专利名称：一种铅离子荧光dna探针及铅离子浓度的荧光测定方法
技术领域：
本发明涉及铅离子浓度的检测分析领域，具体地涉及一种铅离子荧光DNA探针及利用该探针进行铅离子浓度的荧光测定方法。
背景技术：
铅是分布广、有蓄积性的环境污染物。铅是性质稳定的重金属元素，其对人体极为有害，尤其严重危害儿童的健康。随着工业和其他行业的迅速发展，人们对铅的大量使用， 使得铅污染已经从职业环境向水、大气、食品、医药等人们的日常生活环境扩展。在环境检测、口岸快速筛查、消费品安全、废水处理和工业过程中，对铅的灵敏、快速的筛查和准确的定量十分重要。目前，在分析实验室内对于痕量铅的主要测试方法集中在原子吸光光谱法(洪颖，陈国松，张红漫等，《广东微量元素科学》2004, 11 (4) 62飞6 ； 许财钦，《中国公共卫生》，2005，21 (3)，361)，ICP-AES法(陈文新，方奕文，光谱实验室， 2003(20) 4，495 497)，ICP-MS法(陈虹，张素珍，吴小均，《安徽农业科学》，2010，38 (23)， 12509 12513)。这些方法对铅的检出限在10 μ g/kg lmg/kg，而这些方法均需要大型设备和燃烧气，成本较高，不易微型化。双硫腙测定铅具有较好稳定性和高灵敏度(测定范围在1(Γ 400mg/kg)，已建立了成熟的国标方法(GB7470-87《水质铅的测定双硫腙分光光度法》)，但由于试验过程中涉及有毒有机溶剂，该方法不利于环境保护。另一方面，纳米生物技术的快速发展为检测技术变革提供了新的方向。随着能够与金属离子选择性结合的离子载体纷纷出现，人们在此基础上发展了多种重金属离子的检测方法。脱氧核酶(DNAzyme)是一种具有使RNA水解作用的单链DNA分子，又称为催化性 DNA，它可以通过体外筛选(SELEX)技术得到。部分脱氧核酶的活性与某些金属离子密切相关，且脱氧核酶具有易于合成和修饰、高稳定性和环境友好等优点(Lu Y. Chem. Eur. J. [J],2002，8(20) :4588^4596 ；Li J.,Zheng W.，Kwon A. H.，et al.. Nucleic Acids Res. [J]，2000，28 (2) :481-488 ；Xiao Y. ,Rowe A. A.，Plaxco K. ff. . J. Am. Chem. Soc [J]， 2007,129(2) :262-263)。其中Yi Lu小组利用对Pb2+敏感的17E脱氧核酶(DNAzyme)分子开发了一系列检测Pb2+的荧光、比色传感器(Li J. et. al, J. Am. Chem. Soc. , 2000， 122:10466-10467 ；Liu J. et. al. , Anal. Chem. , 2003，75: 6666-6667)。这些传感器多是在17E脱氧核酶及其底物链上标记荧光信号分子及猝灭分子，利用Pb2+切割后脱氧核酶构象变化导致的荧光信号变化来定量Pb2+浓度。这些传感器由于需要进行DNA链的双标记，甚至三标记，成本较高。同时，由于在室温下，切割后的底物链可能重新与17E脱氧核酶杂交，为了获得较低的荧光背景，试验操作温度须严格控制在4°C以下，实验条件较严格。 因此，现有利用17E脱氧核酶及底物链多标记探针检测Pb2+的方法存在着操作难点多、不易推广等不足。本发明解决了现有技术利用17E脱氧核酶检测Pb2+的方法中的实验条件要求高、 需对DNA探针多次标记、操作复杂等缺点，提出一种由17E脱氧核酶及FAM荧光素标记的底物链组成的单标记、高灵敏的新型铅离子荧光DNA探针，以纳米金胶作为FAM荧光素的猝灭剂，进行铅离子浓度的荧光检测。本发明不仅保持了 17E脱氧核酶的高灵敏度、高特异性， 还大大降低了铅离子的检测成本。
发明内容
本发明提出了一种铅离子荧光DNA探针，包括17E脱氧核酶以及底物链杂交组成的双链，所述底物链的5’末端以FAM荧光素修饰；
其中，所述17E脱氧核酶的序列为
5' -CATCTCTTCTCCGAGCCGGTCGAAATAGTGAGT _3’ ；
所述底物链的序列为
5，-FAM-ACTCACTATMGGAAGAGATG-3，；
所述FAM荧光素如以下结构式(II)所示。
权利要求
1.一种铅离子荧光DNA探针，其特征在于，所述探针包括17E脱氧核酶以及底物链杂交组成的双链，所述底物链的5’末端以FAM荧光素修饰；其中，所述17E脱氧核酶的序列为5' -CATCTCTTCTCCGAGCCGGTCGAAATAGTGAGT _3’ ；所述底物链的序列为5，-FAM-ACTCACTAIMGGAAGAGATG-3，；所述FAM荧光素如以下结构式(II)所示。
2.如权利要求I所述的铅离子荧光DNA探针，其特征在于，所述探针如以下结构式(I) 所示。
3.一种利用如权利要求I所述铅离子荧光DNA探针进行铅离子浓度的荧光测定方法， 其特征在于，以17E脱氧核酶及底物链杂交组成的铅离子荧光DNA探针作为铅离子的识别元件，以底物链5’末端修饰的FAM荧光素作为荧光信号分子，以纳米金胶作为荧光猝灭剂， 利用FAM荧光素与所述铅离子荧光DNA探针单双链结合时的荧光信号差异，对待测样品中的铅离子浓度进行荧光检测。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述铅离子荧光DNA探针是由所述17E脱氧核酶及底物链在95°C、15min的退火条件下杂交组成。
5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，在铅离子存在的情况下，所述铅离子荧光 DNA探针中的底物链的第九及第十个核苷酸之间打开，所述铅离子荧光DNA探针解链。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述解链后的铅离子荧光DNA探针中的底物链与所述纳米金胶结合，所述FAM荧光素猝灭。
7.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述荧光检测在激发波长为494nm，发射波长520nm处进行。
8.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述铅离子浓度的检出限为2nmol/L。
全文摘要
本发明涉及铅离子浓度的检测分析领域，公开了一种铅离子荧光DNA探针，包括17E脱氧核酶以及底物链杂交组成的双链，底物链末端以FAM荧光素修饰。本发明还公开了一种利用探针进行铅离子浓度的荧光测定方法，以铅离子荧光DNA探针作为铅离子的识别元件，以底物链末端修饰的FAM荧光素作为荧光信号分子，以纳米金胶作为荧光猝灭剂，利用FAM荧光素与铅离子荧光DNA探针单双链结合时的荧光信号差异，对待测样品中的铅离子浓度进行荧光检测。本发明方法灵敏度高，对铅离子选择性好，且具有成本低、操作方便、检测快速等优点。
文档编号C12Q1/68GK102586429SQ20121001833
公开日2012年7月18日 申请日期2012年1月20日 优先权日2012年1月20日
发明者卫碧文, 吴继魁, 张俊玲, 林莉, 高欢 申请人:上海出入境检验检疫局机电产品检测技术中心