶于 I. 8L Milli-Q 水中，浓 HCl 调节 pH 至 7. 4，Milli-Q 水定容至2L ；(5) 13000rpm，4°C离心30min，上清液装入25KD的透析袋中，以TBS缓冲液+0. 5% 氯仿为周围溶液于4°C透析2h，然后彻底清洗烧杯与透析袋外表面后，以冷的TBS缓冲液为周围溶液，继续4°C透析，每2h换TBS缓冲液一次，共换3次，最后一次透析时，4°C，过夜， 透析好的液体，即为人源化基质；其中所述的TBS缓冲液按如下方法配制12. Ig Tris碱， 18. Og NaCl 溶于 I. 8L Milli-Q 水中，浓 HCl 调节 pH 至 7. 4，Milli-Q 水补齐至 2L。优选地，所述的人多能干细胞培养系统中的人源化培养基含有人血浆的NaCl沉淀组分。优选地，所述的人血浆的NaCl沉淀组分按如下步骤制备而成(I)将经过安全检测的四种血型的血浆，以等体积比例混合，分装成36ml/BD管， 每管加入6ml的林格液，混合均匀后再加入2MCaC12至终浓度为20mM，混匀，置于37°C水浴锅孵育两小时，将已凝固的血浆，存于_20°C过夜；(2)将处理过的血浆从_20°C冰箱拿出置于4°C冰箱，过夜解冻，高速冷冻离心机在4°C，以16000rpm离心30分钟，收集上清，即是血浆来源的血清；(3)在4°C冷柜中，向血清中缓慢、均匀地加入NaCl，至终浓度为28/100ml，搅拌过夜；(4)高速冷冻离心机在4°C，以16000rpm离心30分钟，收集上清，将收集的上清用滤纸过滤掉悬浮的小颗粒；(5)将过滤的上清，装入25KD的透析袋中，在冷的双蒸水中搅拌透析2小时以上；(6)重复步骤(5)两次；(7)将步骤6透析的透析袋放入冷的DMEM/F12培养基，搅拌透析过夜；(8)取出透析袋内的溶液，以外部DMEM/F12培养基为对照，280nm测定蛋白浓度， O. 22 μ m过滤后，保存于4°C，此即为血浆的NaCl沉淀组分。上述步骤(I)中所述的林格液按如下方法配制JfNaCl O. 9g,KCl O. 042g, CaCl2 O. 0242g，溶于IOOml的双蒸水，用O. 22 μ m的滤膜过滤备用。与现有技术相比，本发明涉及的人多能干细胞培养系统具有如下优点和显著的进
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少(I)制备成本低。本发明以胎盘为原材料制备人源化基质，胎盘是一种富含细胞外基质蛋白的人体组织，婴儿出生后即被废弃，因而具有来源广泛，成本低廉等特点。(2)无动物源、无饲养层。本发明应用胃蛋白酶消化以及尿素提取的方法从胎盘组织中提取了能够支持人胚胎干细胞长期培养的细胞外基质蛋白即人源化基质，同时以人血浆为原料，以NaCl沉淀的方法获得的组分配制成的人源化培养基，与人源化基质共同构成无动物源、无饲养层的培养系统。这一培养系统能够长期维持人胚胎干细胞的自我更新以及分化的潜能，同时无动物源的人诱导多能干细胞细胞系也可在这一培养系统中建立，因此这一成本低廉，易于扩大培养的无动物源、无饲养层培养系统为多能干细胞的临床应用打下基础。(3)促进干细胞贴壁。与Matrigel的成分相似，本发明的细胞外基质富含人IV 型胶原(Collagen IV)、纤维粘连蛋白(Fibronectin)和层粘连蛋白(Laminin)(见图 2-A、B、C)。同时，本发明通过以人的血浆为原材料，比较阴离子交换柱层析、饱和硫酸铵沉淀和NaCl沉淀的方法，最后选定利用NaCl沉淀的方法从人血浆中提取制成了血浆抽提物，配制成人源化的培养基，该培养基富含纤维粘连蛋白(Fibronectin)和玻璃连接蛋白 (Vitronectin)(见图2_D、E)，对促进干细胞的贴壁有重要作用。(4)可长时间培养人胚胎干细胞。通过实验证明，本发明的人源化细胞外基质和人血浆抽提物，可长时间培养人胚胎干细胞，经过39代(约270天)的培养，胚胎干细胞仍然保持核型的稳定(见图3-B)，并且具有和传统培养方法相似的形态学特征，干性相关基因的表达水平(见图3-A、C、D)。为了检测在该人源化系统中，干细胞是否能保持三胚层分化的全能性，发明人分别检测了其在体外、体内分化的能力(图4-A、B)。体外的EBs和体内畸胎瘤都检测到三胚层的代表标记。(5)支持诱导产生诱导多能干细胞。更进一步，通过进行人多能干细胞的诱导试验证明，本发明的人源化干细胞培养系统能够支持诱导人皮肤细胞去分化成为诱导多能干细胞，诱导产生的诱导多能干细胞能表达多能性相关的蛋白(图5-A)以及相似的RNA表达水平(图5-B)。由于重编程的另一个主要特征是表观遗传的改变，发明人检测了 0ct4与 Nanog基因启动子的甲基化水平，结果显示诱导多能干细胞的甲基化水平与人真皮成纤维细胞相比大大降低，与干细胞的水平相近。这说明其形成确实经历了表观水平的变化(图 5-C)，且诱导的诱导多能干细胞具有体外、体内的朝三胚层分化的潜能(图6-A、B)。
通过下面结合附图对本发明的优选实施例进行的描述，本发明的技术方案及其技术效果将变得更加清楚，且更加易于理解。其中图I示出了本发明的人源化基质制备流程图。图2示出了人源化基质(FCF matrix)及培养基(XF medium)大分子成分的电泳图。Western blot 显不人源化基质中富含 Collagen IV、Fibronectin 和 Laminin(A、B、C)， 而培养基中富含Fibronectin以及Vitronectin等细胞外基质蛋白(D、E)。图3示出了培养在本发明培养系统中的hESCs具有正常核型以及表达多能性相关的蛋白。(A)明场中培养在传统MEF-CM/MG系统(左)以及无动物源无饲养层(XF/FCF)系统的H7细胞的形态；⑶在XF/FCF中培养39代后，H7细胞的G-带染色结果；(C)FACS分析不同培养条件下，表达多能性相关的蛋白0ct4，SSEA4，TRA-1-60 and TRA-1-81的H7细胞的百分比；两者之间没有明显区别。(D)定量RT-PCR分析不同培养系统中，H7细胞0ct4， Sox2 and Nanog的表达量(基因的表达水平以GAPDH的表达量归一)，两者之间没有明显区别。图4示出了培养在XF/FCF的H7体内体外均具有向三胚层细胞分化的潜能。(A) RT-PCR分析由MEF-CM/MG(左)以及XF/FCF(右)培养的H7分化形成的EBs基因表达情况； (B)H7在XF/FCF培养14代后在N0D/SCID小鼠体内形成畸胎瘤，对畸胎瘤进行苏木精-伊红染色。箭头指示来源于三胚层的典型结构。标尺，100 μ m。图5示出了形成的hiPSCs表达多能性相关蛋白同时具有与胚胎干细胞hESCs相似的甲基化水平。(A)iPS细胞表达0ct4，SSEA4，TRA-l-60以及TRA-1-81等蛋白的免疫荧光染色，标尺，100 μ m ; (B)定量RT-PCR分析H7与iPS细胞内0ct4，Sox2以及Nanog的表达量，基因的表达水平以GAPDH的表达量归一 ；(C)重亚硫酸盐测序分析H7，HDFs以及iPS 细胞内，0ct4与Nanog启动子甲基化状态，空圈代表未甲基化的CpGs，黑圈代表甲基化的 CpGs。图6示出了形成的hiPSCs体内体外均具有向三胚层细胞分化的潜能。(A)RT-PCR 分析由iPS (右)与H7 (左)分化形成的EBs基因表达情况；(B) Cl-OSN在XF/FCF培养7代后在N0D/SCID小鼠体内形成畸胎瘤，对畸胎瘤进行苏木精-伊红染色。箭头指示来源于三胚层的典型结构。标尺，100 μ m。
具体实施例方式本发明提供的新型无动物源、无饲养层的干细胞培养系统主要包含二个主要的方面1)干细胞赖以贴壁生长的细胞外基质(FCF matrix) ；2)维持胚胎干细胞自我更新的细胞培养基(XF medium)。I、人源化基质的提取我们通过对Matrigel提取方法的优化，发展出了一种简单易行的从胎盘中提取细胞外基质的方法。首先，我们从医院取得乙肝、艾滋病、梅毒等检测阴性的健康产妇的胎盘。根据人源化基质提取过程主要分为四部分(图I)，首先将胎盘组织剪碎，其次去除血液蛋白与细胞蛋白，再次提取细胞外基质蛋白的组分，最后除菌以及透析到TBS溶液中。I、I准备试剂(I) 2M Tris 缓冲液，pH 7. 5242. 28g Tris 碱溶于 800ml Milli-Q 水中，调节 pH 至 7. 5，加 Milli-Q 水补齐至 1L。(2) IM NaCl 缓冲液，pH 7. 558. 5g NaCl与25ml 2M Tris缓冲液，溶于Milli-Q水中，调节pH至7. 5补齐至 1L。(3) 2M尿素缓冲液240. Og 尿素，12. Ig Tris 碱，18. Og NaCl 溶于 I. 8L Milli-Q 水中，浓 HCl 调节 pH 至7. 4，Milli-Q水补齐至2L。(4) TBS 缓冲液12. Ig Tris 碱，18. Og NaCl 溶于 I. 8L Milli-Q 水中，浓 HCl 调节 pH 至 7. 4， Milli-Q水补齐至2L。
(5) 75% 乙醇溶液。所有溶液储存于4°C。1、2准备胎盘(I)取回的新鲜胎盘储存于冰盒内。(2)去掉羊膜与脐带后，将胎盘剪成大概5X5cm的组织块，_80°C保存。(3)提取基质时，将胎盘组织块取出，室温解冻。(4)以解剖剪剪成不超过O. 3X0. 3X0. 3cm大小的组织块，称取重量。1、3实验步骤(I)以2L左右的冷水将组织块悬起，4°C搅拌，1 1后，用ImmX Imm的筛网过滤。将截留的组织仍用2L冷水悬起。(2)以冷水洗2天，每12h换水一次。(3)第三次过滤时，将截留的组织用2L冷的IM NaCl缓冲液悬起，4°C搅拌。(4)以冷的IM NaCl缓冲液洗4天，每12h换液一次。(5)第八次更换NaCl缓冲液时，ImmX Imm的筛网过滤，将截留的组织用冷的O. 5M
醋酸溶液悬起，4 °C搅拌。(6)以冷的O. 5M醋酸溶液洗3天，每1此换液一次。(7)第六次换O. 5M醋酸溶液时，ImmX Imm的筛网过滤，将截留的组织称重。以胃蛋白酶组织为I : 400的质量比加入胃蛋白酶(P印sin)，同时以200g/L将酶与组织块悬起于O. 5M醋酸溶液中。4°C搅拌24h。(8)7100g，4°C离心，lh。去掉上清，收集沉淀并称重。(9)以质量体积比为I : I的条件加入2M尿素溶液。4°C搅拌24h。(10) 13000rpm,4°C离心 30min。保留上清。(11)上清装入25KD的透析袋中，以TBS+0. 5%氯仿为周围溶液透析，4°C，2h。(12)彻底清洗烧杯与透析袋外表面后，以冷的TBS为周围溶液，继续透析，4°C。(13)每2h换TBS —次，共换3次，最后一次透析时，4°C，过夜。(14)将透析好的液体，即为FCF matrix，在超净台内小心分装于I. 5ml EP管内，
尽量避免温度升高。保存于_20°C。与Matrigel的成分相似,本发明制备的人源化基质富含人IV型胶原(Collagen IV)、纤维粘连蛋白(Fibronectin)和层粘连蛋白(Laminin)(见图2-A、B、C)。2、人源化培养基的制备2、I准备试剂(I)Ringer solution NaCl :0. 9g, KCl :0. 042g, CaCl2 :0. 0242g,溶于 100ml 的 ddH20,用 O. 22um 的滤膜
过滤备用。(2) 2M CaCl2 CaCl2 :11. lg，溶于 50ml 的 ddH20,用 O. 22um 的滤膜过滤备用。2、2血浆处理(I)将经过安全检测的四种血型的血浆，以等体积比例混合，分装成36ml/BD管。 每管加入6ml的Ringer solution,混合均勻。再加入2M CaCl2至终浓度为20mM,混勻，置于37 °C水浴锅孵育两小时。
(2)将已凝固的血浆，存于_20°C过夜。
2、3实验步骤
(I)将处理过的血浆从_20°C冰箱拿出置于4°C冰箱，过夜解冻。
(2)高速冷冻离心机在4°C，以16000rpm离心30分钟，收集上清，即是血浆来源的血清。
(3)在4°C冷柜中，缓慢、均匀的加入NaCl，至终浓度为28g/100ml，搅拌过夜。
(4)高速冷冻离心机在4°C，以16000rpm离心30分钟，收集上清，将收集的上清用滤纸过滤掉悬浮的小颗粒。
(5)将过滤的上清，装入25KD的透析袋中，在冷的ddH20中搅拌透析2小时以上。
(6)重复步骤(5)两次。
(7)将步骤6透析的透析袋放入冷的DMEM/F12，搅拌透析过夜。
(8)取出透析袋内的溶液，以外部DMEM/F12为对照，280nm测定蛋白浓度，O. 22 μ m过滤后，保存于4°C，此即为血浆的NaCl沉淀组分。
2、3人源化培养基配制
(I)微量元素的配制
MiIIi-Q水以浓HCl调节pH值至O. 9-1.0。称取下列药品
权利要求
1.一种新型的无动物源、无饲养层的人多能干细胞培养系统，其特征在于包括支持人多能干细胞长期培养的人源化基质和人源化培养基，所述的人源化基质富含人IV型胶原、纤维粘连蛋白和层粘连蛋白，所述的人源化培养基富含纤维粘连蛋白和玻璃连接蛋白。
2.根据权利要求I所述的人多能干细胞培养系统，其特征在于所述的人源化基质按如下步骤制备而成(1)新鲜胎盘去掉羊膜与脐带后，剪成不超过0.3X0. 3X0. 3cm大小的组织块，以冷水将组织块悬起，4°C搅拌，12h后，用1_X Imm的筛网过滤，将截留的组织仍用冷水悬起，以冷水洗2天，每12h换水一次，第三次过滤后，将截留的组织用冷的IM NaCl缓冲液悬起， 4°C搅拌；其中所述的NaCl缓冲液按如下方法配制58. 5g NaCl与25ml Tris缓冲液，溶于Milli-Q水中，调节pH至7. 5，定容至IL ;所述的Tris缓冲液按如下方法配制242. 28g Tris碱溶于800ml Milli-Q水中，调节pH至7. 5，加Milli-Q水定容至IL ；(2)以冷的IMNaCl缓冲液洗4天，每12h换液一次，第八次更换NaCl缓冲液时，用 ImmXlmm的筛网过滤，将截留的组织用冷的0. 5M醋酸溶液悬起，4°C搅拌；(3)以冷的0.5M醋酸溶液洗3天，每12h换液一次，第六次换0. 5M醋酸溶液时，用 ImmXlmm的筛网过滤，将截留的组织称重；以胃蛋白酶组织为I : 400的质量比加入胃蛋白酶，同时以200g/L将酶与组织块悬起于0. 5M醋酸溶液中，4°C搅拌24h ；(4)7100g，4°C离心lh，去掉上清，收集沉淀并称重，以质量体积比为I: I的条件加入 2M尿素缓冲液，4°C搅拌24h ;其中所述的尿素缓冲液按如下方法配制240. Og尿素、12. Ig Tris 碱、18. Og NaCl 溶于 I. 8L Milli-Q水中，浓HCl 调节 pH至 7. 4，Milli_Q水定容至 2L ；(5)13000rpm，4°C离心30min，上清液装入25KD的透析袋中，以TBS缓冲液+0. 5%氯仿为周围溶液于4°C透析2h，然后彻底清洗烧杯与透析袋外表面后，以冷的TBS缓冲液为周围溶液，继续4°C透析，每2h换TBS缓冲液一次，共换3次，最后一次透析时，4°C，过夜，透析好的液体，即为人源化基质；其中所述的TBS缓冲液按如下方法配制12. Ig Tris碱，18. Og NaCl溶于I. 8L Milli-Q水中，浓HCl调节pH至7. 4，Milli-Q水补齐至2L。
3.根据权利要求I所述的人多能干细胞培养系统，其特征在于所述的人源化培养基含有人血浆的NaCl沉淀组分。
4.根据权利要求3所述的人多能干细胞培养系统，其特征在于所述的人血浆的NaCl 沉淀组分按如下步骤制备而成(1)将经过安全检测的四种血型的血浆，以等体积比例混合，分装成36ml/BD管，每管加入6ml的林格液，混合均匀后再加入2M CaCl2至终浓度为20mM，混匀，置于37°C水浴锅孵育两小时，将已凝固的血浆，存于-20 V过夜；(2)将处理过的血浆从_20°C冰箱拿出置于4°C冰箱，过夜解冻，高速冷冻离心机在 4°C，以16000rpm离心30分钟，收集上清，即是血浆来源的血清；(3)在4°C冷柜中，向血清中缓慢、均匀地加入NaCl，至终浓度为28g/100ml，搅拌过夜；(4)高速冷冻离心机在4°C，以16000rpm离心30分钟，收集上清，将收集的上清用滤纸过滤掉悬浮的小颗粒；(5)将过滤的上清，装入25KD的透析袋中，在冷的双蒸水中搅拌透析2小时以上；(6)重复步骤(5)两次；(7)将步骤6透析的透析袋放入冷的DMEM/F12培养基，搅拌透析过夜；(8)取出透析袋内的溶液，以外部DMEM/F12培养基为对照，280nm测定蛋白浓度，0.22 um过滤后，保存于4°C，此即为血浆的NaCl沉淀组分。
5.根据权利要求4所述的人多能干细胞培养系统，其特征在于步骤(I)中所述的林格液按如下方法配制JfNaCl 0. 9g，KCl 0. 042g，CaC12 0. 0242g，溶于IOOml的双蒸水，用0.22um的滤膜过滤备用。
全文摘要
本发明涉及一种新型的无动物源、无饲养层的人多能干细胞培养系统，应用胃蛋白酶消化以及尿素提取的方法从胎盘组织中提取了能够支持人胚胎干细胞长期培养的细胞外基质蛋白即人源化基质，同时以人血浆为原料，以NaCl沉淀的方法获得的组分配制成的人源化培养基，与人源化基质共同构成无动物源、无饲养层的培养系统。这一培养系统能够长期维持人胚胎干细胞的自我更新以及分化的潜能，同时无动物源的人诱导多能干细胞细胞系也可在这一培养系统中建立，因此这一成本低廉，易于扩大培养的无动物源、无饲养层培养系统为多能干细胞的临床应用打下基础。
文档编号C12N5/0735GK102586176SQ201210007010
公开日2012年7月18日 申请日期2012年1月11日 优先权日2012年1月11日
发明者牟晓宁, 王奇慧, 马跃 申请人:中国科学院生物物理研究所