专利名称：一种羊口疮病毒蛋白orfv059单克隆抗体杂交瘤g3及单克隆抗体的制作方法
技术领域：
本发明涉及細胞工程领域，具体涉及羊ロ疮病毒结构蛋白0RFV059单克隆抗体杂交瘤細胞株G3及单克隆抗体。
背景技术：
羊传染性脓疱病(Orf)又称羊传染性脓疱性炎，俗称羊ロ疮，是由ロ疮病毒 (ORFV)引起的山羊和绵羊的ー种急性、接触性传染病。其病变特征是患羊口唇等处皮肤和黏膜形成红斑、丘疹、脓疮、溃疡和疣状结痂。羔羊极易感，多群发。本病在世界各地均有发生，我国主要养羊区也较常见，是危害羊群的主要疾病之一。该病毒抵抗力強，羊群一旦被感染则不易清除，可持续危害羊群多年，给畜牧业造成重大经济损失。ORFV病毒属痘病毒科，副痘病毒属。病毒粒子呈砖形或椭圆形，其表面呈绳索样纵横交错排列结构。该病毒可在牛、绵羊、山羊的肾细胞以及犊牛和羔羊的睾丸細胞上生长， 并产生細胞病变。ORFV引发病灶的病理组织学特征包括角化細胞的空泡变化、肿胀，细胞间质玻璃样变性，表皮增生显著，表皮内微肿胀，皮下组织中性粒細胞、树突状細胞(DCs)、 T細胞和B细胞聚集。羊ロ疮分布广泛，传染性強，一旦爆发会造成严重的经济损失。病毒在病变部位持续存在，患病动物易重复感染，目前无有效疫苗，防控困难。因此，羊ロ疮病毒的早期、准确检出对于疾病的控制和预防具有重要的意义。兽医临床上羊ロ疮病的诊断主要根据其典型症状进行诊断，但无法与ロ蹄疫(foot-and-mouth disease, FMD)和羊痘(Capripox)区分。 目前所采用的实验室诊断方法分为，(1)免疫学方法，如ELISA，Western blotting，免疫组织化学(IHC)等；(2)病理组织学；(3)分子生物学方法，如PCR和限制性片段长度多态性(RFLP)分析等。其中以免疫学诊断方法最为重要，因其具有灵敏、快速、准确的特点， 而特异性的抗体尤其是单克隆抗体是免疫学诊断中最重要的工具。近年，在我国吉林省和甘肃省的羊群中几次爆发羊ロ疮疫情，由于特异性抗体的缺乏，疾病控制和进ー步研究エ 作无法有效开展。ORFV基因组全长约138kb，G+C含量丰富(63%_64%)，含132个基因。通过对羊ロ 疮病毒不同株(系)的基因组分析表明，0RFV059基因编码的是ー个免疫显性蛋白。该蛋白定位于成熟病毒粒子胞膜，是C端锚定蛋白，与痘苗病毒H3L免疫显性蛋白结构相似， 它在病毒成熟、吸附、病毒致病的分子机制以及疾病诊断和亚单位疫苗研发等过程中具有重要作用。因此，0RFV059有作为潜在的临床诊断靶标的可能，制备0RFV059的单克隆抗体具有十分重要的意义，可以为该蛋白功能的研究奠定基础，同时为其作为疾病标志物的可行性提供实验数据支持。由于0RFV059定位于成熟病毒粒子胞膜，通常在组织标本中表达量较高，具有临床检测和验证的价值。由此，制备能用于临床标本免疫组化检测的0RFV059单克隆抗体进行大批量组织标本的验证，可为其作为羊ロ疮临床诊断靶标的验证提供有力工具。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供ー种能用于ELISA、western-blot、免疫荧光以及免疫组织化学检测的抗羊ロ疮病毒蛋白0RFV059单克隆抗体。为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案
本发明所述的检测羊ロ疮病毒蛋白0RFV059的抗体是用原核重组表达的0RFV059蛋白作为抗原免疫BALB/C小鼠获得，并用細胞融合技术获得产生这种抗体的杂交瘤細胞株G3， 杂交瘤細胞分泌的抗体为IgG2b阳性，轻链为κ型。所述抗羊ロ疮病毒蛋白0RFV059单克隆抗体杂交瘤G3，于2011年11月4日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No. M25。本发明中羊ロ疮病毒蛋白0RFV059的氨基酸序列为AAR981M，如SEQ ID NO :1所示。本发明中羊ロ疮病毒蛋白0RFV059的基因序列为AY386^3，如SEQ ID NO :2所示。本发明中0RFV059的全长基因是由羊ロ疮病毒基因组为模板，由PCR扩增获得。 扩增 0RFV059 基因的引物序列为上游引物5，-CATTAAC CATGGATCCACCCGAAATCACGGC-3， (SEQ ID NO :3)，下游引物5，- AATCATCTCGAGCACGATGGCCGTGACCAGCAGC-3，(SEQ ID NO 4)。上游引入NcoI内切酶位点，下游引入)ChoI内切酶位点。原核表达载体选择pETjSa (+ )。所述的保藏号为CGMCC No. 5425的杂交瘤細胞株G3的制备方法是取血清效价大于1 IO5的BALB/c小鼠脾细胞与SP2/0骨髄瘤細胞按常规方法用50% PEG-4000进行融合；用含20%小牛血清的HAT RPMI-1640培养基筛选融合細胞，用重组表达的0RFV059蛋白包被ELISA板，进行ELISA筛选；经过多次有限稀释，最后获得稳定分泌抗0RFV059单克隆抗体的杂交瘤細胞株，标记为G3。应用此株杂交瘤细胞以IX IO6/只的量注入石蜡预处理的8-10周龄的BALB/c雌性小鼠腹腔，饲养观察10-14天后小鼠腹部膨大时抽取腹水。采用亲和色谱法!3rotein G Sepharose Fast Flow纯化单克隆抗体，以SDS-PAGE鉴定单克隆抗体的纯度，纯度达到90%以上。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果
本发明以重组0RFV059蛋白包被ELISA板，通过ELISA法检测纯化抗体的活性，并用此纯化抗体对纯化的羊ロ疮病毒蛋白进行Wfestern-blot证明该抗体可以识别0RFV059蛋白。本发明将此纯化抗体用于进行羊ロ疮病毒的免疫荧光染色以及羊ロ疮组织的免疫组化染色证明其能识别天然的0RFV059蛋白。此株杂交瘤細胞分泌的单克隆抗体为进ー 步研究的0RFV059功能和开发0RFV059的诊断试剂奠定了基础，为其作为羊ロ疮临床诊断和治疗靶标的验证提供有力的工具。本发明的单克隆抗体其免疫原是原核重组表达0RFV059全长蛋白，其氨基酸序列为AAR981M，全长338个氨基酸。本发明的单克隆抗体除了能应用于ELISA和Wfestern检测变性0RFV059蛋白以外还可以应用于細胞免疫荧光和临床羊ロ疮组织标本免疫组化研究检测未变性的天然0RFV059蛋白，同时降低了应用成本。本发明的单克隆抗体能特异性识别多种羊ロ疮病毒分离株的0RFV059蛋白，与痘病毒科的其它病毒，如羊痘病毒、鸡痘病毒、痘苗病毒等无交叉反应。目前国内外尚无针对羊ロ疮病毒特异性抗体，而本发明的抗体不仅能与变性蛋白结合，还能与具有高级结构的天然蛋白结合，从而能应用于免疫荧光和免疫组化实验。本发明针对0RFV059全长蛋白制备出的单克隆抗体对检测该蛋白具有较高的特异性和灵敏度，该抗体的应用将为0RFV059功能研究和其作为羊ロ疮标志物的临床标本验证工作提供支持。目前国内外尚未有商品化0RFV059的抗体，且其单抗亚型为IgG2b 型，能用于ELISA.western-blot、免疫荧光以及免疫组织化学检测，从而为该蛋白作为临床靶标验证及其功能的研究奠定了坚实的基础。
图1是本发明单抗G3对羊ロ疮病毒免疫印迹的結果，其结合条带的分子量约为 39kDa。1. 10 μ g OFTu细胞裂解蛋白；2. 2 μ g纯化病毒蛋白；3. 2 μ g纯化重组0RFV059蛋白。图2是本发明单抗G3对羊ロ疮病毒免疫荧光染色的結果，5 MOI羊ロ疮病毒感染 OFTu細胞，分別于接种后10、12和M小时收集細胞，4%多聚甲醛固定，先后用单抗G3及绿色荧光标记的羊抗鼠ニ抗孵育，DAPI染色，荧光显微镜下观察結果。图3是本发明单抗G3对羊ロ疮病变组织免疫组织化学染色的結果，A.抗 0RFV059单克隆抗体G3，B.正常鼠血清(阴性对照)，(显微镜放大倍数400倍)。
具体实施例方式实施例1 本发明单克隆抗体的制备和鉴定 1、单抗G3的制备
1)重组0RFV059抗原制备
以羊ロ疮病毒基因组为模板，经PCR扩增获得全长0RFV059基因，构建原核重组表达载体 pET28a(+)/0RFV059，在大肠杆菌fecヵ ricヵia coli BL21 中表达，利用 Ni Sepharose 亲和层析纯化柱进行纯化，获得纯度达90%以上的重组0RFV059蛋白。2)免疫小鼠
以纯化的重组抗原免疫6-8周龄雌性BALB/c小鼠。第一次免疫取重组抗原与等体积的Bentonite佐剂混勻后，以每只 50 μ g/500 μ L的量腹腔内注射BALB/c小鼠；
第二次免疫隔2周后，取重组抗原与等体积的Bentonite佐剂混勻后，以每只 50 μ g/500 μ L的量腹腔内注射BALB/c小鼠；
第三次免疫再隔2周后，取重组抗原与等体积的Bentonite佐剂混勻后，以每只 50 μ g/500 μ L的量腹腔注射BALB/c小鼠；第三次免疫10天后小鼠尾静脉取血，以重组抗原包被，ELISA检测血清效价，取效价大于1:105的小鼠脾细胞与骨髄瘤细胞进行融合； Bentonite佐剂使用商品化产品。3)免疫血清效价測定
采用间接ELISA法测定免疫血清效价。取50yg重组0RFV059蛋白溶解于IOml 0. 05M PH9. 6碳酸盐缓冲液，包被聚苯乙烯微96孔板，100 μ 1/孔，4°C过夜。使用PBS(含有0. 05% (V/V) Tween-20)洗板三次，用IOmM PBS含1 % BSA封闭液100 μ 1/孔，37°C封闭2h，使用PBS (含有0.05% (V/V) Tween-20)洗板三次，第三次免疫后10天小鼠尾静脉采血，鼠免疫血清用含1 % BSA IOmM PBS进行1(Γ2 1(Γ8倍稀释，加入96孔板，100 μ 1/孔37°C lh, PBS (含有0.05% (V/V) Tween-20)洗板三次后，加入1 :10000倍稀释辣根过氧化物酶标记羊抗小鼠IgG (Sigma，INC. )，100μ 1/孑し37 °C 30min，同上洗板后，TMB显色，100 μ 1/孔，室温避光10min，_ 50 μ 1/孔2Μ H2SO2终止反应，测450nm吸收值，以免疫前小鼠血清作为阴性对照，以测定值与对照值得比> 2. 1为阳性来判断免疫血清的效价。4)杂交瘤的制备
取血清效价大于1: IO5的小鼠，融合前3天，取重组抗原与等体积的PBS混勻后，以每只50 μ g/500 μ L的量腹腔注射BALB/c待融合小鼠进行加强免疫。无菌取小鼠脾脏，制成脾细胞悬液与对数生长期的小鼠骨髄瘤細胞株SP2/0按1 :1的比例混合，IOOOXg室温离心5min，弃上清，用手指轻弹离心管底部，使沉淀松散，离心管置于37°C水浴中，将在37°C 水浴保温的50%聚乙ニ醇(PEG, MW4000，Sigma)用滴管一滴滴加入离心管中，边滴边摇动离心管，Imin内滴完，滴完后静置2min，每隔1分钟加入37°C预热的无血清1640培养基1ml、 2ml,3ml,4ml,5ml和IOml来终止聚乙ニ醇的作用，细胞混合物1000Xg室温离心5min，弃上清，加入HAT培养液(次黄嘌呤(H)、氨基喋呤(A)和胸腺嘧啶核苷(T) (HAT, Sigma))轻轻重悬細胞，将细胞分至96孔板中，每孔200μ 1。培养三天后，观察細胞融合情況，更换ー 半HAT培养液，连续数日，直至有克隆形成，融合后七天更换HT培养液(次黄嘌呤(H)和胸腺嘧啶核苷(T) (HT，Sigma))培养。5)筛选分泌抗0RFV059单克隆抗体的杂交瘤細胞
间接ELISA法筛选细胞培养上清，选择效价较高的阳性克隆杂交瘤细胞进行亚克隆化，并用有限稀释法连续克隆化2-3次，直至到100%细胞阳性率，最后获得稳定分泌抗 0RFV059单克隆抗体細胞株，标记为G3。将克隆化后阳性率达100%的细胞扩增培养后液氮冻存。6)腹水的制备和纯化
将G3杂交瘤細胞株以IX IO6/只的量注入液体石蜡预处理的8-10周龄的BALB/c雌性小鼠腹腔，饲养观察10-14天后小鼠腹部膨大时抽取腹水。采用亲和色谱法ftOtein G Sepharose Fast Flow纯化单克隆抗体，以SDS-PAGE测定单克隆抗体的纯度，纯度达到90% 以上。2、本发明单克隆抗体的特性鉴定
1)抗体浓度的測定经杂交瘤細胞CGMCC No. 5425制备的腹水经纯化后获得0RFV059 单克隆抗体G3，使用BIO-RAD公司生产的Smart Spec plus核酸蛋白测定仪測定，其浓度为 0. 51mg/ml。2)抗体亚型鉴定采用Roche公司的鼠单抗亚型鉴定试剂盒鉴定杂交瘤細胞株的亚型，G3分泌抗体的亚型为IgG2b型，轻链为κ链。3)纯化抗体的效价鉴定50 μ g重组0RFV059抗原溶于IOml pH9. 6的0. 05M碳酸盐包被缓冲液中，加入96孔板，每孔100yL，4°C过夜。PBS (含有0. 05% (V/V) Tween-20) 洗板三次，用IOmM PBS含1 % BSA封闭液150 μ 1/孔，37°C封闭2h，使用PBS (含有0. 05% (V/V) Tween-20)洗板三次，每孔加入100 μ 1纯化抗体，37°C孵育lh, PBS (含有0. 05% (V/ V) Tween-20)洗板三次，加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG多克隆抗体为ニ杭，37°C孵育 30min, PBS (含有 0. 05% (V/V) Tween-20)洗板三次，每孔加入 100 μ 1，TMB 显色，37°C 孵育15min后，加入2M H2SO4溶液终止反应，酶标仪在吸光度值450 nm处检測。4)抗体的Wfestern blot鉴定0FTu細胞裂解蛋白、纯化的羊ロ疮病毒蛋白及重组 0RFV059蛋白用2XSDS裂解缓冲液裂解后上样，经12%SDS_PAGE后用Bio-Rad电转移装置将蛋白转移至PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭lh，pH7. 4的Tris-HCl缓冲液(含有0. 1% (V/ V) Tween-20)洗膜3次，每次5min，1 1000加入经纯化的杂交瘤细胞CGMCC No. 5425制备的抗0RFV059单克隆抗体G3，4°C孵育过夜，pH7. 4的1Tris-HCl缓冲液(含有0. 1% (V/ V) Tween-20)洗膜3次，每次5min，加入1:10000稀释的羊抗鼠IgG多克隆抗体(Sigma) 为ニ杭，室温孵育2h，TBST洗膜3次，用滤纸吸去多余的溶液，平铺于干净的保鲜纸上，加入 L4ml Pierce-Thermo Scientific ECL 系列 Western 化学发光底物反应液(A:B=1 1)， 使膜完全浸润于反应液中，迅速取出，用滤纸吸去多余液体，铺于另一张保鲜紙上，用保鲜纸把膜包好，放入X射线摄影暗盒，在暗房中显影。杂交瘤細胞CGMCC No. 5425制备的抗 0RFV059单克隆抗体G3出现单ー的特异性条带，结果如图1所示。5)抗体的免疫荧光鉴定收集原代绵羊胎儿鼻甲骨(OFTu)細胞铺于玻璃片上生长过夜，羊ロ疮病毒(ORFV)感染(M0I=5)，分别于10、12J4h后收集細胞，PBS洗涤細胞， 使用预冷的多聚甲醛固定細胞，加入杂交瘤細胞CGMCC No. 5425制备的抗0RFV059单克隆抗体G3(l:1000稀释)，室温孵育lh，以PBS为阴性对照。PBS洗片后1 1000加入Alex488 (緑色荧光)标记的羊抗鼠ニ抗(Sigma)，室温孵育lh，DAPI (蓝色)染色lOmin，PBS洗片后，荧光显微镜下观察，经抗0RFV059单克隆抗体G3染色的細胞均观察到绿色荧光，如图2 所示。结果证明杂交瘤細胞CGMCC No. 5425制备的抗0RFV059单克隆抗体G3可识别天然的0RFV059蛋白。6)抗体的免疫组化(IHC)鉴定收集患羊病变组织，利用纯化后的杂交瘤細胞 CGMCC No. 5425制备的抗0RFV059单克隆抗体G3 (1 1000稀释)进行免疫组化染色，使用福建迈新公司的免疫组化试剂盒，染色方法參照迈新试剂盒说明书，DAB显色，阴性对照组以正常鼠血清代替一杭，结果发现经抗0RFV059单克隆抗体G3染色的组织标本上細胞被染成棕黄色，如图3所示。病变组织的免疫组化染色结果证明杂交瘤細胞CGMCC No. 5425制备的抗0RFV059单克隆抗体G3可识别天然的0RFV059蛋白。7)抗体对不同羊ロ疮病毒分离株和其它痘病毒的反应性检测采用ELISA和 IHC方法检测抗0RFV059单克隆抗体G3对不同羊ロ疮病毒分离株和其它种属痘病毒的反应性。结果如表1所示，抗0RFV059单克隆抗体G3能识别从中国分离的各不同地区的ORFV 分离株以及美国标准ORFV分离株0V-IA82，而与其它种属的痘病毒，如痘苗病毒、羊痘病毒和鸡痘病毒无交叉反应。表1.本发明单抗G3对不同羊ロ疮病毒分离株和其它痘病毒的反应性
权利要求
1.ー种抗羊ロ疮病毒0RFV059单克隆抗体杂交瘤細胞株G3，于2011年11月4日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No. M25。
2.ー种抗羊ロ疮病毒0RFV059单克隆抗体G3，其特征是由权利要求1所述杂交瘤細胞株G3分泌所得。
3.权利要求1所述抗羊ロ疮病毒0RFV059单克隆抗体杂交瘤細胞株G3的制备方法， 其特征是取血清效价大于1 :105的BALB/c小鼠脾细胞与SP2/0骨髄瘤細胞按常规方法用 50%PEG-4000进行融合；用含20%小牛血清的HAT RPMI-1640培养基筛选融合細胞，用重组表达的羊ロ疮病毒0RFV059蛋白包被ELISA板，进行ELISA筛选；经过多次有限稀释，最后获得稳定分泌抗羊ロ疮病毒0RFV059单克隆抗体的杂交瘤細胞株，标记为G3。
4.一种检测羊ロ疮病毒0RFV059表达情况的免疫检测试剂，其特征是含有权利要求2 所述抗羊ロ疮病毒0RFV059单克隆抗体G3。
全文摘要
本发明公开了一种羊口疮病毒蛋白ORFV059单克隆抗体杂交瘤G3及单克隆抗体。一种抗羊口疮病毒ORFV059单克隆抗体杂交瘤细胞株G3，于2011年11月4日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.5425。本发明以重组ORFV059蛋白包被ELISA板，通过ELISA法检测纯化抗体的活性，并用此纯化抗体对纯化的羊口疮病毒蛋白进行Western-blot证明该抗体可以识别ORFV059蛋白。本发明将此纯化抗体用于进行羊口疮病毒的免疫荧光染色以及羊口疮组织的免疫组化染色证明其能识别天然的ORFV059蛋白。此株杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体为进一步研究的ORFV059功能和开发ORFV059的诊断试剂奠定了基础，为其作为羊口疮临床诊断和治疗靶标的验证提供有力的工具。
文档编号C12N5/20GK102533666SQ20121001739
公开日2012年7月4日 申请日期2012年1月19日 优先权日2012年1月19日
发明者廖小青, 李宏, 李明, 罗树红, 郝文波 申请人:南方医科大学