专利名称：：小麦人工染色体的制作方法
技术领域：
：本发明涉及生物
技术领域：
。具体而言，本发明涉及在小麦中获得人工小染色体的方法。本发明通过将含有拟南芥端粒序列的植物载体转化小麦，而在小麦中发生端粒介导的染色体的切割，进而获得小麦人工小染色体。本发明还涉及对所获得的小麦中的小染色体进行检测的方法。本发明还涉及人工小染色体技术在小麦基因工程中的应用。
背景技术：
：植物基因工程技术的发展已经历了近30年，作为现代生物技术的核心技术，其已经在农牧业，食品，环保等方面显示出了广阔的应用前景。植物基因工程技术主要是将外源基因构建到可表达的重组载体中，并通过农杆菌介导或者通过粒子轰击转化到宿主基因组中表达，最终改变植物性状[1-2]。然而，当的基因工程技术也存在着许多局限性。例如，多基因转化，目前应用传统的转基因方法实现多基因的共转化难度较大，这极大地限制了对数量性状基因及代谢复合物与多产物的合成所涉及的多个基因的同时转化[3-4];外源基因在整合到宿主基因组中时，往往整合进内源基因而导致内源基因失去功能；同时转化的随机性使得转入的外源基因很难进行操控。随着作物基因工程和人工染色体技术的发展，出现了人工微小染色体[5]技术，人工染色体可以作为外源基因表达的独立平台，由于不用整合到宿主基因组中，所以不会引起宿主基因的插入失活以及转基因的位置效应。而且通过位点特异重组系统，多个基因可以以有序的方式添加到小染色体上。因此，小染色体的出现提供了解决常规转基因技术存在的问题的有效途径。端粒(tolemere)是染色体末端的DNA重复序列，是染色体末端的一种特殊结构，端粒的功能除保证DNA完整复制外，还在维持染色体结构稳定(保护染色体不分解和染色体重排及末端不相互融合等)。许多多细胞真核生物的端粒序列都已被克隆[6-8]。Farr等将克隆的人类端粒序列导入哺乳动物细胞中验证端粒功能，发现新转入的端粒序列能够在染色体上产生新的端粒[9-10]。目前科学家利用端粒介导截短法和从头染色体诱导合成法成功构建了人类人工染色体，然后通过同源重组等方法向人类人工染色体中插入各种用途的基因序列，现已经用于基因治疗和医疗蛋白的生产[11]。植物的人工染色体较哺乳动物和人类细胞的研究而言起步较晚，无论是基于天然染色体改造的自上而下策略，还是将克隆的染色体功能元件人工组装的自下而上策略在植物的研究中都只是出于起步阶段。在植物中，利用自下而上策略第一个微小染色体的成功报道是在玉米，Carlson等[12]在体外将标记基因筛选基因及着丝粒重复序列连接成环，重组载体不含端粒序列，但是可以在细胞中完成微小染色体的组装，由于它不含有端粒结构，能否作为一种稳定的载体系统还有待研究。Ananiev等[13]将玉米的着丝粒序列、端粒序列及选择标记基因等在体外连接，通过粒子轰击的方法导入宿主细胞中，最终组装成为微小染色体。Yu等[14，15]利用含有2.6kb的拟南芥端粒序列载体成功的将截短法应用在B染色体和四倍体玉米中的A染色体，截短的染色体对玉米的生长发育没有明显影响。这是端粒介导的染色体截断技术在植物中的首次报道，也为植物人工染色体的成功应用奠定了基础。Chee等[16]同样的利用端粒介导的染色体截短法在拟南芥中成功的获得截短的稳定遗传的小染色体，研究发现四倍体的Wa-I的转化效率要高于二倍体的Col-Ο，这可能是由于多倍体的植株更能忍受截短染色体给基因组带来的冲击。小麦是六倍体，也是重要的粮食作物，考虑到植物物种间的差异，采用端粒重复序列能否在小麦中构建人工染色体尚不清楚。目前小麦人工染色体的研究尚未见报道。因此，本领域需要研究用于在小麦中创建稳定遗传的人工小染色体的方法以及该方法进一步的应用。
发明内容本发明通过将含有拟南芥端粒序列的植物载体转化小麦，而在小麦中发生端粒介导的染色体的切割，进而获得小麦人工小染色体。本研究证明了2.6kb的拟南芥端粒序列重复对于小麦中端粒介导的染色体的切割是高效的，可以通过这一技术获得小麦人工体以及带有小染色体的转基因小麦工程株，利于对其进行进一步转多基因改造。因此，本发明一方面提供在小麦中创建人工小染色体的方法，所述方法包括用含有拟南芥端粒重复序列的载体转化小麦，所述拟南芥端粒重复序列在小麦中导致端粒介导的染色体的切割。本发明另一方面提供对创建的人工小染色体进行检测的方法，其中利用荧光原位杂交技术和/或双色荧光原位杂交技术检测转化植株的染色体切割。本发明还一方面提供产生转基因小麦的方法，所述方法包括用含有拟南芥端粒重复序列的载体转化小麦，所述拟南芥端粒重复序列在小麦中导致端粒介导的染色体的切割。在本发明的方法中，优选地采用通过基因枪轰击法进行转化。在本发明的一个实施方案中，获得带有小麦人工小染色体的转基因小麦工程株，进一步对其进行转基因操作，以获得转基因小麦新种质。所述转基因操作包括转多基因操作，从而获得具有特殊性状或者可以合成特殊代谢产物，但并不影响常染色体传递以及植物正常性状的转基因小麦新种质。本发明还一方面涉及小麦育种的方法，所述方法包括根据本发明的方法在小麦中创建人工小染色体的步骤。在创建获得人工小染色体后，本领域技术人员可以根据需要进一步对其进行转基因操作，所述转基因操作包括转多基因操作，从而获得具有特殊性状或者可以合成特殊代谢产物，但并不影响常染色体传递以及植物正常性状的转基因小麦新品种。在本发明的一个实施方案中，所述载体优选地包含与拟南芥端粒重复序列连接的Ubiquitin启动子。在本发明的一个优选实施方案中，所用的拟南芥端粒重复序列为SEQIDN0:4所示的序列。如本领域技术人员所知，本发明的方法适用于各种小麦，包括普通六倍体小麦，如陇春23。在本发明的一个实施方案中，所述载体优选地为PWY86-UBI载体，含有本发明的质粒pWY86_UBI的根癌土壤杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)JV3101-pffY86-UBI已经在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏，保藏日期为2012年I月11日，保藏编号为CGMCCNo.5708。在本发明的一个优选实施方案中，所述转化采用小麦的幼胚进行转化。本发明还涉及通过本发明的方法创建的人工小染色体。因此，具体而言，本发明提供了带有端粒重复序列的植物载体PWY86-UBI，其用于小麦转化时可以在小麦中发生端粒介导的染色体的切割，进而获得小麦小染色体和带有小染色体的转基因小麦工程株。本发明的还提供了在小麦中获得人工小染色体的方法，该方法包括pWY86-UBI载体转化植物组织，将转化的植物组织培育成植株。所述的转化可通过基因枪轰击法进行。本发明还提供了对所获得的小麦中的小染色体进行检测的方法。可以利用荧光原位杂交技术和/或双色荧光原位杂交技术检测转化植株的染色体切割。本发明也提供了带有小麦人工小染色体的转基因小麦工程株，可以利用其进行进一步的转多基因操作，获得具有特殊性状或者可以合成特殊代谢产物，但并不影响常染色体传递以及植物正常性状的转基因小麦新种质。本发明的方法在小麦中构建的人工小染色体在有丝分裂中能够稳定存在，利用这些因染色体的切割而产生的小染色体可以容易地进行基因转化等后续操作。图I.pffY86-UBI的酶切电泳图(泳道I:Direct_loadStarMarkerPlus(D2000Plus)Marker;泳道2pffY86-UBI质粒的HindIII酶切结果；泳道4pffY86-5质粒的HindIII酶切对照；图2.pffY86-UBI的质粒示意图3:图3a和图3b.转基因植株T0-3-18；图4:图4a和图4b.转基因植株T0-3-24。生物材料的保藏信息含有本发明的质粒pWY86_UBI的根癌土壤杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)JV3101-pffY86-UBI已经在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏，保藏日期为2012年I月11日，保藏编号为CGMCCNo.5708，该保藏单位的地址为北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所具体实施方式实施例一·pffY86-UBI载体的改造I.pWY86-UBI的获得(I)用PWY86质粒(参见参考文献[15])转化大肠杆菌，挑取部分转化子提质粒，同时，设计引物(pUbi-AHF/Nost-AHR，见SEQIDNo:1和2)扩增pUBI-Bar-Tnos与pEASY-T载体(购自北京全式金公司)相连接，同时引入了Avrll/Hindlll酶切位点。Ubiquitin启动子是一个在单子叶植物中有较强表达的启动子，PWY86与T-pUBI-Bar-Tnos同时进行AvrII单酶切(购自NEB公司)，T4DNA酶连接(购自TAKALA公司)，连接后的载体HindIII单酶切检测，表明连接成功(图I)。pUBI-Bar-Tnos序列见SEQIDNo:3。本实施例中所用的拟南芥端粒重复序列见SEQIDNo:4。(2)获得改造好的PWY86-UBI，作为小麦人工小染色体制备的起始载体(图2)。含有质粒pWY86_UBI的根癌土壤杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)JV3101-pffY86-UBI已经在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏，保藏日期为2012年I月11日，保藏编号为CGMCCNo.5708。二.pffY86-UBI载体通过基因枪遗传转化春小麦品种陇春23将含有端粒序列的PWY86-UBI载体进行基因枪遗传转化，春小麦品种陇春23用于基因枪转化的受体。(I)供试的春小麦品种为陇春23。开花授粉后13-14天从受体小麦陇春23植株(生长期间温度条件18_28°C)取未成熟种子(幼胚大小L0-1.2mm)，用70%酒精表面消毒1-2分钟。15-20%次氯酸钠灭菌15分钟，无菌水冲洗4-5次。作为组织培养和遗传转化的起始材料。(2)用手术刀切去胚尖，挑出幼胚后盾片向上接种在SD2(MS+3.0%庶糖+1.Omg/LVB1+2.0mg/L2，4-D+150mg/L天门冬酰胺，pH5.8)培养基上。25°C黑暗条件下培养7天诱导愈伤组织。(3)将预培养7天的小麦幼胚愈伤组织转移到MS+3.O%蔗糖+0.2M甘露+1.Omg/LVB1+2.0mg/L2,4-D+150mg/L天门冬酰胺，pH5.8培养基上高渗处理4-6小时。(4)基因枪轰击(IIOOpsi，每枪DNA用量Iμg，金粉用量60μg)后继续在高渗处理16-18小时，然后转回到愈伤组织诱导培养基上，25°C黑暗条件下预培养14天诱导胚性愈伤组织。(质粒浓度为ιμg/ui)(5)将胚性愈伤组织转移到1/2MS+0.5mg/LVBl+0.25mg/LVB6+0.25mg/L烟酸+1.Omg/L甘氛酸+50mg/L肌醇+2.O%鹿糖+5.0mg/LZT+2_5mg/LBialophs筛选2-3次(pH5.8)培养基上，25°C光照条件下分化筛选。(6)将抗性再生芽转移到1/2MS+0.5mg/LVBl+0.25mg/LVB6+0.25mg/L烟酸+1.Omg/L甘氨酸+50mg/L肌醇+2.O%鹿糖+0.3mg/LIAA+0.5mg/LMET(多效唑)培养基上(pH5.8)，25°C光照条件下壮苗。三.在小麦转基因株系中染色体的切割的检测I.利用荧光原位杂交技术检测转基因是否发生转化的植株中，为了检测转基因是否发生，利用pWY96[ll]探针杂交Ttl转基因植株(T0-3-18，T0-3-24，)根尖中期染色体，pWY96包含pWY86除去2.6kb端粒序列的其它序列，荧光原位杂交方法参照AkioKato等所设计的方案进行[13]，结果显示，杂交信号多位于染色体的末端区域(图3a，4a)。2.利用双色荧光原位杂交技术检测转化植株的染色体切割我们对有转基因信号的同一个细胞进行双色荧光原位杂交来定位截短的染色体，所用到的质粒为PAsl和pScll9.2[17]，结果显示在T0-3-18中，发现转基因信号位于IA染色体，染色体与正常IA染色体比较明显发生了截短。而在T0-3-24中，含转基因信号的3D染色体发生了明显的截短，而含有转基因信号的5A染色体没有发生截短，在有丝分裂中能够稳定存在。利用这些因染色体的切割而产生的小染色体可以容易地进行基因转化等后续操作(图3b，4b)。参考文献[I]谭向红.21世纪初基因工程现状与发展趋势.四川农业大学学报，2002，20:162-171.TanXH.Currentsatusanddevelopingtendencyofgeneticengineeringinthe21century.JournalofSichuanAgriculturalUniversity,2002,20162-171.(inChinese)[2]李红梅，王林，陈娟.植物基因工程的应用与展望.玉溪师范学院学报，2006，2287-90.LiHMiWangLiChenJ.Applianceandprospectofvegetablegeneproject.JournalofYuxiTeachersCollege，2006，22:87_90.(inChinese)[3]YuW，HanFiBirchlerJA.Engineeredminichromosomesinplants.CurrentOpinioninBiotechnology，2007，18:425_431.[4]李晨，闫晓红，杨洁，杨清，魏文辉.植物人工染色体下一代基因工程的载体.中国农业科学，2011，44(4)[5]YuW，HanF，GaoZ，VegaJM，BirchlerJA.Constructionandbehaviorofengineeredminichromosomesinmaize.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUSA，2007，104:8924_8929.[6]RichardsEJ，AusubelFMisolationofahighereukaryotictelomerefromArabidopsisthaliana.Cell1988，53:127_136[7]CrossSH,AllshireRC，McKaySJ，McGillNI，CookeHJCloningofhumantelomeresbycomplementationinyeast.Nature1989，338:771_774[8]BrownWRMolecularcloningofhumantelomeresinyeast.Nature1989，338774-776[9]FarrC，FantesJ，GoodfellowP，CookeHFunctionalreintroductionofhumantelomeresintomammaliancells.ProcNatlAcadSciUSA1991，88:7006_7010[10]BarnettMA,BuckleVJ,EvansEP,PorterAC，RoutD，SmithAG，BrownWRTelomeredirectedfragmentationofmammalianchromosomes.NucleicAcidsRes1993，2127-36[II]DuncanA，HadlaczkyG.Chromosomalengineering.CurrOpinBiotechnol，2007，18(5)420-424.[D0I][12]CarlsonSR，RudgersGW,ZielerH，MachJM，LuoS，GrundenE，KrolC，CopenhaverGP，PreussD.Meiotictransmissionofaninv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