专利名称：磷酸三酯酶突变体及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术，具体涉及一种磷酸三酯酶突变体及其制备方法和应用。
背景技术：
磷酸三酯酶(Phosphotriesterase, EC 3. I. 8. I)可以水解广谱的有机磷化合物，后者被广泛的用于农业杀虫剂和化学战神经毒剂，磷酸三酯酶能够催化断裂有机磷化合物的磷酯键而使其脱毒。如下式所示
... gj . ...+ HOZ H2O、oh
R2、ZR2
R1/R2:焼基Z:酿.脂肪族.芳香族S味坏基团有机磷化合物对人及家畜具有极强的毒副作用。一些比较常见的有机磷化合物及其毒性见表I。至今有超过100种有机磷杀虫剂在世界各地广泛使用，约占杀虫剂种类的38%。仅在美国每年大约有5万吨有机磷杀虫剂用于农业生产，除此每年通过“牛蚤根除计划”大约产生40万升蝇毒磷(coumaphos)废液；而一些欧盟国家生产数百万升地亚农(diazinon)用于清洗羊毛药水。由于过量和连续的使用，许多土地和水资源遭到了严重的污染，对人类健康构成了巨大威胁(Singh, B. K. Organophosphorus-degrading bacteria ecology and industrial applications. Nat. Rev. Microbiol. 2009,7 (2) :156-164.)。世界上每年大概有三百万人由于有机磷摄入中毒，其中约二十万人死亡(Karalliedde，L. , Senanayake, N. , Organophosphorus insecticide poisoning.J. Int.Fed.Cl in.Chem. 1999,11(2) :4_9.)。另一方面，世界上用于军事储备的化学战神经毒剂约为20万吨，根据国际化学武器条约这些化学武器在2023年前需要全部销毁。因此磷酸三酯酶在有机磷污染物的降解、除污、生物传感器、医药研发等领域具有广阔的应用潜力。表I几种常见的有机磷化合物及其毒性
权利要求
1.一种磷酸三酯酶突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示，其中包含以下8个氨基酸突变Phe28Ile、Tyr99Leu、Thrl71Ser、Phe228Leu、Asn269Ser、Val270Gly、Trp271Cys、Gly273Asp。
2.如权利要求I所述的磷酸三酯酶突变体的制备方法，其特征在于由来源于G. kaustophilus HTA426的磷酸三酯酶基因进行分子进化，以构建好的含有磷酸三酯酶基因的表达质粒为模板，运用易错PCR的方法，经过多轮的突变和筛选，最终获得磷酸三酯酶突变体；所述磷酸三酯酶野生型的氨基酸序列如SEQ ID NO. I所示。
3.编码权利要求I所述磷酸三酯酶野生型基因，其特征在于所述磷酸三酯酶野生型基因的核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示。
4.编码权利要求I所述磷酸三酯酶突变体基因，其特征在于所述磷酸三酯酶突变体基因的核苷酸序列如SEQ ID NO. 4所示。
5.如权利要求I所述磷酸三酯酶突变体在降解有机磷毒物中的应用。
6.表达权利要求I所述磷酸三酯酶突变体的大肠杆菌工程菌，其特征在于所述大肠杆菌工程菌命名为pET28a-GkaP(8M)，保藏编号为CGMCC No. 5597。
全文摘要
本发明提供了一种磷酸三酯酶突变体及其制备方法和应用。本发明由来源于嗜热细菌的Geobacillus kaustophilus HTA426的磷酸三酯酶基因出发，利用易错PCR的方法，经过多轮的突变和筛选，最终获得一个磷酸三酯酶活力显著提高的突变体，在该突变体的氨基酸序列中涉及到的突变为Phe28Ile、Tyr99Leu、Thr171Ser、Phe228Leu、Asn269Ser、Val270Gly、Trp271Cys、Gly273Asp。突变体对于几种常见的有机磷杀虫剂的比活力相比野生型得到了显著提高，在有机磷毒物的生物降解领域具有广阔的应用前景。
文档编号C12R1/19GK102796714SQ20121001519
公开日2012年11月28日 申请日期2012年1月18日 优先权日2012年1月18日
发明者冯雁, 张宇, 安娇, 杨广宇 申请人:上海交通大学