专利名称：一种谷氨酸转运蛋白-1基因的cRNA 原位杂交探针及其制备方法
技术领域：
本发明属于生物医学领域，涉及ー种探针及其制备方法，尤其是谷氨酸转运蛋白-I基因的CRNA原位杂交探针及其制备方法。
背景技术：
谷氨酸是哺乳动物中枢神经系统最重要的神经递质，在体内主要与亲离子性和亲代谢性两种谷氨酸受体家族结合发挥活化作用。谷氨酸如果在细胞外浓度过高，过度兴奋 谷氨酸受体可导致神经细胞死亡，由于细胞外没有能分解谷氨酸的酶，释放的谷氨酸几乎完全依赖神经元以及神经胶质细胞膜上的谷氨酸转运蛋白(EAAT)的摄取来保持浓度的相对稳定，同时EAAT也为体内很多代谢途径提供谷氨酸来源。谷氨酸转运蛋白分高亲合力和低亲合力转运蛋白两种，高亲合力转运蛋白都作用于依赖钠-钾的L-谷氨酸，L-和D-天冬氨酸，所以也称为钠-钾谷氨酸转运蛋白或兴奋性氨基酸转运蛋白(Excitatory aminoacid transporter, KAAT);目前已有五种被克隆,它们是它们是谷氨酸转运蛋白-1 (EAAT1或 GLAST, Glutamate-aspartate transporter),谷氨酸转运蛋白-2 (EAAT2 或 GLT, glialglutamate transporter),谷氨酸转;tS 蛋 H -3 (EAAT3EAAC, excitatory amino acidCarrier),谷氨酸转运蛋白-4(EAAT4)和谷氨酸转运蛋白-5(EAAT5)。在形态学研究方面，关于谷氨酸转运蛋白-I基因在活体动物中mRNA水平的检测显示尚属空白。
发明内容
本发明的目的在于提供一种谷氨酸转运蛋白-I基因cRNA原位杂交的探针及其制备方法。本发明的目的是通过以下技术方案来解决的一种谷氨酸转运蛋白-I基因的cRNA原位杂交的探针，该探针的序列为5 ' TCCTGCCTCTCCTCTACTTCCTGGTAACCCGGAAGAACCCCTGGGTTTTCATTGGAGGGTTGCTGCAAGCACTCATCACAGCCCTGGGGACCTCCTCAAGTTCTGCCACCCTGCCCATCACTTTCAAGTGCCTGGAAGAAAACAATGGTGTGGACAAACGCATCACCAGATTTGTGCTTCCCGTGGGGGCCACCATTAACATGGATGGGACCGCCCTCTACGAGGCTTTGGCCGCCATTTTCATCGCTCAAGTTAACAACTTTGACCTGAATTTTGGACA 3'。所述探针的制备方法(I)根据谷氨酸转运蛋白-I的Gene bank序列我们设计了谷氨酸转运蛋白_1特异的引物，并且此对引物扩增出280bp的谷氨酸转运蛋白-I片段作为谷氨酸转运蛋白-I特异的探针序列；(2)构建谷氨酸转运蛋白-I的cRNA原位杂交的探针质粒；将探针质粒转化细菌后，细菌培养后进行测序；(3)制备谷氨酸转运蛋白-I的cRNA原位杂交探针；(4)检测谷氨酸转运蛋白-I的cRNA探针的原位杂交。
所述步骤(I)中谷氨酸转运蛋白-I特异的引物是上游引物是5' TCCTGCCTCTCCTCTACTTC 3'；下游引物是5' GTCCAAAATTCAGGTCAAAG 3'。述步骤⑵按照如下步骤进行(a)将大鼠的cDNA用设计的弓丨物进行PCR扩增；(b)将PCR产物用TIANGEN胶回收试剂盒进行胶回收；(c)将回收后的产物于4°C与多克隆位点两端具有T7，SP6启动子的载体进行连接; (d)将连接好的质粒转化细菌后，细菌培养后进行测序。所述步骤(3)按照如下步骤进行(a)步骤(2)得到的细菌测序正确后，经判断确认谷氨酸转运蛋白-I探针序列插入载体的顺序是反向的；(b)需要使用Xba I限制性内切酶对质粒进行酶切；(c)将酶切产物用TIANGEN胶回收试剂盒进行胶回收；(d)用T7RNA聚合酶对探针进行体外转录标记。所述步骤(4)按照如下步骤进行(a)将大鼠用O. 4戍巴比妥纳深麻后，经左心室摘管至升王动脉，用O. Olmol/L的DEPC-PBS的快速冲洗去除血液，再以4 %多聚甲醛灌注固定；所述的O. Olmol/LDEPC-PBS是2. 9克磷酸氢ニ钠，O. 29克磷酸ニ氢钠，9. O克氯化钠用超纯水定容至IL后，再加入体积百分比为O. 1%的DEPC Iml放置过夜后，高压灭菌制成的磷酸盐缓冲液；所述4%的多聚甲醛是40. O克多聚甲醛加入500. Oml蒸馏水加热使之解聚溶解后，再加入500. Oml的O. 2mol/L PB缓冲液定容至1000ml。所述O. 2mol/L PB缓冲液是用29. 01克磷酸氢ニ钠，2. 96克磷酸ニ氢钠加超纯水定容至500ml配制而成。(b)取材后进行脑组织的后固定于4°C，用4%的多聚甲醛后固定24小时；(c)将固定好的组织进行切片将组织切成25 30 μ m组织切片，并将切好的切片保存于O. Olmol/L的DEPC-PBS中，放于4°C冰箱备用；(d)将切好的组织片用O. Olmol/L的DEPC-PBS清洗I次，室温，每次5_10分钟；(e)将上述清洗过的片子用5xSSC清洗2次，室温，毎次5_10分钟；所述5xSSC是由20xSSC用超纯水稀释的，20xSSC为ー种柠檬酸缓冲液。(f)将5xSSC清洗后的组织片浸入预杂交液中，于55°C，在杂交炉孵育1_2小时；所述预杂交液是由5ml的去离子甲酰胺,2. 5ml的20xSSC溶液,200 μ I的50xDenhardt’ s溶液，50 μ I的浓度为200mg/ml的Heparin溶液，100 μ I的浓度为10mg/ml的tRNA溶液，100 μ I的浓度为10%的CHAPS溶液，100 μ I的浓度为10%的Tween-20溶液，100 μ I的浓度为0. 5mol/L的ρΗ8. O的EDTA溶液和I. 85ml的DEPC-H2O混合配制而成。所述50xDenhardt’s为ー种常用的杂交试剂；所述200mg/ml的Heparin为200mg的Heparin粉末溶于Iml的DEPC-H20中配制而成；所述10mg/ml的tRNA为IOmg的tRNA粉末溶于Iml的DEPC-H20中配制而成；所述10%的CHAPS为Ig的CHAPS溶于Iml的DEPC-H20中配制而成；所述10%的 Tween-20 为 100 μ I 的 Tween-20 溶于 900 μ I 的 DEPC-H20 中配制而成；所述 0. 5mol/L的ρΗ8· O的EDTA为186. Ig ニ水こニ胺四こ酸ニ钠加入800ml的DEPC-H20中在磁力搅拌器上剧烈搅拌，用NaOH调pH值至8. O然后定容至IL配制而成高压灭菌备用；所述DEPC-H2O为IL超纯水加入体积百分比为O. 1%的DEPC 1ml，放置过夜并高压灭菌处理后的水。(g)将预杂交孵育后的组织切片浸入杂交液中，于55°C，在杂交炉中孵育16-20小时；所述杂交液是上述预杂交液中加入终浓度为I. Oug/ml的cRNA探针配置成的。(h)杂交后用IxSSC洗涤杂交的组织切片，37°C，2次，每次10分钟；⑴用2xSSC洗涤上述的组织切片，37°C，2次，每次10-15分钟；(j)用 10ug/ml 的 RNase A 处理，37。。，I 次，每次 30-40 分钟；
(k)用2xSSC洗涤上述的组织切片，室温，I次，毎次10分钟；(I)用O. Olmol/L PBS洗涤上述的组织切片，室温，I次，每次10分钟；所述O. Olmol/L PBS是2. 9克磷酸氢ニ钠，0. 29克磷酸ニ氢钠，9. O克氯化钠用超纯水定容至IL配置的磷酸缓冲液。(m)按I : 2000的抗体效价,在PBS溶液中加入Anti-Digoxigenin-AP抗体,对洗涤后的组织切片进行孵育，室温，放置过夜；(η)将经过上步抗体孵育的组织片用0. 01mol/L PBS洗涤，于室温，清洗3次，毎次10-15分钟；(ο)用TS9. 5洗涤上述PBS洗涤后的组织片，室温，清洗2次，毎次15-20分钟；所述TS9. 5为是由终浓度为摩尔浓度为0. lmol/L Tris-HCl (PH 9. 5)，摩尔浓度为0. lmol/LNaCl溶液和摩尔浓度为50mmol/L MgCL2用超纯水配制而成；(P)将上述切片放于NBT-BCIP反应液中避光孵育4 6小时，在此过程中观察切片呈色強度；所述NBT-BCIP是ー种Roche公司生产的呈色反应液。(q)当呈色完成后，将切片用PBS清洗3次，室温，毎次10-15分钟；(r)将上述洗涤后切片表于载玻片上；(s)晾干切片，再经过ニ甲苯脱色，封片，以备观察。本发明的有益效果是本发明对活体动物建立模型后进行灌注、取材、切片，通过地高辛标记的cRNA探针与组织中谷氨酸转运蛋白-I基因的mRNA发生特异性的结合，从而方便、准确的观察到组织中谷氨酸转运蛋白-I基因mRNA水平的变化。本发明使用的谷氨酸转运蛋白-I的探针序列，对谷氨酸转运蛋白-I基因mRNA的显示有明确的特异性，实现了对谷氨酸转运蛋白-I基因mRNA水平的显示作用。
图I为本发明的谷氨酸转运蛋白-I在海马的分布X4倍图；图2为本发明的谷氨酸转运蛋白-I在海马的分布X40倍图。
具体实施例方式下面结合附图对本发明做进ー步详细描述參见图I和图2，谷氨酸转运蛋白-I基因cRNA原位杂交探针的制备方法，按照如下步骤(I)根据谷氨酸转运蛋白-I的Gene bank序列我们设计了谷氨酸转运蛋白_1特异的引物，并且此对引物扩增出280bp的谷氨酸转运蛋白-I片段作为谷氨酸转运蛋白-I特异的探针序列；(2)构建谷氨酸转运蛋白-I的cRNA原位杂交的探针质粒；将探针质粒转化细菌后，细菌培养后进行测序；(3)制备谷氨酸转运蛋白-I的cRNA原位杂交探针；(4)检测谷氨酸转运蛋白-I的cRNA探针的原位杂交。探针的设计根据谷氨酸转运蛋白-I的Gene bank序列我们设计了谷氨酸转运蛋白-I特异的引物，并且此对引物扩增出280bp的谷氨酸转运蛋白-I片段作为谷氨酸转运蛋白-I特异的探针序列。谷氨酸转运蛋白-I特异的引物如下 上游引物5' TCCTGCCTCTCCTCTACTTC 3'；下游引物5' GTCCAAAATTCAGGTCAAAG 3'。谷氨酸转运蛋白-I特异的探针序列5 ' TCCTGCCTCTCCTCTACTTCCTGGTAACCCGGAAGAACCCCTGGGTTTTCATTGGAGGGTTGCTGCAAGCACTCATCACAGCCCTGGGGACCTCCTCAAGTTCTGCCACCCTGCCCATCACTTTCAAGTGCCTGGAAGAAAACAATGGTGTGGACAAACGCATCACCAGATTTGTGCTTCCCGTGGGGGCCACCATTAACATGGATGGGACCGCCCTCTACGAGGCTTTGGCCGCCATTTTCATCGCTCAAGTTAACAACTTTGACCTGAATTTTGGACA 3'谷氨酸转运蛋白-I的cRNA原位杂交的探针质粒的构建I.将大鼠的cDNA用设计的弓丨物进行PCR扩增。2.将PCR产物用TIANGEN胶回收试剂盒进行胶回收。3.将回收后的产物于4°C与多克隆位点两端具有T7，SP6启动子的载体进行连接。4.将连接好的质粒转化细菌后，摇菌培养送金斯瑞公司进行测序。谷氨酸转运蛋白-I的cRNA原位杂交探针的制备I.测序正确后，经判断确认谷氨酸转运蛋白-I探针序列插入载体的顺序是反向的。2.需要使用Xba I限制性内切酶对质粒进行酶切，3.将酶切产物用TIANGEN胶回收试剂盒进行胶回收。4.用T7RNA聚合酶对探针进行体外转录标记，体外转录的试剂盒(AmbionMEGAscript)是Ambion公司的产品。谷氨酸转运蛋白-I的cRNA探针的原位杂交检测I.将大鼠用O. 4%戊巴比妥钠深麻后，经左心室插管至升主动脉，用O. Olmol/L的DEPC-PBS的快速冲洗去除血液，再以4%多聚甲醛灌注固定。2.取材后进行脑组织的后固定于4°C，用4%的多聚甲醛后固定24小时。3.将固定好的组织进行切片将组织切成25 30 μ m组织切片，并将切好的切片保存于O. Olmol/L DEPC-PBS中，放于4°C冰箱备用。4.将切好的组织片用O. Olmol/L DEPC-PBS清洗I次，室温，每次5分钟。5.将上述清洗过的片子用5xSSC清洗2次，室温，毎次5分钟。6.将5xSSC清洗后的组织片浸入预杂交液中，于55°C，在杂交炉孵育I小吋。7.将预杂交孵育后的组织切片浸入杂交液中，于55°C，在杂交炉中孵育16-20小时。8.杂交后用IxSSC洗涤杂交的组织切片，37°C，2次，每次10分钟。9.用2xSSC洗涤上述的组织切片，37°C，2次，每次10分钟。10.用 10ug/ml 的 RNase A 处理，37°C，I 次，每次 30 分钟。11.用2xSSC洗涤上述的组织切片，室温，I次，毎次10分钟。12.用O. Olmol/L PBS洗涤上述的组织切片，室温，I次，每次10分钟。13.按 I : 2000 的抗体效价，在O. Olmol/L PBS溶液中加入Anti-Digoxigenin-AP抗体，对洗涤后的组织切片进行孵育，室温，放置过夜。
14.将经过上步抗体孵育的组织片用0. Olmol/L PBS的洗涤，于室温，清洗3次，每次10分钟。15.用TS9. 5洗涤上述0. 01mol/L PBS洗涤后的组织片，室温，清洗2次，每次15分钟。16.将上述切片放于NBT-BCIP反应液中避光孵育4 6小时，在此过程中观察切
片呈色強度。17.当呈色完成后，将切片用0. 01mol/L PBS清洗3次，室温，每次10分钟。18.将上述洗涤后切片表于载玻片上。19.晾干切片，再经过ニ甲苯脱色，封片，以备观察。所用试剂TIANGEN胶回收试剂盒公司天根货号DP214-02两端具有T7，SP6启动子的载体公司invitrogen货号K466001Xba I限制性内切酶公司=Takara 货号D1093AT7 RNA聚合酶试剂盒公司Ambion 货号AM133320xSSC公司invitrogen 货号AM976350xDenhardt’ s公司invitrogen 货号750018Heperine公司sigma 货号H3393tRNA公司sigma 货号R8759CHAPS公司sigma 货号C9426Tween-20公司sigma 货号P9416Anti-Digoxigenin-AP公司Roche 货号11093274910以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述掲示的方法及技术内容作出些许的更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，仍属于本发明技术方案的范围内。
权利要求
1.一种谷氨酸转运蛋白-1基因的CRNA原位杂交的探针，其特征在干，该探针的序列为5' TCCTGCCTCTCCTCTACTTCCTGGTAACCCGGAAGAACCCCTGGGTTTTCATTGGAGGGTTGCTGCAAGCACTCATCACAGCCCTGGGGACCTCCTCAAGTTCTGCCACCCTGCCCATCACTTTCAAGTGCCTGGAAGAAAACAATGGTGTGGACAAACGCATCACCAGATTTGTGCTTCCCGTGGGGGCCACCATTAACATGGATGGGACCGCCCTCTACGAGGCTTTGGCCGCCATTTTCATCGCTCAAGTTAACAACTTTGACCTGAATTTTGGACA 3'。
2.如权利要求I所述探针的制备方法，其特征在干 (1)根据谷氨酸转运蛋白-I的Genebank序列我们设计了谷氨酸转运蛋白-I特异的引物，并且此对引物扩增出280bp的谷氨酸转运蛋白-I片段作为谷氨酸转运蛋白-I特异的探针序列； (2)构建谷氨酸转运蛋白-I的cRNA原位杂交的探针质粒；将探针质粒转化细菌后，细菌培养后进行测序； (3)制备谷氨酸转运蛋白-I的cRNA原位杂交探针； (4)检测谷氨酸转运蛋白-I的cRNA探针的原位杂交。
3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(I)中谷氨酸转运蛋白-1特异的引物是 上游引物是 5' TCCTGCCTCTCCTCTACTTC 3'； 下游引物是 5' GTCCAAAATTCAGGTCAAAG 3'。
4.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)按照如下步骤进行 (a)将大鼠的cDNA用设计的引物进行PCR扩增； (b)将PCR产物用TIANGEN胶回收试剂盒进行胶回收； (c)将回收后的产物于4°C与多克隆位点两端具有T7，SP6启动子的载体进行连接； (d)将连接好的质粒转化细菌后，细菌培养后进行测序。
5.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)按照如下步骤进行 (a)步骤(2)得到的细菌测序正确后，经判断确认谷氨酸转运蛋白-I探针序列插入载体的顺序是反向的； (b)需要使用XbaI限制性内切酶对质粒进行酶切； (c)将酶切产物用TIANGEN胶回收试剂盒进行胶回收； (d)用T7RNA聚合酶对探针进行体外转录标记。
6.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)按照如下步骤进行 (a)将大鼠用O.4%戍巴比妥纳深麻后，经左心室摘管至升王动脉，用O. Olmol/L的DEPC-PBS的快速冲洗去除血液，再以4%多聚甲醛灌注固定；所述的O. Olmol/L DEPC-PBS是2. 9克磷酸氢ニ钠，O. 29克磷酸ニ氢钠，9. O克氯化钠用超纯水定容至IL后，再加入体积百分比为O. 1%的DEPC Iml放置过夜后，高压灭菌制成的磷酸盐缓冲液；所述4%的多聚甲醛是40. O克多聚甲醛加入500. Oml蒸馏水加热使之解聚溶解后，再加入500. Oml的O. 2mol/L PB缓冲液定容至IOOOml ;所述O. 2mol/L PB缓冲液是用29. 01克磷酸氢ニ钠，2.96克磷酸ニ氢钠加超纯水定容至500ml配制而成； (b)取材后进行脑组织的后固定于4°C，用4%的多聚甲醛后固定24小时； (c)将固定好的组织进行切片将组织切成25 30μ m组织切片，并将切好的切片保存于O. Olmol/L的DEPC-PBS中，放于4°C冰箱备用； (d)将切好的组织片用O.Olmol/L的DEPC-PBS清洗I次，室温，每次5_10分钟； (e)将上述清洗过的片子用5xSSC清洗2次，室温，每次5-10分钟；所述5xSSC是由20xSSC用超纯水稀释的，20xSSC为ー种柠檬酸缓冲液； (f)将5xSSC清洗后的组织片浸入预杂交液中，于55°C，在杂交炉孵育1-2小时； 所述预杂交液是由5ml的去离子甲酰胺，2. 5ml的20xSSC溶液，200 μ I的50xDenhardt’ s 溶液，50 μ I 的浓度为 200mg/ml 的 Heparin 溶液，100 μ I 的浓度为 IOmg/ml的tRNA溶液，100 μ I的浓度为10%的CHAPS溶液，100 μ I的浓度为10%的Tween-20溶 液，100 μ I的浓度为O. 5mol/L的ρΗ8· O的EDTA溶液和I. 85ml的DEPC-H2O混合配制而成；所述50xDenhardt’ s为一种常用的杂交试剂； 所述200mg/ml的Heparin为200mg的Heparin粉末溶于Iml的DEPC-H20中配制而成；所述10mg/ml的tRNA为IOmg的tRNA粉末溶于Iml的DEPC-H20中配制而成；所述10%的CHAPS为Ig的CHAPS溶于Iml的DEPC-H20中配制而成； 所述10%的Tween-20为100 μ I的Tween-20溶于900 μ I的DEPC-H20中配制而成；所述0. 5mol/L的pH8. O的EDTA为186. Ig ニ水こニ胺四こ酸ニ钠加入800ml的DEPC-H20中在磁力搅拌器上剧烈搅拌，用NaOH调pH值至8. O然后定容至IL配制而成高压灭菌备用；所述DEPC-H2O为IL超纯水加入体积百分比为0. 1%的DEPC 1ml，放置过夜并高压灭菌处理后的水； (g)将预杂交孵育后的组织切片浸入杂交液中，于55°C，在杂交炉中孵育16-20小时；所述杂交液是上述预杂交液中加入终浓度为I. 0ug/ml的cRNA探针配置成的； (h)杂交后用IxSSC洗涤杂交的组织切片，37°C，2次，每次10分钟； (i)用2xSSC洗涤上述的组织切片，37°C，2次，每次10-15分钟；(j)用 10ug/ml 的 RNase A 处理，37°C，I 次，毎次 30-40 分钟； (k)用2xSSC洗涤上述的组织切片，室温，I次，毎次10分钟； (I)用O. 01mol/L PBS洗涤上述的组织切片，室温，I次，每次10分钟；所述O. 01mol/LPBS是2. 9克磷酸氢ニ钠，0. 29克磷酸ニ氢钠，9. O克氯化钠用超纯水定容至IL配置的磷酸缓冲液； (m)按I : 2000的抗体效价,在PBS溶液中加入Anti-Digoxigenin-AP抗体,对洗漆后的组织切片进行孵育，室温，放置过夜； (η)将经过上步抗体孵育的组织片用0. Olmol/L PBS洗涤，于室温，清洗3次，毎次10-15分钟； (ο)用TS9. 5洗涤上述PBS洗涤后的组织片，室温，清洗2次，每次15-20分钟；所述TS9. 5为是由终浓度为摩尔浓度为0. lmol/L Tris-HCl (PH 9. 5)，摩尔浓度为0. lmol/LNaCl溶液和摩尔浓度为50mmol/LMgCL2用超纯水配制而成； (P)将上述切片放于NBT-BCIP反应液中避光孵育4 6小时，在此过程中观察切片呈色强度；所述NBT-BCIP是ー种Roche公司生产的呈色反应液； (q)当呈色完成后，将切片用PBS清洗3次，室温，每次10-15分钟； (r)将上述洗涤后切片表于载玻片上； (S)晾干切片，再经过ニ甲苯脱色，封片，以备观察。
全文摘要
本发明公开了一种谷氨酸转运蛋白-1基因的cRNA原位杂交探针及其制备方法，按照如下步骤(1)根据谷氨酸转运蛋白-1的Genebank序列我们设计谷氨酸转运蛋白-1特异的引物，并且此对引物扩增出280bp的谷氨酸转运蛋白-1片段作为谷氨酸转运蛋白-1特异的探针序列；(2)构建谷氨酸转运蛋白-1的cRNA原位杂交的探针质粒；将探针质粒转化细菌后，细菌培养后进行测序；(3)制备谷氨酸转运蛋白-1的cRNA原位杂交探针；(4)检测谷氨酸转运蛋白-1的cRNA探针的原位杂交。
文档编号C12Q1/68GK102643897SQ20121002200
公开日2012年8月22日 申请日期2012年2月1日 优先权日2012年2月1日
发明者李云庆, 武胜昔, 王文, 陈晶, 魏燕燕, 黄静 申请人:中国人民解放军第四军医大学