专利名称：一种油菜种子rna提取的方法
技术领域：
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种适于油菜种子的RNA提取方法，利用热硼酸盐法提取高质量、高纯度的油菜籽总RNA，以满足新一代测序文库构建、种子发育相关基因的克隆、表达分析及验证对RNA质量的要求。
背景技术：
油菜种子中蛋白质、油脂、纤维含量较高，特别在成熟种子中更为严重，而RNA含量相对较低。此外种皮中富含色素、单宁、多酚等代谢产物，这些物质的存在严重影响RNA 提取的获得率，而且会直接干扰随后的文库构建、反转录等实验。因此如何提取完整性好、 纯度高的RNA是研究油菜种子发育、油脂代谢调控相关基因克隆、表达验证等实验的前提。 目前已有大量商品化的试剂盒应用于植物总RNA的提取，如hvitrogen和!^rmentas等知名分子试剂公司的试剂盒，其RNA提取质量完好，但价格相对昂贵；Takara的RNA提取试剂盒价格适中，但提取的RNA蛋白和盐离子含量均较高，这些杂质的存在会影响文库构建的效率，很可能导致文库构建的失败，仅能用于反转录等实验，达不到文库构建的要求。不少研究者进行了油菜籽RNA提取方法的探讨，提出了 CTAB法、SDS法等等，所提取的RNA可成功用于反转录等，但是否可以应用于cDNA文库构建尚未有报道。
发明内容
为了解决现有技术存在的问题，本发明提供了一种新的方法，通过热硼酸盐法提取油菜籽总RNA，减少蛋白和盐离子污染，避免其干扰cDNA文库的构建。本发明所述油菜种子RNA提取方法如下
1)将热硼酸盐提取缓冲液[ο.2M十水合硼酸钠，30mM乙二醇-双- -氨基乙醚)四乙酸(EGTA)，1% (w/v)十二烷基硫酸钠(SDS)，1% (w/v)脱氧胆酸钠，10 mM 二硫苏糖醇 (DTT), 1% (ν/ν)酞菁氧钒(IGEPAL CA-630), 2% (w/v)聚乙烯吡咯烷酮(PVP-40)]预热至 65 0C ；
2)100 mg油菜籽液氮速冻研磨成粉后加入Iml预热的提取缓冲液，继续研磨成勻浆；
3)将勻浆转至1.5ml离心管中，42°C恒温摇床孵育1. 5h;
4)向上述勻浆中加入2M氯化钾至终浓度160mM以沉淀蛋白，5000rpm，20min，4°C离
心；
5)转移上清至新的离心管后，加入8M氯化锂(LiCl)至终浓度2M，冰浴过夜；
6)次日，10000rpm，20min，4°C离心，弃上清，沉淀用预冷的2MLiCl洗涤，lOOOOrpm， 15min，4°C离心，弃上清；
7)重复上述洗涤步骤2-3次；
8)沉淀溶解于250μ1IXTE缓冲液(10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH,8. 0), lOOOOrpm, 15min，4°C离心以去除不溶杂质；
9)转移上清至新管中，加入1/10体积的2M醋酸钾(Kac)(pH，5. 5)，冰浴15min后IOOOOrpm, 15min，4°C离心；
10)转移上清至新管，加入1/10体积的3M醋酸钠(NaAc)(pH，6. 0),2. 5倍体积的冰酒精、2 μ 1肝糖，-80°c静置l-2h;
11)13000rpm，15min，4°C离心，沉淀用70%酒精洗涤后，溶解于适量无RNase水中，-80°C保存备用。本方法所提取油菜籽总RNA质量完好、没有明显降解现象，0拟60/0D280和0拟60/ 0D230均在2.0左右，样品中没有其它杂质如蛋白、盐离子的污染，产物获得率大于40 Pg/100mg，符合cDNA文库构建的要求。
图1 不同RNA提取方法的比较 A:氯化锂-酚方法；
B: Takara公司提供试剂盒； C:本发明热硼酸方法； D: Invitrogen提供的试剂盒； M: marker DL2000。
具体实施例方式
将同一批次的油菜籽用4种不同方法提取RNA，提取产物于1%琼脂糖凝胶上60伏(V) 电泳40分钟，结果如图1和表1所示。图1中Al、A2为氯化锂-酚法提取的RNA。提取方法是100g油菜籽于液氮中研磨成粉后转至含适量提取缓冲液[8M LiCl, 2% (w/v) β-巯基乙醇]的离心管中，混勻后 4°C放置过夜，次日13000rpm 4°C离心3分钟，沉淀用70% (ν/ν)酒精洗后晾干，然后将沉淀溶解于 Iml 溶解缓冲液
中，用饱和酚、酚氯仿异戊醇(25:24:1)、氯仿异戊醇(24:1)各抽提1次，向最后的上层水相中加入0. 1体积的3Μ NaAc和1. 5体积的乙醇，_20°C静置 0. 5小时后13000rpm 4°C离心10分钟，沉淀用70% (ν/ν)酒精洗后晾干，最后溶解于适量 RNase-free /K 中。Bi、B2 为 Takara RNAiso Plus 提取的 RNA(方法详见 Takara Code: D9108A)。C1、C2为本发明所用的热硼酸法提取产物，具体操作是
1)将热硼酸盐提取缓冲液[ο.2M十水合硼酸钠，30mM乙二醇-双- -氨基乙醚)四乙酸(EGTA)，1% (w/v)十二烷基硫酸钠(SDS)，1% (w/v)脱氧胆酸钠，10 mM 二硫苏糖醇 (DTT), 1% (ν/ν)酞菁氧钒(IGEPAL CA-630), 2% (w/v)聚乙烯吡咯烷酮(PVP-40)]预热至 65 0C ；
本发明中w/v是指g/mL;
2)100 mg油菜籽液氮速冻研磨成粉后加入Iml预热的提取缓冲液，继续研磨成勻浆；
3)将勻浆转至1.5ml离心管中，42°C恒温摇床孵育1. 5h;
4)向上述勻浆中加入2M氯化钾至终浓度160mM以沉淀蛋白，5000rpm，20min，4°C离
心；
5)转移上清至新的离心管后，加入8M氯化锂(LiCl)至终浓度2M，冰浴过夜；
46)次日，10000rpm，20min，4°C离心，弃上清，沉淀用预冷的2MLiCl洗涤，lOOOOrpm， 15min，4°C离心，弃上清；
7)重复上述洗涤步骤2-3次；
8)沉淀溶解于250μ1IXTE缓冲液(10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH,8. 0), lOOOOrpm, 15min，4°C离心以去除不溶杂质；
9)转移上清至新管中，加入1/10体积的2M醋酸钾(Kac)(pH，5. 5)，冰浴15min后 lOOOOrpm, 15min，4°C离心；
10)转移上清至新管，加入1/10体积的3M醋酸钠(NaAc)(pH，6. 0),2. 5倍体积的冰酒精、2 μ 1肝糖，-80°c静置l-2h;
11)13000rpm，15min，4°C离心，沉淀用70%酒精洗涤后，溶解于适量无RNase水中，-80°C保存备用。Dl、D2 Shvitrogen 公司 RNA Reagent 提取的 RNA (方法详见 hvitrogen Catalog Number: 15596-026)。表1 不同RNA提取方法的纯度和得率
权利要求
1. 一种油菜种子RNA的提取方法，其特征在于包括下述步骤1)将热硼酸盐提取缓冲液预热至65°C；所述热硼酸盐提取缓冲液成分为0. 2M十水合硼酸钠，30mM乙二醇-双-(2-氨基乙醚)四乙酸，1% (w/v)十二烷基硫酸钠，1% (w/v)脱氧胆酸钠，IOmM 二硫苏糖醇，1% (ν/ν)酞菁氧钒，2% (w/v)聚乙烯吡咯烷酮；2)100mg油菜籽液氮速冻研磨成粉后加入Iml预热的上述提取缓冲液，继续研磨成勻浆；3)将勻浆转至1.5ml离心管中，42°C恒温摇床孵育1. 5h;4)向上述勻浆中加入2M氯化钾至终浓度160mM以沉淀蛋白，5000rpm，20min，4°C离心；5)转移上清至新的离心管后，加入8M氯化锂至终浓度2M，冰浴过夜；6)次日，IOOOOrpm,20min，4°C离心，弃上清，沉淀用预冷的2M氯化锂洗涤，IOOOOrpm, 15min，4°C离心，弃上清；7)重复上述洗涤步骤2-3次；8)沉淀溶解于250μ1 IXTE缓冲液，IOOOOrpm, 15min，4°C离心以去除不溶杂质；9)转移上清至新管中，加入1/10体积的2M醋酸钾，pH5.5，冰浴15min后lOOOOrpm， 15min，4°C离心；10)转移上清至新管，加入1/10体积的3M醋酸钠，？!16.0;2.5倍体积的冰酒精、2口1 肝糖，-80°C静置l_2h;11)13000rpm，15min，4°C离心，沉淀用70%酒精洗涤后，溶解于适量无RNase水中，-80°C保存备用。
全文摘要
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种适于油菜种子的RNA提取方法，该方法将热硼酸盐提取缓冲液预热至65℃；再将油菜籽液氮速冻研磨成粉后加入预热的上述提取缓冲液，继续研磨成匀浆；孵育后用氯化钾沉淀蛋白，再经离心、除杂等步骤得到总RNA。本方法所提取油菜籽总RNA质量完好、没有明显降解现象，OD260/OD280和OD260/OD230均在2.0左右，样品中没有其它杂质如蛋白、盐离子的污染，产物获得率大于40μg/100mg，符合cDNA文库构建的要求。
文档编号C12N15/10GK102433325SQ20121001400
公开日2012年5月2日 申请日期2012年1月17日 优先权日2012年1月17日
发明者杜坤, 王娟, 王幼平, 蒋金金, 邵彦林 申请人:扬州大学