专利名称：一种与原发性肺癌辅助诊断相关的snp标志物及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于基因工程及肿瘤医学领域，涉及一种与原发性肺癌辅助诊断相关的 SNP标志物及其应用。
背景技术：
肺癌是目前全球受累人数最多的恶性肿瘤。据国际癌症研究署(IARC)估计， 2008年肺癌新发病例160. 7万人，死亡137. 5万人，位居全球范围内肿瘤发病率和死亡率的首位。由于持续增长的烟草消费、环境污染以及生活方式的改变，近二十年来，我国肺癌发病和死亡一直呈上升趋势，仅2000年至2005年间，中国肺癌的发病人数和因肺癌死亡的人数分别增加了 12万和10万，据估计，2008年我国男性肺癌发病率为45. 9/10万，女性为21. 3/10万，高于世界的平均水平并接近发达的工业化国家水平。英国著名肿瘤学家 R. Peto预言如果中国不及时控制吸烟和空气污染，到2025年我国每年肺癌将超过100 万，成为世界第一肺癌大国。由此可见，肺癌是威胁全球及我国居民生命和健康的重要疾病之一，是亟待解决的重大公共卫生问题。自20世纪60年代Dol 1和Hi 11通过病例-对照研究和队列研究首次发现吸烟与肺癌的关系以来，烟草暴露已经被认为是肺癌发生的最主要环境危险因素。研究表明，吸烟者发生肺癌的风险可比非吸烟者高出10倍。肺癌家庭聚集性的研究显示，遗传因素在肺癌的发生中同样扮演重要角色。双生子研究表明，肺癌是遗传与环境共同作用的结果。流行病学研究表明，80%以上的肺癌可以归咎为烟草暴露，但仅有不到20%的吸烟者发生肺癌， 说明在同等环境暴露下，具有不同遗传背景的个体对肺癌的易感性不同。其中单核苷酸多态(single nucleotide polymorphism, SNP)起重要作用。SNP是一类基于单碱基变异引起的DNA多态性，被遗传学界称为第三代遗传标记。 主要是指由基因组核苷酸水平上的变异引起的DNA序列多态性，包括单碱基转换、颠换，以及单碱基的插入/缺失等。它是基因组中最为广泛存在的一类多态性标记，占大约90%。 这些基因组序列变异可以导致个体间表型的差异以及不同个体对疾病，特别是复杂疾病的易感性和对环境因素、药物反应的差异。因此SNP可能是导致个体对常见疾病发病和预后易感性差异的重要遗传基础。利用疾病易感的SNP谱预测疾病的发生，不仅灵敏、准确和快速，具有广阔的应用前景，而且通过SNP预测谱的构建，还可以对疾病作出前瞻性的诊断。 近年来，利用SNP预测疾病的发生发展已经成为临床和科研工作者的研究热点，在肿瘤和心脑血管疾病等常见重大疾病预测上的应用价值已初见端倪。然而，目前还没有将SNP应用于原发性肺癌诊断的报道，若能筛选出原发性肺癌易感的SNP作为生物标志物，并研制相应的诊断试剂盒，对我国原发性肺癌诊断现状必将是一次有力的推动，也为其药物筛选、药效评价及靶向治疗开辟了新的途径。
发明内容
本发明的目的是针对上述技术问题，提出一种与原发性肺癌辅助诊断相关的SNP标志物及其应用。本发明的第二个目的是提供上述SNP标志物的特异性引物。本发明的第三个目的是提供上述SNP标志物的特异性荧光探针对。本发明的第四个目的是提供上述SNP标志物及其特异性引物和特异性荧光探针在制备原发性肺癌辅助诊断试剂盒中的应用。本发明第五个目的是提供原发性肺癌辅助诊断试剂盒。发明人通过分离和研究原发性肺癌患者及与其年龄匹配的健康对照外周血DNA 中的单核苷酸多态性，寻找一组与原发性肺癌高度相关的高特异性和敏感性的SNP，并研制出可便于临床应用的原发性肺癌辅助诊断试剂盒，为原发性肺癌的筛查和诊断提供数据支持，为发现具有潜在治疗价值的新型小分子药物提供数据支持。本发明的目的是通过下列技术方案实现的一种与原发性肺癌辅助诊断相关的SNP标志物，该标志物为rsl07401、rs465498、 rs663414、rs622917、rs636586、rs741061、rs855641、rs948783、rsl544694、rsl663689、 rs2030378、 rs2225588、 rs2317683、 rs2395166、 rs2405271、 rs2788713、 rs3130975、 rs4344933、 rs4488809、 rs4493136、 rs4669621、 rs4697406、 rs4749794、 rs4809957、 rs6102795、rs6490820、rs9317873、rs9373105、rs9397087、rs9463490、rsl0066153、 rslll44475、rslll55286、rsll264579、rsll907465、rsl2050469、rsl2992554、rsl3000907、 rsl6883398、rsl6959825、rsl7058190、rsl7075390、rsl7728461、rsl014588、rsl039119、 rsl726744、rs2285947、rs2895680、rs3969178、rs4693311、rs4766994、rs4894545、 rs4940849、rs6490294、rs6780858、rs9439527、rs9556016、rsl2002185、rsl2793370、 rsl549058、rs2736100、rs6043705 和 rsll699642 的组合。所述的SNP标志物的特异性引物，这些引物为rsl07401 的引物序列为 SEQ ID No:liPSEQ ID No :2 ;rs465498 的引物序列为 SEQID No 5 和 SEQ ID No 6 ；rs663414 的引物序列为 SEQ ID No 9 和 SEQ ID No 10 ； rs622917 的引物序列为 SEQ ID No:13 禾口 SEQ ID No :14 ;rs636586 的引物序列为 SEQID No: 17 禾口 SEQ ID No :18 ;rs741061 的引物序列为 SEQ ID No :21 禾口 SEQ ID No 22 ；rs855641 的引物序列为SEQ ID No 25和SEQ ID No 26 ；rs948783的引物序列为SEQID No 29和 SEQ ID No 30 ；rsl544694 的引物序列为 SEQ ID No :33 禾口 SEQ ID No 34 ；rsl663689 的引物序列为 SEQ ID No:37 和 SEQ ID No :38 ;rs2030378 的引物序列为 SEQID No :41 和 SEQ ID No 42 ；rs2225588 的引物序列为 SEQ ID No 45 和 SEQ ID No 46 ；rs2317683 的引物序列为 SEQ ID No 49 和 SEQ ID No 50 ；rs2395166 的引物序列为 SEQID No 53 和 SEQ ID No 54 ；rs2405271 的引物序列为 SEQ ID No 57 和 SEQ ID No 58 ；rs2788713 的引物序列为 SEQ ID No 61 和 SEQ ID No 62 ；rs3130975 的引物序列为 SEQID No 65 和 SEQ ID No 66 ；rs4344933 的引物序列为 SEQ ID No 69 和 SEQ ID No 70 ；rs4488809 的引物序列为 SEQ ID No:73 和 SEQ ID No :74 ;rs4493136 的引物序列为 SEQ ID No 77 和 SEQ ID No: 78 ；rs4669621 的引物序列为 SEQ ID No 81 和 SEQ IDNo 82 ；rs4697406 的引物序列为 SEQ ID No:85 和 SEQ ID No :86 ;rs4749794 的引物序列为 SEQ ID No 89 和 SEQ ID No 90 ； rs4809957 的引物序列为 SEQ ID No 93 和 SEQ ID No 94 ；rs6102795 的引物序列为 SEQ ID No 97 和 SEQ ID No 98 ；rs6490820 的引物序列为 SEQ ID No :101 和 SEQ ID No :102 ；
8rs9317873 的引物序列为 SEQ IDNo :105 和 SEQ ID No :106 ;rs9373105 的引物序列为 SEQ ID No :109 和 SEQ IDNo :110 ；rs9397087 的引物序列为 SEQ ID No :113 和 SEQ ID No :114 ； rs946;3490 的引物序列为 SEQ ID No :117 和 SEQ ID No :118 ；rsl0066153 的引物序列为 SEQ IDNo :121 禾口 SEQ ID No :122 ；rsl 1144475 的引物序列为 SEQ ID No :125 和 SEQ IDNo :126 ； rslll55^6 的引物序列为 SEQ ID No :129 禾口 SEQ ID No :130 ;rsll264579 的引物序列为 SEQ ID No :133 和 SEQ ID No :134 ;rsll907465 的引物序列为 SEQ IDNo :137 和 SEQ ID No: 138 ；rsl2050469 的引物序列为 SEQ ID No :141 和 SEQ IDNo :142 ；rsl2992554 的引物序列为 SEQ ID No :145 和 SEQ ID No :146 ；rsl3000907 的引物序列为 SEQ ID No :149 禾口 SEQ ID No 150 ；rsl6883398 的引物序列为 SEQ IDNo :153和 SEQ ID No 1 ;rsl6959825 的引物序列为 SEQ ID No :157和 SEQ IDNo :158 ；rsl7058190 的引物序列为 SEQ ID No :161 和 SEQ ID No 162 ；rsl7075390 的引物序列为 SEQ ID No :165 和 SEQ ID No :166 ；rsl7728461 的引物序列为 SEQ IDNo 169 和 SEQ ID No :170 ；rsl014588 的引物序列为 SEQ ID No :173 和 SEQ IDNo :174 ;rsl039119 的引物序列为 SEQ ID No :177 和 SEQ ID No :178 ；rsl726744 的引物序列为 SEQ ID No :181 和 SEQ ID No :182 ；rs2^5947 的引物序列为 SEQ ID No :185 和 SEQ ID No 186 ；rs2895680 的引物序列为 SEQ ID No :189和 SEQ ID No :190 ；rs3969178 的引物序列为 SEQ ID No :193 和 SEQ ID No :194 ；rs4693311 的引物序列为 SEQ ID No :197 和 SEQ ID No 198 ；rs4766994 的引物序列为 SEQ ID No :201 和 SEQ IDNo :202 ；rs4894545 的引物序列为 SEQ ID No :205 和 SEQ ID No :206 ；rs4940849 的引物序列为 SEQ ID No :209 和 SEQ ID No 210 ；rs6490294 的引物序列为 SEQ ID No :213 和 SEQ ID No :214 ；rs6780858 的引物序列为 SEQ ID No 217 和 SEQ ID No :218 ；rs9439527 的引物序列为 SEQ ID No :221 和 SEQ ID No 222 ；rs9556016 的引物序列为 SEQ ID No :225 和 SEQ ID No :226 ；rsl2002185 的引物序列为 SEQ ID No :229 和 SEQID No :230 ；rsl2793370 的引物序列为 SEQ ID No :233 和 SEQ ID No 234 ；rsl549058 的引物序列为 SEQ ID No :237 和 SEQ ID No :238 ；rs2736100 的引物序列为 SEQ IDNo 241 和 SEQ ID No :242 ；rs6043705 的引物序列为 SEQ ID No :245 和 SEQ IDNo 246 ；rsll699642 的引物序列为 SEQ ID No :249 和 SEQ ID No :250。所述的SNP标志物的特异性荧光探针对，这些荧光探针为rsl07401的荧光探针对序列为SEQ ID No :3和SEQ ID No 4 ；rs465498的荧光探针对序列为SEQ ID No :7和SEQ ID No :8 ;rs663414的荧光探针对序列为SEQ ID No:ll禾口 SEQ ID No 12 ；rs622917 的荧光探针对序列为 SEQ ID No 15 和 SEQ ID No 16 ；rs636586 的荧光探针对序列为SEQ ID No:19和SEQ ID No 20 ；rs741061的荧光探针对序列为SEQ ID No 23 和 SEQ ID No 24 ；rs855641 的荧光探针对序列为 SEQ ID No 27 和 SEQ ID No 28 ； rs948783的荧光探针对序列为SEQ ID No 31和SEQ ID No 32 ；rsl544694的荧光探针对序列为SEQ ID No 35和SEQ ID No 36 ；rsl663689的荧光探针对序列为SEQ ID No 39和 SEQ ID No 40 ；rs2030378 的荧光探针对序列为 SEQ ID No :43 和 SEQ IDNo 44 ；rs2225588 的荧光探针对序列为SEQ ID No:47和SEQ ID No 48 ；rs2317683的荧光探针对序列为SEQ ID No 51 和 SEQ ID No 52 ；rs2395166 的荧光探针对序列为 SEQ IDNo 55 和 SEQ ID No 56 ；rs2405271的荧光探针对序列为SEQ ID No 59和SEQ ID No 60 ；rs2788713的荧光探针对序列为SEQ ID No 63和SEQ ID No 64 ；rs3130975的荧光探针对序列为SEQ ID No 67 和 SEQ ID No :68 ;rs4344933 的荧光探针对序列为 SEQ ID No :71 和 SEQ ID No 72 ；rs4488809的荧光探针对序列为SEQ ID No:75和SEQ ID No 76 ；rs4493136的荧光探针对序列为SEQ ID No 79和SEQ ID No 80 ；rs4669621的荧光探针对序列为SEQ ID No 83和 SEQ ID No 84 ；rs4697406 的荧光探针对序列为 SEQ IDNo :87 和 SEQ ID No 88 ；rs4749794 的荧光探针对序列为SEQ ID No:91和SEQ ID No 92 ；rs4809957的荧光探针对序列为SEQ ID No 95 和 SEQ ID No 96 ；rs6102795 的荧光探针对序列为 SEQ ID No 99 和 SEQ ID No 100 ；rs6490820 的荧光探针对序列为 SEQ IDNo :103 和 SEQ ID No :104 ；rs9317873 的荧光探针对序列为SEQ ID No 107和SEQ IDNo :108 ；rs9373105的荧光探针对序列为SEQ ID No :111 和 SEQ ID No :112 ;rs9397087 的荧光探针对序列为 SEQ ID No :115 和 SEQ ID No: 116 ；rs9463490 的荧光探针对序列为 SEQ ID No :119禾口 SEQ ID No :120 ；rsl0066153 的荧光探针对序列为SEQ ID No :123和SEQ ID No 124 ；rsl 1144475的荧光探针对序列为SEQ ID No :127和 SEQ ID No 128 ；rsl 1155286 的荧光探针对序列为 SEQ ID No :131 和 SEQ ID No 132 ；rsll264579 的荧光探针对序列为 SEQ ID No :135 和 SEQ ID No :136 ；rsll907465 的荧光探针对序列为SEQID No :139和SEQ ID No :140 ；rsl2050469的荧光探针对序列为SEQ ID No :143 和 SEQ IDNo :144 ；rsl2992554 的荧光探针对序列为 SEQ ID No :147 和 SEQ ID No 148 ；rsl3000907 的荧光探针对序列为 SEQ ID No :151 和 SEQ ID No :152 ；rsl6883398 的荧光探针对序列为SEQ ID No 155和SEQ ID No :156 ；rsl6959825的荧光探针对序列为SEQ ID No :159 禾口 SEQ ID No :160 ；rsl7058190 的荧光探针对序列为 SEQ ID No :163 和 SEQ ID No 164 ；rsl7075390 的荧光探针对序列为 SEQ ID No :167 和 SEQ ID No :168 ；rsl7728461 的荧光探针对序列为SEQ ID No :171和SEQ ID No :172 ;rsl014588的荧光探针对序列为 SEQID No :175 和 SEQ ID No :176 ;rsl039119 的荧光探针对序列为 SEQ ID No :179 禾口 SEQ IDNo 180 ；rsl726744 的荧光探针对序列为 SEQ ID No :183 和 SEQ ID No :184 ；rs2285947 的荧光探针对序列为SEQ ID No :187和SEQ ID No :188 ;rs2895680的荧光探针对序列为 SEQ ID No 191 和 SEQ ID No :192 ；rs3969178 的荧光探针对序列为 SEQ ID No :195 和 SEQ ID No 196 ；rs4693311 的荧光探针对序列为 SEQ ID No :199 和 SEQ ID No :200 ；rs4766994 的荧光探针对序列为SEQ ID No :203和SEQ ID No :204 ;rs4894545的荧光探针对序列为 SEQ ID No :207 和 SEQ ID No :208 ；rs4940849 的荧光探针对序列为 SEQ IDNo :211 和 SEQ ID No 212 ；rs6490294 的荧光探针对序列为 SEQ ID No :215 和 SEQ IDNo :216 ；rs6780858 的荧光探针对序列为SEQ ID No :219和SEQ ID No :220 ；rs9439527的荧光探针对序列为SEQ ID No 223 和 SEQ ID No :224 ；rs9556016 的荧光探针对序列为 SEQ ID No :227 和 SEQ ID No 228 ；rsl2002185 的荧光探针对序列为 SEQ ID No :231 和 SEQ ID No :232 ；rsl2793370 的荧光探针对序列为SEQ ID No :235和SEQ ID No :236 ;rslM9058的荧光探针对序列为 SEQ ID No :239 禾口 SEQ ID No :240 ；rs2736100 的荧光探针对序列为 SEQ ID No :243 禾口 SEQ ID No 244 ；rs6043705 的荧光探针对序列为 SEQ IDNo :247 和 SEQ ID No :248 ；rsll699642 的荧光探针对序列为SEQ ID No 251和SEQ IDNo :252。所述的SNP标志物在制备原发性肺癌辅助诊断试剂盒中的应用。所述的SNP标志物的特异性引物在制备原发性肺癌辅助诊断试剂盒中的应用。所述的SNP标志物的特异性荧光探针对在制备原发性肺癌辅助诊断试剂盒中的应用。一种原发性肺癌辅助诊断试剂盒，该试剂盒用于检测外周血DNA中rsl07401、rs465498、rs663414、rs622917、rs636586、rs741061、rs855641、rs948783、rsl544694、 rsl663689、 rs2030378、 rs2225588、 rs2317683、 rs2395166、 rs2405271、 rs2788713、 rs3130975、 rs4344933、 rs4488809、 rs4493136、 rs4669621、 rs4697406、 rs4749794、 rs4809957、 rs6102795、 rs6490820、 rs9317873、 rs9373105、 rs9397087、 rs9463490、 rsl0066153、rslll44475、rslll55286、rsll264579、rsll907465、rsl2050469、rsl2992554、 rsl3000907,rsl6883398、rsl6959825、rsl7058190、rsl7075390,rsl7728461、rsl014588、 rsl039119、rsl726744、rs2285947、rs2895680、rs3969178、rs4693311、rs4766994、 rs4894545、rs4940849、rs6490294、rs6780858、rs9439527、rs9556016、rsl2002185、 rsl2793370、rsl549058、rs2736100、rs6043705 和 rsll699642。所述的诊断试剂盒，该试剂盒含有上述SNP标志物的特异性引物和/或特异性荧光探针。所述的诊断试剂盒，该试剂盒含有的SNP标志物的特异性引物为rsl07401 的引物序列为 SEQ ID No :1 和 SEQ ID No :2 ;rs465498 的引物序列为 SEQID No 5 和 SEQ ID No 6 ；rs663414 的引物序列为 SEQ ID No 9 和 SEQ ID No 10 ； rs622917 的引物序列为 SEQ ID No:13 和 SEQ ID No :14 ;rs636586 的引物序列为 SEQID No: 17 禾口 SEQ ID No :18 ;rs741061 的引物序列为 SEQ ID No :21 禾口 SEQ ID No 22 ；rs855641 的引物序列为SEQ ID No:25和SEQ ID No :26 ;rs948783的引物序列为SEQID No丨9和 SEQ ID No 30 ；rsl544694 的引物序列为 SEQ ID No :33 禾口 SEQ ID No 34 ；rsl663689 的引物序列为 SEQ ID No:37 和 SEQ ID No :38 ;rs2030378 的引物序列为 SEQID No :41 和 SEQ ID No :42 ;rs2225588 的引物序列为 SEQ ID No 45 和 SEQ ID No :46 ;rs2317683 的引物序列为 SEQ ID No 49 和 SEQ ID No 50 ；rs2395166 的引物序列为 SEQID No 53 和 SEQ ID No 54 ；rs2405271 的引物序列为 SEQ ID No 57 和 SEQ ID No 58 ；rs2788713 的引物序列为 SEQ ID No 61 和 SEQ ID No 62 ；rs3130975 的引物序列为 SEQID No 65 和 SEQ ID No 66 ；rs4344933 的引物序列为 SEQ ID No 69 和 SEQ ID No 70 ；rs4488809 的引物序列为 SEQ ID No:73 和 SEQ ID No :74 ;rs4493136 的引物序列为 SEQ ID No 77 和 SEQ ID No: 78 ；rs4669621 的引物序列为 SEQ ID No 81 和 SEQ IDNo 82 ；rs4697406 的引物序列为 SEQ ID No:85 和 SEQ ID No :86 ;rs4749794 的引物序列为 SEQ ID No 89 和 SEQ ID No 90 ； rs4809957 的引物序列为 SEQ ID No 93 和 SEQ ID No 94 ；rs6102795 的引物序列为 SEQ ID No 97 和 SEQ ID No 98 ；rs6490820 的引物序列为 SEQ ID No :101 和 SEQ ID No :102 ； rs9317873 的引物序列为 SEQ IDNo :105 和 SEQ ID No :106 ;rs9373105 的引物序列为 SEQ ID No :109 禾口 SEQ IDNo :110 ；rs9397087 的引物序列为 SEQ ID No :113 和 SEQ ID No :114 ； rs946;3490 的引物序列为 SEQ ID No :117 和 SEQ ID No :118 ；rsl0066153 的引物序列为 SEQ IDNo :121 禾口 SEQ ID No :122 ；rslll44475 的引物序列为 SEQ ID No :125 和 SEQ IDNo :126 ； rslll55^6 的引物序列为 SEQ ID No :129 禾口 SEQ ID No :130 ;rsll264579 的引物序列为 SEQ ID No :133 和 SEQ ID No :134 ;rsll907465 的引物序列为 SEQ IDNo :137 和 SEQ ID No: 138 ；rsl2050469 的引物序列为 SEQ ID No :141 和 SEQ IDNo :142 ；rsl2992554 的引物序列为 SEQ ID No :145 和 SEQ ID No :146 ；rsl3000907 的引物序列为 SEQ ID No :149 禾口 SEQ ID No 150 ；rsl6883398 的引物序列为 SEQ IDNo :153和 SEQ ID No :154 ；rsl6959825 的引物序列为 SEQ ID No :157和 SEQ IDNo :158 ；rsl7058190 的引物序列为 SEQ ID No :161 和 SEQ IDNo 162 ；rsl7075390 的引物序列为 SEQ ID No :165 和 SEQ ID No :166 ；rsl7728461 的引物序列为 SEQ IDNo 169 和 SEQ ID No :170 ；rsl014588 的引物序列为 SEQ ID No :173 和 SEQ IDNo 174 ；rsl039119 的引物序列为 SEQ ID No :177 禾Π SEQ ID No :178 ；rsl726744 的引物序列为 SEQ ID No :181 和 SEQ ID No :182 ；rs2^5947 的引物序列为 SEQ ID No :185 和 SEQ ID No 186 ；rs2895680 的引物序列为 SEQ ID No :189和 SEQ ID No :190 ；rs3969178 的引物序列为 SEQ ID No :193 和 SEQ ID No :194 ；rs4693311 的引物序列为 SEQ ID No :197 禾口 SEQ ID No 198 ；rs4766994 的引物序列为 SEQ ID No :201 和 SEQ IDNo :202 ；rs4894545 的引物序列为 SEQ ID No :205 和 SEQ ID No :206 ；rs4940849 的引物序列为 SEQ ID No :209 禾口 SEQ ID No 210 ；rs6490294 的引物序列为 SEQ ID No :213 和 SEQ ID No :214 ；rs6780858 的引物序列为 SEQ ID No 217 和 SEQ ID No :218 ；rs9439527 的引物序列为 SEQ ID No :221 和 SEQ ID No 222 ；rs9556016 的引物序列为 SEQ ID No :225 和 SEQ ID No :226 ；rsl2002185 的引物序列为 SEQ ID No :229 和 SEQID No :230 ；rsl2793370 的引物序列为 SEQ ID No :233 和 SEQ ID No 234 ；rsl549058 的引物序列为 SEQ ID No :237 和 SEQ ID No :238 ；rs2736100 的引物序列为 SEQ IDNo 241 和 SEQ ID No :242 ；rs6043705 的引物序列为 SEQ ID No :245 和 SEQ IDNo 246 ；rsll699642 的引物序列为 SEQ ID No :249 和 SEQ ID No :250。所述的诊断试剂盒，该试剂盒含有的SNP标志物的特异性荧光探针对为rsl07401的荧光探针对序列为SEQ ID No :3和SEQ ID No 4 ；rs465498的荧光探针对序列为SEQ ID No :7和SEQ ID No :8 ;rs663414的荧光探针对序列为SEQ ID No:ll禾口 SEQ ID No 12 ；rs622917 的荧光探针对序列为 SEQ ID No 15 和 SEQ ID No 16 ；rs636586 的荧光探针对序列为SEQ ID No:19和SEQ ID No 20 ；rs741061的荧光探针对序列为SEQ ID No 23 和 SEQ ID No 24 ；rs855641 的荧光探针对序列为 SEQ ID No 27 和 SEQ ID No 28 ； rs948783的荧光探针对序列为SEQ ID No 31和SEQ ID No 32 ；rsl544694的荧光探针对序列为SEQ ID No 35和SEQ ID No 36 ；rsl663689的荧光探针对序列为SEQ ID No 39和 SEQ ID No 40 ；rs2030378 的荧光探针对序列为 SEQ ID No :43 和 SEQ IDNo 44 ；rs2225588 的荧光探针对序列为SEQ ID No:47和SEQ ID No 48 ；rs2317683的荧光探针对序列为SEQ ID No 51 和 SEQ ID No 52 ；rs2395166 的荧光探针对序列为 SEQ IDNo 55 和 SEQ ID No 56 ；rs2405271的荧光探针对序列为SEQ ID No 59和SEQ ID No 60 ；rs2788713的荧光探针对序列为SEQ ID No 63和SEQ ID No 64 ；rs3130975的荧光探针对序列为SEQ ID No 67 和 SEQ ID No :68 ;rs4344933 的荧光探针对序列为 SEQ ID No :71 和 SEQ ID No 72 ； rs4488809的荧光探针对序列为SEQ ID No:75和SEQ ID No 76 ；rs4493136的荧光探针对序列为SEQ ID No 79和SEQ ID No 80 ；rs4669621的荧光探针对序列为SEQ ID No 83和 SEQ ID No 84 ；rs4697406 的荧光探针对序列为 SEQ IDNo :87 和 SEQ ID No 88 ；rs4749794 的荧光探针对序列为SEQ ID No:91和SEQ ID No 92 ；rs4809957的荧光探针对序列为SEQ ID No :95 禾口 SEQ ID No 96 ；rs6102795 的荧光探针对序列为 SEQ ID No :99 禾口 SEQ ID No 100 ；rs6490820 的荧光探针对序列为 SEQ IDNo :103 和 SEQ ID No :104 ；rs9317873 的荧光探针对序列为SEQ ID No :107和SEQ IDNo :108 ;rs9373105的荧光探针对序列为SEQ ID No :111 和 SEQ ID No :112 ;rs9397087 的荧光探针对序列为 SEQ ID No :115 和 SEQ ID No: 116 ；rs946;3490 的荧光探针对序列为 SEQ ID No :119和 SEQ ID No :120 ；rsl0066153 的荧光探针对序列为SEQ ID No :123和SEQ ID No :124 ；rsl 1144475的荧光探针对序列为SEQ IDNo :127 和 SEQ ID No 128 ；rslll55286 的荧光探针对序列为 SEQ ID No :131 和 SEQ ID No: 132 ；rsll264579 的荧光探针对序列为 SEQ ID No :135和 SEQ ID No :136 ；rsll907465 的荧光探针对序列为SEQID No :139和SEQ ID No :140 ；rsl2050469的荧光探针对序列为SEQ ID No :143 和 SEQ IDNo :144 ;rsU992554 的荧光探针对序列为 SEQ ID No :147 和 SEQ ID No: 148 ；rsl3000907 的荧光探针对序列为 SEQ ID No :151 和 SEQ ID No :152 ；rsl6883398 的荧光探针对序列为SEQ ID No 155和SEQ ID No :156 ；rsl6959825的荧光探针对序列为SEQ ID No :159 禾口 SEQ ID No :160 ；rsl7058190 的荧光探针对序列为 SEQ ID No :163 和 SEQ ID No 164 ；rsl7075390 的荧光探针对序列为 SEQ ID No :167 和 SEQ ID No :168 ；rsl7728461 的荧光探针对序列为SEQ ID No :171和SEQ ID No :172 ;rsl014588的荧光探针对序列为 SEQID No 175 和 SEQ ID No :176 ；rsl039119 的荧光探针对序列为 SEQ ID No :179 和 SEQ IDNo 180 ；rsl726744 的荧光探针对序列为 SEQ ID No :183 和 SEQ ID No :184 ；rs2285947 的荧光探针对序列为SEQ ID No :187和SEQ ID No :188 ;rs2895680的荧光探针对序列为 SEQ ID No 191 和 SEQ ID No :192 ；rs3969178 的荧光探针对序列为 SEQ ID No :195 和 SEQ ID No 196 ；rs4693311 的荧光探针对序列为 SEQ ID No :199 和 SEQ ID No :200 ；rs4766994 的荧光探针对序列为SEQ ID No 203和SEQ ID No :204 ；rs4894545的荧光探针对序列为 SEQ ID No :207 和 SEQ ID No :208 ；rs4940849 的荧光探针对序列为 SEQ IDNo :211 和 SEQ ID No 212 ；rs6490294 的荧光探针对序列为 SEQ ID No :215 和 SEQ IDNo :216 ；rs6780858 的荧光探针对序列为SEQ ID No :219和SEQ ID No :220 ；rs9439527的荧光探针对序列为SEQ ID No 223 和 SEQ ID No :224 ；rs9556016 的荧光探针对序列为 SEQ ID No :227 和 SEQ ID No 228 ；rsl2002185 的荧光探针对序列为 SEQ ID No :231 和 SEQ ID No :232 ；rsl2793370 的荧光探针对序列为SEQ ID No :235和SEQ ID No :236 ;rslM9058的荧光探针对序列为 SEQ ID No :239 禾口 SEQ ID No :240 ；rs2736100 的荧光探针对序列为 SEQ ID No :243 禾口 SEQ ID No 244 ；rs6043705 的荧光探针对序列为 SEQ IDNo :247 和 SEQ ID No :248 ；rsl 1699642 的荧光探针对序列为SEQ ID No 251和SEQ IDNo :252。所述诊断试剂盒，该试剂盒还可以包括PCR反应常用的酶和试剂，如Taq酶、dNTP 混合液、Mgcl2溶液、去离子水等；还可以含有标准品和/或对照品。具体地说，本发明解决问题的技术方案包括(1)建立统一标准的标本库和数据库以标准操作程序(SOP)采集符合标准的血液样本，系统收集完整的人口学资料和临床资料。( 基因型检测选择原发性肺癌病例，与原发性肺癌病例年龄、性别匹配的对照，利用高密度SNP芯片，在全基因组范围内找出与原发性肺癌相关的SNP。(3)对筛选出的阳性关联SNP，进一步在另外的样本中进行检测，以判断其关联的稳定性。(4)原发性肺癌辅助诊断试剂盒的研制根据原发性肺癌病例和健康对照中基因型分布频率有显著差异的SNP 开发SNP辅助诊断试剂盒。本发明人以标准操作程序(SOP)采集符合标准的血液样本，系统收集完整的人口学资料、临床资料等，并采用了 Affymetrixe. O芯片进行全基因组扫描，TaqMan基因分型进行单个位点的检测等。具体来说研究的实验方法主要包括以下几个部分1.研究样本的选择(1)临床确诊为原发性肺癌；
(2)与病例年龄、性别匹配的对照；本研究共采用9934例符合标准的样本进行研究。2.酚-氯仿法提取外周血基因组DNA，按常规方法操作。通常能得到20-50ng/ μ 1DNA,纯度(紫外 2600D 与 2800D 比值)在 1. 6-2. 0。3. Affymetrix 6. 0 芯片检测(1)取受试者全基因组DNA样本；(2)在Affymetrix 6. 0芯片(购于美国昂飞公司，下同)上进行全基因组扫描；(3)检测并比较各基因型在原发性肺癌病例与健康对照中的分别差异。4.单个SNP的TaqMan基因分型(1)取受试者DNA样本；(2)设计单个SNP的特异性引物和特异性荧光探针对；(3)进行 PCR 反应；(4)检测并比较原发性肺癌病例与健康对照中不同基因型的分布差异。5.诊断试剂盒制备方法Affymetrix6. 0芯片进行全基因组扫描和单个SNP检测后确定原发性肺癌病例与健康对照中基因型分布频率有显著差异的SNP，作为原发性肺癌诊断的指标。最后筛选出的与原发性肺癌发病有关的SNP组成辅助诊断试剂盒rsl07401、rs465498、rs663414、 rs622917、rs636586、rs74106U rs855641、rs948783、rsl544694、rsl663689、rs2030378、 rs2225588、 rs2317683、 rs2395166、 rs2405271、 rs2788713、 rs3130975、 rs4344933、 rs4488809、 rs4493136、 rs4669621、 rs4697406、 rs4749794、 rs4809957、 rs6102795、 rs6490820、rs9317873、rs9373105、rs9397087、rs9463490、rsl0066153、rslll44475、 rslll55286、rsll264579、rsll907465、rsl2050469、rsl2992554、rsl3000907、rsl6883398、 rsl6959825、rsl7058190、rsl7075390、rsl7728461、rsl014588、rsl039119、rsl726744、 rs2285947、rs2895680、rs3969178、rs4693311、rs4766994、rs4894545、rs4940849、 rs6490294、rs6780858、rs9439527、rs9556016、rsl2002185、rsl2793370、rsl549058、 rs2736100、rs6043705和rsl 169964 。诊断试剂可以包括这些SNP的特异性引物和特异性荧光探针对，以及Taq酶、dNTP等试剂。6.统计分析方法运用χ 2检验(用于分类变量)或者student检验(用于连续性变量)比较人口学特征等在研究对象组间分布的差异。用logistic回归分析中的additive模型进行关联分析。为了进一步研究这63个SNP构成的综合指征用于早期诊断的效果，我们构建了一个数学公式，综合考虑每个SNP与原发性肺癌发病的正、负关联情况和联系强度。具体来说，我们对每个SNP的三种基因型进行评分，野生纯合型=“0”，杂合型=“1”，变异纯合型=“2”，以单个SNP分析时的additive模型下的回归系数为权重，综合考虑每个 SNP的情况给每个研究研究对照确定一个危险分值。危险分值的计算方法如下危险分值=(-0. 15Xrs9439527 的评分)+ (0. 33Xrsl7728461 的评分)+ (0. 14Xrs2225588 的评分)+ (0. 25Xrs510321 的评分)+ (-0. 12Xrs663414 的评分)+ (0. 14Xrs4669621 的评分)+ (0. 25Xrs6490294 的评分)+ (0. 13Xrs4894545 的评分)+ (0. 14Xrs6780858 的评分)+ (-0. 16Xrs 107401 的评分)+ (-0. 16Xrs 1663689 的评分)+ (0. 16Xrs4697406 的评分)+ (0. 18Xrsl014588 的评分)+ (-0. 13Xrs2405271 的评分)+ (-0. 16Xrs6490820 的评分)+ (-0. 20Xrs9463490 的评分)+ (0. 27Xrs2788713 的评分)+ (0. 22Xrs855641 的评分)+ (-0. 22Xrs3130975 的评分)+ (-0. 16Xrs9397087 的评分)+ (0. 20Xrs622917 的评分)+ (0. 20Xrsl2793370 的评分)+ (0. 14Xrsl 1155286 的评分)+ (0. 15Xrs2285947 的评分)+ (0. 21Xrs2395166 的评分)+ (0. 22Xrs741061 的评分)+ (-0. 17Xrsl7058190 的评分)+ (-0. 17Xrsl 1144475 的评分)+ (-0. 14Xrsl2002185 的评分)+ (0. 16Xrs4749794 的评分)+ (-0. 14Xrsl6883398 的评分)+ (0. 13Xrsl726744 的评分)+ (-0. 17Xrs2030378 的评分)+ (0. 19Xrs2895680 的评分)+ (0. 25Xrs4940849 的评分)+ (-0. 22Xrs3969178 的评分)+ (0. 19Xrs6102795 的评分)+ (-0. 15Xrsl7075390 的评分)+ (0. 14Xrs9317873 的评分)+ (0. 13Xrs9556016 的评分)+ (0. 17Xrs4809957 的评分)+ (-0. 24Xrsl2050469 的评分)+ (0. 14Xrsl6959825 的评分)+ (0. 26Xrs9373105 的评分)+ (0. 12Xrs948783 的评分)+ (-0. 13Xrsl 1907465 的评分)+ (-0. 22Xrs6043705 的评分)+ (0. 16Xrs2317683 的评分)+ (0. 17Xrsl 1264579 的评分)+ (0. 17Xrs636586 的评分)+ (-0. 14Xrsl3000907 的评分)+ (-0. 17Xrsl544694 的评分)+ (0. 25Xrsl2992554 的评分)+ (0. 18Xrsl 1699642 的评分)+ (-0. 17Xrs4493136 的评分)+ (0. 18Xrs4766994 的评分)+ (0. ^Xrs4344933 的评分)+ (0. 18Xrs4488809 的评分)+ (0. 28Xrsl039119 的评分)+ (-0. 15Xrs4693311 的评分)+ (0. 16Xrs2736100 的评分)+ (-0. 28Xrs465498 的评分)+ (-0. 17Xrsl0066153 的评分))，获得的危险分值系数以及界限值被直接应用于全基因组关联研究的M08例样本中。统计学分析均通过专门的统计学分析软件完成(PLINK1. 07)。统计学显著性水平 P值设为0. 05，所有统计学检验均为双侧检验。以下是本发明进一步的说明在上述2331例符合条件的原发性肺癌病例及3077例健康对照中，两组年龄、性别均衡可比。我们将这两组人群经Affymetrixe. 0芯片进行全基因组扫描获得相关结果。根据Affymetrixe. 0芯片检测，本发明人检测到在“原发性肺癌病例”组和“健康对照”组中基因型分布频率存在差异的SNP包括rsl07401、rs465498、rs663414、 rs622917、rs636586、rs74106U rs855641、rs948783、rsl544694、rsl663689、rs2030378、 rs2225588、 rs2317683、 rs2395166、 rs240527U rs2788713、 rs3130975、 rs4344933、 rs4488809、 rs4493136、 rs4669621、 rs4697406、 rs4749794、 rs4809957、 rs6102795、 rs6490820, rs9317873、rs9373105、rs9397087、rs9463490、rsl0066153, rslll44475、 rslll55286、rsll264579、rsll907465、rsl2050469、rsl2992554、rsl3000907、rsl6883398、 rsl6959825、rsl7058190、rsl7075390、rsl7728461、rsl014588、rsl039119、rsl726744、 rs2283947、rs2893680、rs3969178、rs4693311、rs4766994、rs4894343、rs4940849、 rs6490294, rs6780858、rs9439527、rs9556016、rsl2002185、rs 12793370、rsl549058、 rs2736100、rs6043705 和 rsll699642。根据上述检测结果，我们将这63个与原发性肺癌发病相关的SNP在另外2283例原发性肺癌病例和与其年龄、性别匹配的2243例健康对照中进行了单个SNP的检测，结果与芯片检测一致。单因素和多因素Logistic回归分析结果均表明，这63个SNP与原发性肺癌的发
15病存在着显著关联。进一步分析这63个SNP的组合用于原发性肺癌诊断的效果，发现其组合能够很好的区分病例与对照。根据上述实验结果，本发明人制备了一种能用于原发性肺癌辅助诊断的试剂盒， 包含测定受试者血标本DNA中上述SNP的特异性引物、特异性荧光探针对和其他检测试剂。具体而言，这63个SNP的组合，或者这63个SNP的特异性引物及特异性荧光探针对的组合构成的相关诊断试剂盒有助于原发性肺癌的辅助诊断，为临床医生快速准确掌握患者的疾病状态和病情严重程度，及时采取更具个性化的防治方案提供支持。本发明有益效果本发明提供的SNP标志物作为原发性肺癌辅助判断的标志物的优越性在于(I)SNP是一种新型基因生物标志物，区别于传统生物标志物，稳定、微创、易于检测，将大大提高疾病诊断的敏感性和特异性，该类生物标志物的成功开发将为原发性肺癌的诊断和治疗开创全新局面，为其他疾病生物标志物的研制提供借鉴。O) SNP试剂盒是一种系统、全面的诊断试剂盒，可用于原发性肺癌的辅助诊断，有助于反映患者的疾病状态，为临床医生快速准确掌握患者病情、及时采取更具个性化的防治方案提供支持。(3)采用严密的验证和评价体系，本发明人初期采用全基因组芯片扫描以获取疾病相关的SNP谱，并应用TaqMan基因分型方法在大样本中进行了验证；以上方法和策略的应用加速和保证了 SNP生物标志物和诊断试剂盒在临床上的应用，也为其他疾病生物标志物的研制提供方法和策略上的借鉴。本发明通过控制年龄、性别、吸烟等对疾病发展的影响因素，研究SNP在原发性肺癌辅助诊断的应用前景，阐述SNP对于原发性肺癌进展的影响，揭示其诊断价值。因此，本发明获得了原发性肺癌发病相关SNP谱和特异性标志物；通过SNP生物标志物和诊断试剂盒的研制和应用，可使得原发性肺癌的诊断更加方便易行，为临床医生快速准确掌握患者病情，为临床治疗效果评价奠定基础，并为发现具有潜在治疗价值的新型小分子药物靶标提供帮助。
图1 显示全基因组关联研究病例组和对照组的ROC曲线。显示原发性肺癌病例组对健康对照组为参照的ROC曲线。
具体实施例方式实施例1样品的收集和样品资料的整理发明人于2005月4月开始至2011年1月从南京医科大学肿瘤中心收集了大量的原发性肺癌患者血标本，通过对样品资料的整理，发明人从中选择了 9934例符合下列标准的样本全基因组芯片扫描和单个SNP TaqMan基因分型的实验样品1、病理组织学确诊的原发性肺癌患者；2、与病例年龄、性别匹配的健康对照；并系统采集了这些样本的人口学资料和临床资料等情况。
实施例2外周血DNA中SNP的全基因组扫描在上述符合条件的2331例原发性肺癌患者和3077例健康对照中，两组年龄、性别匹配。将这两组人群经Affymetrixe.O芯片检测获得相关结果。具体步骤为1、向储存于2ml冻存管中的白细胞加入溶血试剂，颠倒混勻后完全转入。2、去除红细胞用溶血试剂将5ml离心管补至細1，颠倒混勻，4000rpm离心10分钟，弃上清。向沉淀中加入細1溶血试剂，再次颠倒混勻清洗一次，4000rpm离心10分钟，弃上清。3、抽提DNA:向沉淀中加Iml抽提液(每300ml中含有122. 5ml 0.2M氯化钠， 14.4ml 0. 5M乙二胺四乙酸，15ml 10%十二烷基硫酸钠，148. Iml双蒸水，下同)和8 μ 1蛋白酶K，震荡器上充分震荡混勻，37°C水浴过夜。4、去除蛋白质加Iml饱和酚充分混勻(手轻摇15分钟)，4000rpm离心10分钟， 取上清转入新的5ml离心管中。在上清液中加入等体积氯仿与异戊醇混合液(氯仿异戊醇=M 1，v/v，下同)，充分混勻后(手摇15分钟)，4000rpm离心10分钟，取上清(分入两个1. 5ml的离心管)。5、DNA沉淀在上清液中加入3M的醋酸钠60 μ 1，再加入与上清液等体积的冰无水乙醇，上下轻摇，可见白色絮状沉淀物，再以12000rpm离心lOmin。6、DNA洗涤在沉淀中加入冰无水乙醇1ml，12000rpm离心lOmin，弃上清后真空抽
干或置于清洁干燥环境中蒸干。7、测量浓度通常能得到20-50ng/ μ 1 DNA,纯度(紫外2600D与2800D比值)在 1. 6-2. O。8、进行全基因组扫描；9、数据分析与处理在“原发性肺癌病例”组和“健康对照”组中发现的基因型分布频率有显著差异的SNP在上文中已经罗列出，结果见表1。表1病例组与对照组全基因组关联分析结果
权利要求
1.一种与原发性肺癌辅助诊断相关的SNP标志物，其特征在于该标志物为rsl07401、 rs465498、rs663414、rs622917、rs636586、rs741061、rs855641、rs948783、rsl544694、 rsl663689、 rs2030378、 rs2225588、 rs2317683、 rs2395166、 rs2405271、 rs2788713、 rs3130975、rs4344933、rs4488809、rs4493136、rs4669621、rs4697406、rs4749794、 rs4809957、 rs6102795、 rs6490820、 rs9317873、 rs9373105、 rs9397087、 rs9463490、 rsl0066153、rslll44475、rslll55286、rsll264579、rsll907465、rsl2050469、rsl2992554、 rsl3000907、rsl6883398、rsl6959825、rsl7058190、rsl7075390、rsl7728461、rsl014588、 rsl039119、rsl726744、rs2285947、rs2895680、rs3969178、rs4693311、rs4766994、 rs4894545, rs4940849、rs6490294, rs6780858、rs9439527、rs9556016、rsl2002185、 rsl2793370、rsl549058、rs2736100、rs6043705 和 rsll699642 的组合。
2.权利要求1所述的SNP标志物的特异性引物，其特征在于该引物为 rs 107401 的引物序列为 SEQ ID No 1 和 SEQ ID No 2 ；rs465498 的引物序列为 SEQ ID No 5 和 SEQ ID No 6 ； rs663414 的引物序列为 SEQ ID No 9 和 SEQ ID No 10 ； rs622917 的引物序列为 SEQ ID No 13 和 SEQ ID No 14 ； rs636586 的引物序列为 SEQ ID No 17 和 SEQ ID No 18 ； rs741061 的引物序列为 SEQ ID No 21 和 SEQ ID No 22 ； rs855641 的引物序列为 SEQ ID No 25 和 SEQ ID No 26 ；rs948783的引物序列为SEQ ID No 29 禾口 SEQ ID No 30 ；rsl544694的引物序列为SEQIDNo33 禾口SEQIDNo34 ；rsl663689的引物序列为SEQIDNo:37和SEQIDNo38 ；rs2030378的引物序列为SEQIDNo41 禾 PSEQIDNo42 ；rs2225588的引物序列为SEQIDNo45和SEQIDNo46 ；rs2317683的引物序列为SEQIDNo49 禾PSEQIDNo50 ；rs2395166的引物序列为SEQIDNo53 禾口SEQIDNo54 ；rs2405271的引物序列为SEQIDNo:57 禾口SEQIDNo58 ；rs2788713的引物序列为SEQIDNo61 禾口SEQIDNo62 ；rs3130975的引物序列为SEQIDNo65 禾口SEQIDNo66 ；rs4344933的引物序列为SEQIDNo69 禾口SEQIDNo70 ；rs4488809的引物序列为SEQIDNo:73和SEQIDNo74 ；rs4493136的引物序列为SEQIDNo:77和SEQIDNo78 ；rs4669621的引物序列为SEQIDNo81 禾口SEQIDNo82 ；rs4697406的引物序列为SEQIDNo85和SEQIDNo86 ；rs4749794的引物序列为SEQIDNo89和SEQIDNo90 ；rs4809957的引物序列为SEQIDNo93和SEQIDNo94 ；rs6102795的引物序列为SEQIDNo97和SEQIDNo98 ；rs6490820的引物序列为SEQIDNo:101和 SEQ ID No102rs9317873的引物序列为SEQIDNo105 和 SEQ ID No106rs9373105的引物序列为SEQIDNo109 和 SEQ ID No110rs9397087 的引物序列为 SEQ ID No :113 和 SEQ ID No :114 ； rs9463490 的引物序列为 SEQ ID No :117 和 SEQ ID No :118 ；rsl0066153的引物序列为SEQIDNo121 禾口 SEQIDNo122rsl 1144475的引物序列为SEQIDNo:125 禾口 SEQIDNo126rsl 1155286的引物序列为SEQIDNo:129 禾口 SEQIDNo130rsll264579的引物序列为SEQIDNo:133 禾口 SEQIDNo134rsl 1907465的引物序列为SEQIDNo:137 禾口 SEQIDNo138rs 12050469的引物序列为SEQIDNo141 禾口 SEQIDNo142rsl2992554的引物序列为SEQIDNo:145 和 SEQIDNo146rs 13000907的引物序列为SEQIDNo:149 和 SEQIDNo150rs 16883398的引物序列为SEQIDNo:153 禾口 SEQIDNo154rs 16959825的引物序列为SEQIDNo:157 禾口 SEQIDNo158rsl7058190的引物序列为SEQIDNo:161 禾口 SEQIDNo162rs 17075390的引物序列为SEQIDNo165 和 SEQIDNo166rs 17728461的引物序列为SEQIDNo:169 和 SEQIDNo170rsl014588的引物序列为SEQIDNo 173和SEQIDNo 174rsl039119的引物序列为SEQIDNo 177和SEQIDNo 178rsl726744的引物序列为SEQIDNo 181和SEQIDNo 182rs2285947的引物序列为SEQIDNo 185和SEQIDNo 186rs2895680的引物序列为SEQIDNo 189和SEQIDNo 190rs3969178的引物序列为SEQIDNo 193和SEQIDNo 194rs4693311的引物序列为SEQIDNo 197和SEQIDNo 198rs4766994的引物序列为SEQIDNo 201和SEQIDNo 202rs4894545的引物序列为SEQIDNo 205和SEQIDNo 206rs4940849的引物序列为SEQIDNo 209和SEQIDNo 210rs6490294的引物序列为SEQIDNo 213和SEQIDNo 214rs6780858的引物序列为SEQIDNo 217和SEQIDNo 218rs9439527的引物序列为SEQIDNo 221和SEQIDNo 222rs9556016的引物序列为SEQIDNo 225和SEQIDNo 226rsl2002185 的引物序列为 SEQ ID No :229 和 SEQ ID No :230 ；rsl2793370 的引物序列为 SEQ ID No :233 和 SEQ ID No :234 ；rsl549058 的引物序列为 SEQ ID No :237 和 SEQ ID No :238 ；rs2736100 的引物序列为 SEQ ID No :241 和 SEQ ID No :242 ；rs6043705 的引物序列为 SEQ ID No :245 和 SEQ ID No :246 ；rsll699642 的引物序列为 SEQ ID No :249 和 SEQ ID No :250。
3.权利要求1所述的SNP标志物的特异性荧光探针对，其特征在于该荧光探针为rsl07401的荧光探针对序列为SEQ ID No 3和SEQ ID No 4 ；rs465498的荧光探针对序列为SEQ ID No 7和SEQ ID No 8 ；rs663414的荧光探针对序列为SEQ ID No 11和SEQ ID No 12 ；rs622917的荧光探针对序列为SEQID No 15和SEQID No 16 ；rs636586的荧光探针对序列为SEQID No 19和SEQID No 20 ；rs741061的荧光探针对序列为SEQID No 23和SEQID No 24 ；rs855641的荧光探针对序列为SEQID No 27和SEQID No 28 ；rs948783的荧光探针对序列为SEQID No :31和SEQID No 32 ；rsl544694的荧光探针对序列为SEQIDNo35 禾口SEQIDNo36 ；rsl663689的荧光探针对序列为SEQIDNo39 禾口SEQIDNo40 ；rs2030378的荧光探针对序列为SEQIDNo43和SEQIDNo44 ；rs2225588的荧光探针对序列为SEQIDNo47和SEQIDNo48 ；rs2317683的荧光探针对序列为SEQIDNo51和SEQIDNo52 ；rs2395166的荧光探针对序列为SEQIDNo55和SEQIDNo56 ；rs2405271的荧光探针对序列为SEQIDNo59和SEQIDNo60 ；rs2788713的荧光探针对序列为SEQIDNo63和SEQIDNo64 ；rs3130975的荧光探针对序列为SEQIDNo67和SEQIDNo68 ；rs4344933的荧光探针对序列为SEQIDNo71和SEQIDNo72 ；rs4488809的荧光探针对序列为SEQIDNo75和SEQIDNo76 ；rs4493136的荧光探针对序列为SEQIDNo79和SEQIDNo80 ；rs4669621的荧光探针对序列为SEQIDNo83和SEQIDNo84 ；rs4697406的荧光探针对序列为SEQIDNo87和SEQIDNo88 ；rs4749794的荧光探针对序列为SEQIDNo91和SEQIDNo92 ；rs4809957的荧光探针对序列为SEQIDNo95和SEQIDNo96 ；rs6102795的荧光探针对序列为SEQIDNo99和SEQIDNo100rs6490820的荧光探针对序列为SEQIDNo103 和 SEQ ID No104rs9317873的荧光探针对序列为SEQIDNo107 和 SEQ ID No108rs9373105的荧光探针对序列为SEQIDNo111和 SEQ ID No112rs9397087的荧光探针对序列为SEQIDNo:115 和 SEQ ID No116rs9463490的荧光探针对序列为SEQIDNo:119 禾口 SEQ ID No120rsl0066153的荧光探针对序列为SEQIDNo123 和SEQIDNo124rslll44475的荧光探针对序列为SEQIDNo127 和SEQIDNo128rslll55286的荧光探针对序列为SEQIDNo131 禾口SEQIDNo132rsll264579的荧光探针对序列为SEQIDNo135 和SEQIDNo136rsll907465的荧光探针对序列为SEQIDNo139 和SEQIDNo140rsl2050469的荧光探针对序列为SEQIDNo143 和SEQIDNo144rsl2992554的荧光探针对序列为SEQIDNo147 和SEQIDNo148rsl3000907的荧光探针对序列为SEQIDNo151 禾口SEQIDNo152rsl6883398的荧光探针对序列为SEQIDNo155 和SEQIDNo156rsl6959825的荧光探针对序列为SEQIDNo159 和SEQIDNo160rsl7058190的荧光探针对序列为SEQIDNo163 和SEQIDNo164rsl7075390的荧光探针对序列为SEQIDNo167 和SEQIDNo168rsl7728461 的荧光探针对序列为 SEQ ID No :171 和 SEQ ID No :172 ；rsl014588的荧光探针对序列为SEQIDNo175和SEQIDNo176rsl039119的荧光探针对序列为SEQIDNo179和SEQIDNo180rsl726744的荧光探针对序列为SEQIDNo183和SEQIDNo184rs2285947的荧光探针对序列为SEQIDNo187和SEQIDNo188rs2895680的荧光探针对序列为SEQIDNo191和SEQIDNo192rs3969178的荧光探针对序列为SEQIDNo195和SEQIDNo196rs4693311的荧光探针对序列为SEQIDNo199和SEQIDNo200rs4766994的荧光探针对序列为SEQIDNo203和SEQIDNo204rs4894545的荧光探针对序列为SEQIDNo207和SEQIDNo208rs4940849的荧光探针对序列为SEQIDNo211和SEQIDNo212rs6490294的荧光探针对序列为SEQIDNo215和SEQIDNo216rs6780858的荧光探针对序列为SEQIDNo219和SEQIDNo220rs9439527的荧光探针对序列为SEQIDNo223和SEQIDNo224rs9556016的荧光探针对序列为SEQIDNo227和SEQIDNo228rsl2002185 的荧光探针对序列为 SEQ ID No :231 和 SEQ ID No :232 ； rsl2793370 的荧光探针对序列为 SEQ ID No :235 和 SEQ ID No :236 ； rsl549058 的荧光探针对序列为 SEQ ID No :239 和 SEQ ID No :240 ； rs2736100 的荧光探针对序列为 SEQ ID No :243 和 SEQ ID No :244 ； rs6043705 的荧光探针对序列为 SEQ ID No :247 和 SEQ ID No :248 ； rs 11699642 的荧光探针对序列为 SEQ ID No :251 和 SEQ ID No :252。
4.权利要求1所述的SNP标志物在制备原发性肺癌辅助诊断试剂盒中的应用。
5.权利要求2所述的SNP标志物的特异性引物在制备原发性肺癌辅助诊断试剂盒中的应用。
6.权利要求3所述的SNP标志物的特异性荧光探针对在制备原发性肺癌辅助诊断试剂盒中的应用。
7.—种原发性肺癌辅助诊断试剂盒，其特征在于该试剂盒用于检测外周血DNA中 rsl07401、rs465498、rs663414、rs622917、rs636586、rs741061、rs855641、rs948783、 rsl544694、rsl663689、rs2030378、rs2225588、rs2317683、rs2395166、rs2405271、 rs2788713、 rs3130975、 rs4344933、 rs4488809、 rs4493136、 rs4669621、 rs4697406、 rs4749794、 rs4809957、 rs6102795、 rs6490820、 rs9317873、 rs9373105、 rs9397087、 rs9463490、rsl0066153、rslll44475、rslll55286、rsll264579、rsll907465、rsl2050469、 rsl2992554、rsl3000907、rsl6883398、rsl6959825、rsl7058190、rsl7075390、rsl7728461、 rsl014588、 rsl039119、 rsl726744、 rs2285947、 rs2895680、 rs3969178、 rs4693311、 rs4766994、 rs4894545、 rs4940849、 rs6490294、 rs6780858、 rs9439527、 rs9556016、 rsl2002185、rsl2793370、rsl549058、rs2736100、rs6043705 和 rsll699642。
8.根据权利要求7所述的诊断试剂盒，其特征在于该试剂盒含有权利要求2所述SNP 标志物的特异性引物和/或权利要求3所述SNP标志物的特异性荧光探针对。
9.根据权利要求7或8所述诊断试剂盒，其特征在于该试剂盒还可以包括PCR技术常用的试剂。
全文摘要
本发明属于基因工程及肿瘤医学领域，公开了一种与原发性肺癌辅助诊断相关的SNP标志物及其应用。该标志物为rs107401、rs465498、rs663414、rs622917、rs636586、rs741061、rs855641、rs948783、rs1544694、rs1663689、rs2030378、rs2225588、rs2317683、rs2395166、rs2405271、rs2788713、rs3130975、rs4344933、rs4488809等63个SNP的组合，该标志物可用于制备原发性肺癌辅助诊断试剂盒。
文档编号C12N15/11GK102534009SQ201210013090
公开日2012年7月4日 申请日期2012年1月16日 优先权日2012年1月16日
发明者孙重期, 沈洪兵, 胡志斌, 董静, 靳光付, 马红霞 申请人:南京医科大学