专利名称：一种丙酮酸磷酸双激酶重组表达菌株的构建方法及其应用的制作方法
一种丙酮酸磷酸双激酶重组表达菌株的构建方法及其应用技术领域：
本发明涉及微生物分子生物学和基因工程技术领域，涉及微生物蛋白质编码基因的克隆、表达载体的构建、重组表达菌株的构建、丙酮酸磷酸双激酶的表达、纯化及其应用。
背景技术：
丙酮酸憐酸双激酶(PyruvatePhosphate Dikinase ；EC 2. 7. 9. I)能可逆催化磷酸烯丙式丙酮酸、单磷酸腺苷(Adenosine Monophosphate ；AMP)和焦磷酸盐(Pyrophosphate ；PPi)生成三憐酸腺苷(Adenosine Triphosphate, ATP)、无机憐酸盐(Orthophosphate)和丙酮酸。因此，该酶在ATP-突光素-突光素酶生物发光体系中能够持续催化AMP生成ATP，对于体系形成稳态生物发光信号、简化检测过程中发光信号的测定具有积极意义。在实际应用中，该酶可用于ATP发光法快速检测食品中的细菌数量。邹秉杰等对 热玫瑰小双孢菌来源的丙酮酸磷酸双激酶进行了基因克隆、表达等研究，并将所得到的酶与荧光素酶偶联，应用于ATP-AMP的催化循环反应(邹秉杰，陈颖，马寅姣，周国华.重组丙酮酸磷酸双激酶与荧光素酶偶联催化ATP-AMP循环反应[J].中国生物化学与分子生物学报，2008,24(11) 1081 1084.)。本发明采用天蓝色链酶菌(Streptomyces coelicolor) A3 (2)株作为出发菌株，对该菌株染色体DNA所编码的丙酮酸磷酸双激酶基因进行了克隆，构建了重组表达载体和重组表达菌株，并对重组表达菌株进行了诱导表达，在ATP-荧光素-荧光素酶生物发光体系中对该酶的活性进行了检验，结果提示天蓝色链酶菌A3 (2)株来源的丙酮酸磷酸双激酶具有很高的酶活力，在微生物的生物发光法检测中有很重要的应用价值。
发明内容[要解决的技术问题]本发明的目的是构建一种适合于在大肠杆菌中表达天蓝色链酶菌A3 (2)株来源的丙酮酸磷酸双激酶的重组表达菌株，并提供该重组表达菌株诱导表达丙酮酸磷酸双激酶的方法、丙酮酸磷酸双激酶的的纯化方法以及该酶的应用举例。因而本发明要解决的技术问题就是构建丙酮酸磷酸双激酶表达载体和重组表达菌株所需的材料和方法，以及丙酮酸磷酸双激酶的诱导表达和纯化所需的材料和方法，以及进行ATP转化的实际应用所需的材料和方法。[技术方案]本发明采用来源于天蓝色链霉菌的丙酮酸磷酸双激酶，构建一种适合该酶进行诱导表达的表达载体，构建适合该酶进行诱导表达的重组表达菌株，并采用上述构建的重组表达菌株进行丙酮酸磷酸双激酶的诱导表达，然后对该丙酮酸磷酸双激酶进行纯化和酶活性检测。本发明采用的宿主菌株为大肠杆菌BL21 (DE3)，以市售的商品化大肠杆菌表达载体pET28a(+)作为本发明中诱导表达载体构建的基本骨架，以天蓝色链霉菌A(3)2基因组DNA为模板,通过聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction ;简称PCR)扩增出丙酮酸磷酸双激酶的编码基因ppdk、构建重组表达载体pET28a-ppdk，并将该重组载体转化大肠杆菌 BL21 (DE3)，得到重组表达菌株 BL21 (DE3) /pET28a_ppdk。重组表达菌株BL21(DE3)/pET28a-ppdk在含有50 y g/mL卡那霉素的Luria-Bertani (LB)液体培养基中进行培养，随后采用异丙基-P -D-硫代半乳糖苷(IPTG)进行丙酮酸磷酸双激酶的诱导表达，收获诱导表达后的发酵菌体，进行超声波破碎处理，对细胞破碎液进行离心并收获含有丙酮酸磷酸双激酶的上清液，表达结果通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)来显示和分析。采用亲和层析方法对该酶进行纯化处理，纯化得到的样品通过SDS-PAGE来显示和分析。采用ATP-荧光素-荧光素酶生物发光体系对纯化得到的丙酮酸磷酸双激酶进行酶活力检测和评估。
[具体实施方式
](I)丙酮酸磷酸双激酶编码基因的克隆首先以天蓝色链霉菌A3 (2)株基因组DNA为模板，采用引物Pl和P2 (见表I)进行PCR扩增得到ppdk基因片段，对该片段进行DNA序列测定以验证其正确性。测序正确后用于下一步实验。(2)表达载体pET28a_ppdk的构建采用限制性内切酶NdeI和XhoI对具体实施方式
(I)中所得到的PPdk基因片段进行降解，并回收该NdeI-XhoI片段，将其连接到商品化的大肠杆菌诱导表达载体pET28a(+)中的相应酶切位点(NdeI-XhoI)，得到重组表达质粒命名为pET28a-ppdk。(3)重组表达菌株的构建将表达载体pET28a-ppdk转化大肠杆菌BL21(DE3)，在含50 y g/mL卡那霉素的LB固体培养基表面筛选得到含载体pET28a-ppdk的大肠杆菌重组菌株，将该菌株命名为BL21(DE3)/pET28a-ppdk，该菌株已于2012年I月4日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京)保藏，其保藏编号为CGMCC 5691。(4)丙酮酸磷酸双激酶的诱导表达将大肠杆菌BL21 (DE3)/pET28a-ppdk于LB液体培养基中过夜培养作为种子液，按I %比例接种到含卡那霉素的LB液体培养基中进行摇床培养，当培养液浊度0D_达到
0.6 0. 8时，采用IPTG进行诱导，于20°C 37°C进行诱导培养2 10小时，得到发酵液经过离心收获菌体，采用超声波法破除菌体细胞壁，然后再离心回收上清液。(5)丙酮酸磷酸双激酶的分离纯化诱导培养后的菌液经过离心收集菌体，以结合缓冲液重悬菌体，采用超声波破碎细胞后，离心收集上清液进行亲和层析纯化。采用镍螯合琼脂糖凝胶亲和介质填充层析柱，对重组蛋白质进行纯化。上柱前预先以平衡缓冲液平衡亲和柱，样品上柱后以清洗缓冲液洗脱杂蛋白，再用洗脱缓冲液洗脱重组蛋白质，最终用重组蛋白质样品缓冲液。对洗脱蛋白质进行透析，将纯化的重组蛋白质进行SDS-PAGE分析。(6)丙酮酸磷酸双激酶的酶活力检测方法荧光素酶生物发光反应将ATP转化成AMP，丙酮酸磷酸双激酶可将产生的AMP转化为ATP，如此循环反应，持续产生的ATP可以转换成荧光素生物发光反应持续稳定的强烈发光信号，检测此发光信号即可对重组蛋白质丙酮酸磷酸双激酶的活性进行评价。
表I本发明实验所使用的PCR弓丨物
引物序列
Pl5'-GTCTATCATATGGCCCGTTACGTGTACGAC-3'
P25'-TATATACTCGAGTCGGCTGTCGCCGGCATCG-3'本发明的有益效果
本发明具有如下优点天蓝色链霉菌来源的丙酮酸磷酸双激酶性质稳定，具有较好的耐热性和化学可修饰性。该酶与荧光素酶进行偶联发生反应，可以产生持续稳定的荧光信号，为生物发光方法检测食品等样品中的细菌提供了较好的方法。本发明在重组丙酮酸磷酸双激酶的氨基酸序列的C端入了 6个组氨酸标签(His-tag)以便采用亲和层析方法进行纯化。萤光素酶偶联催化的ATP-AMP循环可以使酶反复利用，能显著提高ATP检测的灵敏度。
图I重组表达载体pET28a_ppdk结构示意2纯化得到的丙酮酸磷酸双激酶SDS-PAGE电泳检验结果。泳道“M”为分子量标准；泳道“I”为纯化的丙酮酸磷酸双激酶电泳条带图3丙酮酸磷酸双激酶对不含ATP的荧光发光缓冲体系的作用。其中A为添加丙酮酸磷酸双激酶时体系的发光动力学曲线为不添加丙酮酸磷酸双激酶时体系的发光动力学曲线图4丙酮酸磷酸双激酶对含有ATP的荧光发光缓冲体系的作用。其中A为添加丙酮酸磷酸双激酶时体系的发光动力学曲线为不添加丙酮酸磷酸双激酶时体系的发光动力学曲线
具体实施方式以下结合附图详细地描述本发明的过程。实施例I丙酮酸磷酸双激酶重组表达载体和重组表达菌株的构建(I)丙酮酸磷酸双激酶编码基因的克隆本发明采用的丙酮酸磷酸双激酶编码基因来自于天蓝色链霉菌A3(2)株，通过PCR反应从天蓝色链霉菌A3 (2)株基因组DNA上扩增得到目标片段。首先以天蓝色链霉菌A3 (2)株基因组DNA为模板，采用引物Pl和P2(见表I)进行PCR扩增基因ppdk。其中，引物Pl的5’ -端引入限制性内切酶位点(以下简称酶切位点)NdeI，引物P2的3，-端引入酶切位点Xhol。PCR反应的具体条件为95°C预变性5min，95°C变性45s，68°C复性45s，72°C延伸2min50s，反应进行30个循环，然后体系温度降低到4°C延伸lOmin。
将PCR反应得到的产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，PCR扩增出的该片段在I %琼脂糖凝胶电泳上显示的长度约为2700碱基对(I碱基对简写为lbp，1000碱基对简写为Ikb ；下同)，将该片段回收并送上海博尚生物技术有限公司进行DNA序列测定以验证其正确性。(2)重组表达载体pET28a_ppdk和表达菌株BL21 (DE3) /pET28a_ppdk的构建将上述测序验证序列编码正确的ppdk基因片段用限制酶NdeI和XhoI进行降解，回收2. 7kb左右的酶切片段，并将该片段克隆到大肠杆菌载体pET28a(+)中得到重组分泌表达载体pET28a-ppdk，该载体的结构示意图如图I所示。采用氯化钙法制备大肠杆菌BL21 (DE3)的感受态细胞，并将表达载体pET28a-ppdk转化到上述感受态细胞中，然后将转化液涂布在含有50 u g/mL卡那霉素的LB固体培养基表面，于37°C培养8 12h，然后从该固体培养基表面筛选得到含载体pET28a-ppdk的大肠杆菌重组菌株，对这些重组菌株进行质粒载体的抽提，并采用NdeI-XhoI双酶切验证所抽提质粒大小与表达载体pET28a-ppdk的分子大小是否相符，验证正确的菌株命名为BL21 (DE3)/pET28a-ppdk。
实施例2丙酮酸磷酸双激酶的诱导表达和分离纯化将大肠杆菌BL21 (DE3)/pET28a-ppdk于LB液体培养基中过夜培养作为种子液，按I %比例接种到含有50 u g/mL (最终浓度)卡那霉素的LB液体培养基中，于37°C、200r/min摇床培养，当培养液浊度OD6tltl达到0. 6 0. 8时，采用终浓度为0. 05 I. OmmoI/L的IPTG进行诱导，于20°C 37°C进行诱导培养2 10小时，得到发酵液于8000 12000r/min与温度0°C 6°C的条件下进行离心8 12min收获菌体。收获的菌体重悬于结合缓冲液PBS (配方50mmol/L Tris-HCl, 500mmol/L NaCl，20 100mmol/L咪唑，pH 7. 4)，然后采用超声波法(温度0 6 V ;超声波功率200 800W，超声波工作时间ls，间歇时间9s，全程工作时间30 60min)破除菌体细胞壁，然后再次于8000 12000r/min与温度0 6°C的条件下进行离心8 12min,并回收上清液。采用镍螯合琼脂糖凝胶亲和介质填充层析柱对回收上清液中的重组丙酮酸磷酸双激酶进行纯化。下述纯化过程所处温度均为4°C。上柱前预先以5 10倍柱体积的平衡缓冲液(50mmol/L Tris-HCl，500mmol/LNaCl，20 100mmol/L 咪唑，pH 7. 4)平衡亲和柱，样品上柱后以清洗缓冲液(50mmol/LTris-HCl, 500mmol/L NaCl, 50 80mmol/L 咪唑，pH7.4)洗脱杂蛋白，再用洗脱缓冲液(50mmol/L Tris-HCl, 500mmol/L NaCl，200 500mmol/L咪唑，pH 7.4)洗脱重组蛋白质，然后对洗脱的酶样进行透析处理。实施例3重组丙酮酸磷酸双激酶表达产物的SDS-PAGE检测将实施例2所述的经过纯化的丙酮酸磷酸双激酶样品进行SDS-PAGE (12%聚丙烯酰胺凝胶)电泳分析，结果如图2所示。可见在分子量标准(泳道标为“M”)为97.4kDa条带的上方附近有较为单一的样品条带(泳道标为“I”)，丙酮酸磷酸双激酶单体的理论分子量大约为97. 6kDa，因此实验结果与理论分子量大小相符合。实施例4丙酮酸磷酸双激酶应用举例(一)丙酮酸磷酸双激酶催化AMP生成ATP的反应与荧光素酶作用使ATP生成AMP的反应发生偶联，丙酮酸磷酸双激酶将AMP转化为ATP，荧光素酶再将ATP转化成AMP，如此循环反应，持续产生的ATP可以使荧光素发出持续稳定的发光信号，对于改变ATP-荧光素-荧光素酶生物发光反应动力学，实现发光信号的检测简单化具有重要意义。配制不含ATP的荧光素-荧光素酶反应体系共400UL，其中包括AMP(终浓度I X lO-W/L)、PPi (终浓度I X lO-W/L)、荧光素(终浓度5X 10-6mol/L)、荧光素酶(终浓度 3Xl(T7mol/L)、Tris-HCl 25mmol/L，体系 pH 7.4。向该反应体系其中添加实施例2 3中所述纯化得到的丙酮酸磷酸双激酶IOOii L，然后利用化学发光仪检测由ATP生成的荧光信号，其结果如图3中曲线A所示；作为空对照，不添加实施例2 3中所述纯化得到的丙酮酸磷酸双激酶时，荧光信号如图3中曲线B所示。这一结果表明，实施例2 3中所述纯化得到的丙酮酸磷酸双激酶能够促进该体系中ATP的生成和ATP浓度的增加，并且在检测时间限以内，能够实现荧光信号水平的增强。实施例5丙酮酸磷酸双激酶应用举例(二)按照实施例4所述的方式进行实验，只是在反应体系中去掉AMP和PPi，添加ATP (终浓度为I X 10_6mOl/L)，其它成分不变。向该反应体系其中添加实施例2 3中所述纯化得到的丙酮酸磷酸双激酶 100 u L，然后利用化学发光仪检测由ATP生成的荧光信号，其结果如图4中曲线A所示；作为空对照，不添加实施例2 3中所述纯化得到的丙酮酸磷酸双激酶时，荧光信号如图4中曲线B所示。这一结果表明，实施例2 3中所述纯化得到的丙酮酸磷酸双激酶能够促进该体系中ATP浓度的维持，并且在检测时间限以内，能够实现荧光信号水平的维持。
权利要求
1.一种表达生产丙酮酸磷酸双激酶的重组大肠杆菌(Escherichia coli)菌株BL21(DE3)/pET28a-ppdk的构建方法及其应用。该菌株已于2012年I月4日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京)保藏，其保藏编号为CGMCC 5691。
2.根据权利要求I所述的大肠杆菌菌株BL21(DE3)/pET28a-ppdk及其应用，其特征在于该菌株的构建方法如下 (1)丙酮酸磷酸双激酶编码基因的克隆 以天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor) A3 (2)株基因组DNA为模板,采用引物Pl和P2进行聚合酶链式反应(PCR)，扩增得到丙酮酸磷酸双激酶的编码基因ppdk (Gene ID 1095632)，该基因长约2. 7kb，带有6个组氨酸标签(His-Tag)。
(2)表达载体和重组菌株的构建 将该基因PPdk用限制性内切酶NdeI和XhoI进行降解，回收NdeI-XhoI片段并克隆到表达载体pET28a(+)中的NdeI-XhoI位点，得到重组表达质粒pET28a_ppdk，将该载体转化大肠杆菌菌株BL21 (DE3)，得到重组菌株大肠杆菌菌株BL21 (DE3) /pET28a_ppdk。
3.根据权利要求I所述的大肠杆菌菌株BL21(DE3)/pET28a-ppdk及其应用，其特征在于丙酮酸磷酸双激酶的诱导表达和分离纯化方法如下 将大肠杆菌菌株BL21 (DE3) /pET28a-ppdk于添加了卡那霉素(终浓度为50 u g/mL)的Luria-Bertani培养基液体(简称LB培养基)中培养，当培养液浊度0D600达到0. 6 0. 8之间时，采用终浓度为0. 05 I. OmmoI/L的异丙基-P -D-硫代半乳糖苷(IPTG)作为诱导齐[J，于20°C 37°C之间进行诱导培养2 10小时。
4.根据权利要求I所述的大肠杆菌菌株BL21(DE3)/pET28a-ppdk及其应用，其特征在于丙酮酸磷酸双激酶诱导表达产物的分离纯化方法如下 回收发酵液菌体并采用超声波破除细胞壁，将得到的上清液经过镍螯合琼脂糖凝胶亲和介质填充层析柱，对重组的丙酮酸磷酸双激酶进行分离纯化。
5.根据权利要求I所述的大肠杆菌菌株BL21(DE3)/pET28a-ppdk及其应用，其特征在于扩增丙酮酸磷酸双激酶编码基因PPdk的引物序列如下-Pl. 5' -GTCTATCATATGGCCCGTTACGTGTACGAC-3'P2 :5' -TATATACTCGAGTCGGCTGTCGCCGGCATCG-3'。
全文摘要
本发明涉及一种丙酮酸磷酸双激酶重组表达菌株的构建方法，还涉及所构建菌株的具体应用，即对丙酮酸磷酸双激酶的表达、纯化方法，以及所得到丙酮酸磷酸双激酶在ATP-荧光素-荧光素酶发光反应体系中的应用。本发明克隆到来自于天蓝色链霉菌的丙酮酸磷酸双激酶编码基因ppdk，并将其构建为表达载体pET28a-ppdk，该载体转化到表达宿主BL21(DE3)后得到重组表达菌株BL21(DE3)/pET28a-ppdk，对该菌株进行培养和诱导，表达了丙酮酸磷酸双激酶，采用亲和层析方法纯化了丙酮酸磷酸双激酶。该纯化的酶在ATP-荧光素-荧光素酶发光反应体系中能有效催化反应产物单磷酸腺苷(AMP)和焦磷酸(PPi)生成三磷酸腺苷(ATP)，因而在ATP发光检测中具有重要用途。
文档编号C12N15/70GK102653727SQ201210014850
公开日2012年9月5日 申请日期2012年1月18日 优先权日2012年1月18日 公开号201210014850.8
发明者夏雨, 弓紫丰, 王周平 申请人:江南大学