专利名称：一种提高喹乐霉素产量的发酵方法
技术领域：
本发明涉及一种发酵工艺，具体说是一种提高喹乐霉素产量的发酵方法。
背景技术：
粘细菌(Myxobacteria )是一类具有群体习性和复杂发育史的、革兰氏阴性单细胞的滑行细菌的总称。粘细菌能产生令人惊奇的多样的生物活性化合物，早在1947年研究者就粘细菌的发酵液能够抑制金黄色葡萄球菌的生长；1973年终于从粘细菌的发酵液中获得了活性物质——异支链脂肪酸；1977年粘细菌产生的Ambruticin的化学结构也被确定，该物质抗真菌能力强。粘细菌产生活性次级代谢产物的几率特别高，在可以溶解细菌的2000株粘细菌中，有55%的菌株可以产生生理活性物质；在700株可降解纤维素的粘细菌中，95%的菌株可以产生活性物质。在大约7500株已经分离出来的粘细菌中，发现了 100种具有主要骨架和600多种衍生物的化合物，包括芳香类、杂环类、醌类、大环类、聚醚类、多烯类、肽类化合物等。粘细菌产生的活性物质大部分具有抗真菌和抗肿瘤活性，如 Epothilones和Chivosazols等，分别对真核细胞的微管和肌动蛋白起作用，并且2007年美国FDA批准了纤维堆囊菌产生的埃博霉素B的半合成类似物ixabepilone (伊沙匹隆)用于乳腺癌的治疗。因此，粘细菌是一类新近引起广泛关注但却研究尚少的重要药源微生物类群。
权利要求
1.一株直立标桩菌，其特征是分类命名为直立标桩菌(份i^sateWa eracta)LY-122，已保藏与中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.5514。
2.一种用权利要求1所述的直立标桩菌(份i^sateWa eracta) LY-122生产喹乐霉的一种提高喹乐霉素产量的发酵方法，其特征在于其具体步骤为(1)斜面固体培养将直立标桩菌LStigmatella eracta) LY-122接种在固体斜面培养基上，25 35°C培养21天，得到斜面固体培养的菌种，备用；所述的固体斜面培养基配方为每1000 ml培养基，加入蛋白胨1.0 5.(^、葡萄糖1. 0 5. Og和琼脂17. Og,余量为水；(2)摇瓶种子培养取上述步骤(1)所制备的斜面固体培养的菌种，加入无菌水制成菌悬液，无菌水的加入量按照一环菌种加入3—5ml ；将菌悬液接种于液体种子培养基中，接种量为液体种子培养基体积的2 10%，培养温度25 ;35°C，搅拌速度100 200 r/min, pH 7. 0 7. 2，培养时间2 5天，得到摇瓶种子液，备用；所述的液体种子培养基配方为每1000 ml培养基，加入玉米淀粉0. 5 5. 0g、葡萄糖1. 0 10. 0g、酵母粉0. 5 5. 0g、氯化钙0. 5 2. Og和七水硫酸镁0. 5 2. 0g，余量为水，pH 7. 0 7. 2 ；(3)发酵罐培养将上述步骤(2)培养好的摇瓶种子液接种于发酵培养基中，接种量为发酵培养基体积的2 10%，培养温度25 35°C，搅拌速度120 300 r/min，每分钟通入发酵液的空气体积与发酵液的体积比为1 :2 1 :10，pH 7.0 7. 2，培养时间5 10天，其中，在发酵培养的第三天分别添加已除菌的乙酸钠水溶液、丙酮酸水溶液和甘氨酸水溶液，使其在发酵培养基中终浓度分别达到1. 0 10mg/lU. 0 10 ml/1和1. 0 10mg/l，然后继续培养，即可得含有喹乐霉素的发酵液；所述的发酵培养基配方如下每1000 ml培养基，加入花生饼粉1. 0 10. 0g、葡萄糖5 15. 0g、玉米浆1. 0 5. 0g、大豆蛋白胨1. 0 5. 0g、氯化钙0. 5 2. 0g、硫酸镁0. 5 2. Og和磷酸二氢钾0. 5 2. Og,余量为水，pH 7. 0 7. 2 ；(4)、喹乐霉素的提取采用离心、萃取、大孔树脂柱层析和结晶的方法，从上述步骤(3)所得到的含有喹乐霉素的发酵液中提取喹乐霉素。
3.如权利要求2所述的一种提高喹乐霉素产量的发酵方法，其特征在于所述的乙酸钠水溶液、丙酮酸水溶液和甘氨酸水溶液的制备方法为准确称取乙酸钠IOOmg和甘氨酸IOOmg,量取丙酮酸100ml，分别溶于100ml去离子水中，经0. 45微米滤膜过滤除菌后，备用。
4.如权利要求2所述的一种提高喹乐霉素产量的发酵方法，其特征在于喹乐霉素提取的具体方法为取所制备的发酵液，5000 10000转/分钟离心10 15分钟去沉淀得到上清液，在所得上清液中加入上清液体积的1 3%的乙酸进行酸化处理后，用滤纸过滤，滤液用2倍体积的氯仿萃取，得到的氯仿萃取液加入同等体积的质量浓度为1 3%氢氧化钠水溶液，静置1小时，所得的有机溶剂氯仿层通过转蒸发仪45°C旋转蒸发去除溶剂，得喹乐霉素的粗提物；然后在室温下，采用100gHPD300大孔树脂吸附层析，所使用层析柱为3cmX40cm层析柱，洗脱方法为依次用1倍层析柱体积的体积浓度为5%甲醇、2倍层析柱体积的体积浓度为40%甲醇和2倍层析柱体积的体积浓度为80%乙醇洗脱，收集流出量为2. 5 倍层析柱体积至4倍层析柱体积的洗脱液，洗脱液55°C旋转蒸发浓缩干燥，干燥物再溶解于体积比为1 :1 2的丙酮和苯混合液中，于4 10°C条件下，静置1 M小时，析出晶体，晶体45°C干燥后即得纯度为85-90%的喹乐霉素。
全文摘要
一种提高喹乐霉素产量的发酵方法，采用一株已保藏与中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.5514的直立标桩菌(Stigmatellaeracta)LY-122发酵生产喹乐霉素，通过对直立标桩菌LY-122发酵培养基和发酵条件的改良，并结合添加前体的方法，使喹乐霉素的产量比目前已报道的产量高12-14倍，且产量稳定，基本维持在15mg/l左右，纯度可达85-90%；本发明主要使用一些价格低廉的花生饼粉、葡萄糖和玉米浆等作为发酵培养基，同时在发酵过程中不需要加入价格昂贵的XAD-16大孔吸附树脂，降低了工艺成本；在提取工艺中，采用常见的离心、萃取、大孔树脂柱层析和结晶等方法，更适合大规模生产。
文档编号C12P17/18GK102559556SQ201210018410
公开日2012年7月11日 申请日期2012年1月20日 优先权日2012年1月20日
发明者原江锋, 王大红 申请人:河南科技大学