专利名称：抗hbv的化合物的筛选方法
技术领域：
本发明属于分子生物学与生物医药技术领域，具体而言，本发明涉及以乙型肝炎病毒(HBV)核心蛋白C末端氨基酸序列为药物作用靶位点的药物筛选方法。
背景技术：
慢性乙型病毒性肝炎感染是严重危害人类健康的全球性感染疾病。在中国，乙型肝炎病毒引起的肝脏疾病位列全国十大死因之一，严重影响了人们正常的工作和生活。目前，上市的小分子抗乙型肝炎病毒药物主要为核苷类药物，如拉米夫定、恩替卡韦等，尽管这些药物在抑制病毒复制上都卓有成效，但由于现有核苷类抗乙型肝炎病毒药物的作用靶点单一(HBV DNA聚合酶)，长期使用存在的耐药突变等问题。因此，寻找不同于核苷类抗HBV药物作用机制的新靶点，研发治疗乙型病毒性肝炎新型药物，尤其是非核苷类小分子抗HBV药物，是重要和紧迫的任务。已报道的非核苷类小分子抗HBV活性化合物有:异芳香二氢嘧啶(HAP)系列化合物，代表性化合物BAY38-7690，它同核心蛋白的113-143位氨基酸残基作用而干扰核心蛋白的组装过程，导致核心蛋白单体在细胞内过度累积而被降解；疏水性荧光探针bis-ANS能与核心蛋白结合，使之形成非壳体化的大分子多聚体，误导核心蛋白的正常装配过程，造成病毒基因组复制缺陷；苯丙烯酰胺类化合物AT-61和AT-130能够促进核心蛋白的组装速率，使得PgRNA来不及被包装，从而使得HBV-DNA复制水平降低；塞菊芋黄素同系化合物8-1能特异性地干扰宿主细胞的核转录因子与HBV启动子的相互作用，下调病毒RNA的转录水平。HBV核心蛋白C末端共计34个氨基酸，为鱼精蛋白样结构，其中有16个精氨酸，形成有3个SPRRR序列与4个精氨酸聚集区，为高碱性末端，可结合前基因组RNA与聚合酶复合物(PgRNA-Pol)启动核壳体包 装。目前尚未见有报道将核心蛋白C末端氨基酸作为药物作用靶点进行抗HBV药物的筛选。重组DNA技术是分子生物学中常用的一种生物技术，是指将一种生物体(供体)的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体(受体)内，使之按照人们的意愿稳定遗传并表达出新产物或新性状的DNA体外操作程序，也称为分子克隆技术。本发明通过重组DNA技术构建多种真核表达质粒来表达C末端缺失、截短或突变的核心蛋白，确定核心蛋白C末端4个带正电荷的精氨酸富集区域(RRRDRGR、SPRRR、SPRRRR和SPRRRR)为关键靶点，以此筛选的化合物能有效的诱导形成空载病毒颗粒，从而抑制病毒复制。
发明内容
针对现有技术中的不足，本发明人进行了广泛深入的研究，并最终完成了本发明。本发明的目的是提供一种抗HBV的化合物的筛选方法。根据本发明的目的，本发明提供了一种抗HBV的化合物的筛选方法，其中，该方法以HBV核心蛋白C末端氨基酸序列为药物作用靶点来筛选抗HBV的化合物，所述HBV核心蛋白C末端氨基酸序列至少包含STLPETTVVRRRDRGR。
本发明中，优选地，所述HBV核心蛋白C末端氨基酸序列可为:STLPETTVVRRRDRGRSPRRRTPSPRRRRSQSPRRRRSQSRESQC、STLPETTVVRRRDRGRSPRRRTPSPRRRRSQ、 STLPETTVVRRRDRGRSPRRRTP 或STLPETTVVRRRDRGRo具体地，所述方法包括以下步骤:(a)通过PCR的方法构建含有HBV核心蛋白C末端氨基酸序列的真核表达质粒，其中，所述HBV核心蛋白C末端氨基酸序列至少包含STLPETTVVRRRDRGR。(b)用步骤(a)中所得质粒瞬时转染肝癌细胞(Huh7细胞，HepG2细胞等细胞系，优选为Huh7细胞)4 6小时后给予筛选化合物处理48 96小时。(c)药物处理后收集细胞，以非变性琼脂糖凝胶电泳来筛选可诱导异常空载HBV核心颗粒包装的化合物。本发明中，优选地，所述步骤(b)中筛选化合物处理为:将转染的肝癌细胞或与筛选化合物共同培养，所述化合物的浓度可以根据需要而进行设定。所述步骤(C)具体为:经筛选化合物处理后收集细胞，取细胞裂解液上样于1.8%琼脂糖凝胶孔中，4°C电泳2 3小时，优选为2.5小时。电泳结束后，虹吸法转膜过夜。所得样品可转移至硝酸纤维素膜上，采用与蛋白质印迹法(Western blot)相似的方法，用抗HBc抗体(Abcam)检测由筛选化合物诱导产生的异常核心颗粒。所述异常核心颗粒是指不含HBV病毒遗传物质(病毒核酸)的空载HBV核心颗粒，可阻碍HBV病毒的进一步感染复制。本发明提供的筛选化合物的方法可用于筛选和发现诱导HBV核心颗粒的异常包装的抗HBV复制活性化合物，以期发现化合物作用于HBV核心蛋白C末端靶序列，诱导核心蛋白组装成为不含HBV病毒遗传物质(病毒核酸)的空载HBV核心颗粒，从而阻碍HBV病毒的进一步感染复制。而且，本发明提供的化合物的筛选方法还可以用于检测以其它方式获得的针对这些靶位点的用于治疗乙型病毒性肝炎的新型抗病毒药物的活性。相对于已有的技术，本发明提供的筛选方法的特异性针对性更强，并且(例如与IfepG2.2.15细胞系相比)更有利于抗病毒药物靶点的确定。
图1是根据本发明的实施例1中构建的质粒转染Huh7细胞(实施例6)，而得到的核心颗粒凝胶电泳图。图2是根据本发明的实施例2中构建的质粒转染Huh7细胞(实施例6)，而得到的核心颗粒凝胶电泳图。图3是根据本发明的实施例3中构建的质粒转染Huh7细胞(实施例6)，而得到的核心颗粒凝胶电泳图。图4是根据本发明的实施例4和5中构建的质粒转染Huh7细胞(实施例6)而得到的核心颗粒凝胶电泳图。图5是根据本发明的实施例7得到的核心颗粒凝胶电泳图。图6是根 据本发明的实施例8得到的HBV DNA凝胶电泳图。
图7是根据本发明的实施例9得到的实时荧光定量PCR结果图。图8是根据本发明的实施例10得到的实时荧光定量PCR结果图。图9是根据本发明的实施例1的PCR反应程序的图。图10是根据本发明的实施例2的PCR反应程序的图。图11是根据本发明的实施例9的PCR反应程序的图。
具体实施例方式以下实施例将有助于本领域的普通技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。实施例1:构建针对靶序列HBc-1的全 长HBV核心蛋白真核表达质粒pHBcl85以表达1.3倍全长HBV基因组(adw亚型)pHBVl.3为模板，克隆编码全长核心蛋白的DNA片段和pcDNA3.1质粒(购自Invitrogen)重组,转化到E.coli受体菌DH5a (购自天根生化科技有限公司)中，经筛选和鉴定，得到了全长核心蛋白的真核表达质粒pHBcl85。扩增引物如下:SP/HBc I Pstl (SEQ ID NO:6)5’ -TTTTCTGCAGATGGACATTGACCCGTATAAAGAATTTGGAGC-3’，ASP/HBc 185 Pst I(SEQ ID NO:7)5’ -TTTTCTGCAGCTAACATTGAGATTCCCGAGATTTAGATCTTCTGCGACG-3’。PCR反应程序如图9所示。转化条件如下:4 °C, 30min42°C, 90s4 °C, 5min质粒PHBcl85可在真核细胞中表达全长的HBV核心蛋白，其C末端包括四个精氨酸富集区，其中三个为SPRRR重复序列，序列为HBc-l(SEQ ID NO: I):STLPETTVVRRRDRGRSPRRRTPSPRRRRSQSPRRRRSQSRESQC。实施例2:构建针对靶序列HBc-2的C末端截短HBV核心蛋白真核表达质粒pHBcl71以实施例1制备的pHBcl85为模板，通过PCR产生载体片段pHBCTD，扩增引物如下:SP/pHBcl85/1502-1401(SEQ ID NO:8)5， -TCGGGAATCTCAATGTTAGCTGC-3，，ASP/pHBcl85/1502-1401(SEQ ID NO:9)5’ -TAGTTTCCGGAAGTGTTGATAAGATAGGGGCATTTG-3’，合成编码HBV核心蛋白C末端141-171位氨基酸的DNA插入片段，序列如下(SEQID NO:10):5， -ACACTTCCGGAAACTACTGTTGTTAGACGACGGGACCGAGGCAGGCAATCTCGGGAATCTCAATGTCCCCTAGAAGAAGAACTCCCTCGCCTCGCAGACGAAGGTCTCAA-3，。利用同源重组技术将合成片段插入上述通过PCR产生的载体片段pHBCTD中，转化到E.coli受体菌(同实施例1)中，经筛选和鉴定，得到了 C末端截短核心蛋白真核表达质粒 pHBcl71。PCR反应程序如图10所示。同源重组反应条件如下:37°C，15min50 °C，15min转化条件同实施例1。质粒pHBcl71可在真核细胞中表达C末端部分缺失的核心蛋白，其C末端包括两个精氨酸富集区，缺失两个SPRRR重复序列，序列为HBc-2 (SEQ ID NO:2):STLPETTVVRRRDRGRSPRRRTPSPRRRRSQ。实施例3:构建针对靶序列HBc-3的C末端截短HBV核心蛋白真核表达质粒pHBcl63合成编码HBV核心蛋白C末端141-163位氨基酸的DNA插入片段，序列如下(SEQID NO:11):5， -ACACTTCCGGAAACTACTGTTGTTAGACGACGGGACCGAGGCAGGCAATCTCGGGAATCTCAATGTCCCCTAGAAGAAGAACTCCC-3，利用同源重组技术将合成片段插入上述通过PCR产生的载体片段pHBCTD中，转化到E.coli受体菌(同实施例1)中，经筛选和鉴定，得到了 C末端截短核心蛋白真核表达质IipHBc 163 οPCR反应程序同实施例2。同源重组反应条件同实施例2。转化条件同实施例1。质粒pHBcl63可在真核细胞中表达C末端部分缺失的核心蛋白，其C末端包括两个精氨酸富集区，缺失两个SPRRR重复序列，序列为HBc-3 (SEQ ID NO:3):STLPETTVVRRRDRGRSPRRRTP。实施例4:构建针对靶序列HBc-4的C末端截短HBV核心蛋白真核表达质粒pHBcl56合成编码HBV核心蛋白C末端141-156位氨基酸的DNA插入片段，序列如下(SEQID NO:12):5，-ACACTTCCGGAAACTACTGTTGTTAGACGACGGGACCGAGGCAGGCAATCTCGGGAATCTCAATG-3’利用同源重组技术将合成片段插入实施例2中通过PCR产生的载体片段pHBCTD中，转化到E.coli受体菌(同实施例1)中，经筛选和鉴定，得到了 C末端截短核心蛋白真核表达质粒pHBcl56。PCR反应程序同实施例2。同源重组反应条件同实施例2。转化条件同实施例1。质粒pHBcl56可在真核细胞中表达C末端部分缺失的核心蛋白，其C末端只有一个精氨酸富集区，缺失三个SPRRR重复序列，序列为HBc-4 (SEQ ID NO:4):
STLPETTVVRRRDRGRo实施例5:C末端缺失HBV核心蛋白真核表达质粒pHBcl56M的构建合成编码HBV核心蛋白C末端141-156位氨基酸的DNA插入片段，并将150、151、152、154和156位精氨酸由丙氨酸替代，序列如下(SEQ ID NO:13): 5，-ACACTTCCGGAAACTACTGTTGTTGCAGCAGCAGACGCAGGCGCACAATCTCGGGAATCTCAATG-3，。利用同源重组技术将合成片段插入载体pHBCTD中，转化到E.coli受体菌(同实施例I)中，经筛选和鉴定，得到了 C末端截短HBV核心蛋白真核表达质粒pHBcl56M。PCR反应程序同实施例2。同源重组反应条件同实施例2。转化条件同实施例1。质粒pHBcl56M可在真核细胞中表达C末端突变的核心蛋白，其C末端没有精氨酸富集区，序列为:STLPETTVVAAADAGA(SEQ ID NO:5)。实施例6 =HBV核心蛋白真核表达质粒瞬时转染Huh 7细胞Huh 7细胞(人肝癌细胞系，中科院武汉病毒所馈赠，本室保存)培养于含10%FBS的DMEM培养液中，5 % CO2 37°C恒温培养。在进行质粒转染实验时，Huh 7细胞以5X IO5个细胞/ 孔的密度接种于6孔板中贴壁过夜。次日，根据Lipofectamine 2000Transfection Reagent (Invitrogen)转染试剂说明书采用上述实施例1、2、3、4和5制备的相应的真核表达质粒进行质粒转染实验。转染六小时后，更换含相应浓度的待测化合物(本发明选用根据现有技术由本所合成的抗乙肝病毒药物异噻氟定(NZ-4)作为待测化合物(其终浓度为20微摩尔、10微摩尔或5微摩尔)的DMEM培养液进行培养。培养48小时后，细胞用于相应检测。实施例7:非变性琼脂糖凝胶电泳筛选抗HBV的活性化合物分别将H印G2.2.15细胞(中科院武汉病毒所馈赠，本室保存)或实施例6中制备的质粒瞬时转染的Huh 7细胞与不同浓度的待测化合物(即终浓度为20微摩尔、10微摩尔或5微摩尔的异噻氟定)共同培养后，收集细胞，细胞裂解液经离心去除细胞核和细胞碎片后，上样于1.8%琼脂糖凝胶孔中，4°C电泳2.5小时。电泳结束后，虹吸法转膜过夜。样品可转移至硝酸纤维素膜上，采用与Western blot相似的方法,用抗HBc抗体(Abcam)检测核心颗粒。也可在电泳结束后用变性液(1.5M NaCl/0.5M NaOH)进行凝胶原位变性45min，中和液(1.5M NaCl/0.5M Tris.Cl，pH 7.0)中和 45min，再转移至 Hybond-N+尼龙膜上，后续方法与DNA印迹法(Southern blot)和RNA印迹法(Northern blot)相似，用HBV特异性探针(达安基因公司)检测核壳体内的核酸水平。其中，HepG2.2.15细胞是由人肝癌细胞系H印G2细胞衍生的，能够稳定转染HBV基因、稳定进行HBV基因组复制、稳定表达HBV，可对通过本方法筛选出的化合物的抗HBV活性加以验证，同时还可用来检测化合物对HBVDNA的影响。上述实施例1中构建的质粒pHBcl85转染Huh7细胞进行化合物筛选而得到的核心颗粒凝胶图电泳如图1所示，该实验结果表明通过筛选得到的化合物NZ-4可结合于核心蛋白C末端精氨酸富集区，诱导异常核心颗粒形成，这一作用不依赖于pgRNA的参与。
上述实施例2中构建的质粒pHBcl71转染Huh7细胞进行化合物筛选而得到的核心颗粒凝胶电泳图如图2所示，该实验结果表明NZ-4可诱导C末端截短的核心蛋白形成异常核心颗粒。上述实施例3中构建的质粒pHBcl63转染Huh7细胞进行化合物筛选而得到的核心颗粒凝胶电泳图如图3所示，该验结果表明NZ-4可诱导C末端截短的核心蛋白形成异常核心颗粒。上述实施例4和5中构建的质粒pHBcl56和pHBcl56M转染Huh7细胞进行化合物筛选而得到的核心颗粒凝胶电泳图如图4所示，该实验结果表明NZ-4对C末端精氨酸突变为丙氨酸的核心蛋白无效，说明该区域带正电荷的精氨酸为药物筛选的关键靶点。如图5显示，HepG2.2.15细胞上NZ-4诱导产生的异常核心颗粒为空载核心颗粒，不含病毒核酸，核壳体内DNA水平显著降低。其中，GAPDH为甘油醛-3-磷酸脱氢酶，其基因为看家基因，几乎在所有细胞中都高水平表达。在同种细胞中GAPDH蛋白表达量一般是恒定的，因此在该实施例中被作为实验操作的标准化的内参。实施例8:DNA印迹法(Southern blotting)确定化合物抗HBV活性H印G2.2.15细胞裂解液经离心除去细胞核和细胞碎片，核酸酶剪切后加入蛋白酶K消化，经酚氯仿抽提，异丙醇沉淀得到病毒DNA。将DNA上样于0.8 %琼脂糖凝胶孔中，70V电泳I小时。电泳结束后用变性液(1.5MNaCl/0.5M NaOH)进行凝胶原位变性45min，中和液(1.5M NaCl/0.5MTris.Cl，pH 7.0)中和 45min，转移至 Hybond-N+ 尼龙膜上，紫外交联(子外交联仪，宁波新芝生物科技股份有限公司)后用地高辛标记的HBV特异性抗体(Roche)杂交。图6示出了得到的HBV DNA凝胶电泳图，该实验结果表明在H印G2.2.15细胞上NZ-4抑制病毒的三种复制中间体，降低细胞内HBV-DNA水平。实施例9:实时荧光定量PCR(Real-time RCR)检测细胞培养上清中病毒粒子数量
HepG2.2.15与不同浓度的待测化合物共同培养8天后，收集细胞培养上清按照Dneasy Tissue Kit试剂盒说明书进行(Qiagen)提取病毒DNA，进行荧光定量PCR检测。PCR反应程序如图11所不。图7示出了得到的实时荧光定量PCR结果图，实验结果表明NZ-4降低H印G2.2.15细胞培养上清中病毒粒子的水平。实施例10 =HBV转基因小鼠模型(Balb/c背景)6周龄的HBV转基因小鼠(购自广州解放军第458医院，肝病研究所)分为四组:模型组(制剂辅料对照治疗组)；100mg/kg，50mg/kg和25mg/kg异噻氟定(NZ-4)治疗组，口服(灌胃)给药。每组6-7只小鼠，连续给药治疗28天，分别在给药前(0d)、给药后第7天(7d)、第14天(14d)、第21天(21d)和第28天(28d)进行眼底静脉丛取血，收集小鼠血清，提取其中的HBV DNA进行荧光定量PCR检测(同实施例9)。图8示出了得到的实时荧光定量PCR结果图，表明NZ-4可显著降低HBV转基因小鼠血清中的HBV DNA水平实骀结果:一方面，本发明用质粒pHBcl85瞬时转染Huh7细胞的方法表达全长核心蛋白，以非变性琼脂糖凝胶电泳来筛选可诱导异常空载核心颗粒包装的化合物，确定HBV核心蛋白C末端45个氨基酸(aal41_aal85，adw亚型)为抗病毒药物筛选的靶序列，其序列为SEQID NO:1:Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr Val Val Arg Arg Arg Asp Arg Gly151015Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser202530Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Arg Glu Ser Gln Cys354045。 另一方面，本发明用质粒pHBcl71瞬时转染Huh7细胞的方法表达C末端截短核心蛋白，以非变性琼脂糖凝胶电泳来筛选可诱导异常核心颗粒包装的化合物，确定核心蛋白C末端截短序列(aal41-aal71)为抗病毒药物筛选的靶序列，其序列为SEQ ID NO:2:Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr Val Val Arg Arg Arg Asp Arg Gly151015Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser202530Gln。又一方面，本发明用质粒pHBcl63瞬时转染Huh7细胞的方法表达C末端截短核心蛋白，以非变性琼脂糖凝胶电泳来筛选可诱导异常核心颗粒包装的化合物，确定核心蛋白C末端截短序列(aal41-aal63)为抗病毒药物筛选的靶序列，其序列为SEQ ID NO:3:Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr Val Val Arg Arg Arg Asp Arg Gly151015Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr Pro20。再一方面，本发明用质粒pHBcl56瞬时转染Huh7细胞的方法表达C末端截短核心蛋白，以非变性琼脂糖凝胶电泳来筛选可诱导异常核心颗粒包装的化合物，确定核心蛋白C末端截短序列(aal41-aal56)为抗病毒药物筛选的靶序列，其序列为SEQ ID NO:4:Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr Val Val Arg Arg Arg Asp ArgI510。另外，本发明核心蛋白C末端一个精氨酸富集区域(aal50_aal56)为抗病毒药物筛选的靶序列，但如果将其中的5个精氨酸突变为丙氨酸后得到的C末端突变核心蛋白不再具有筛选抗HBV化合物的活性(如实施例7中对质粒pHBcl56和pHBcl56M的描述)，所述的精氨酸富集区域的序列为Arg Arg Arg Asp Arg Gly ArgI5。表I为根据上述实施例确定的HBV (adw亚型)的核心蛋白C末端靶序列，从上至下依次对应于实施例1、2、3和4。表I
权利要求
1.一种抗HBV的化合物的筛选方法，其中，该方法以HBV核心蛋白C末端氨基酸序列为药物作用靶点来筛选抗HBV的化合物，所述HBV核心蛋白C末端氨基酸序列至少包含STLPETTVVRRRDRGRo
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述HBV核心蛋白C末端氨基酸序列为:STLPETTVVRRRDRGRSPRRRTPSPRRRRSQSPRRRRSQSRESQC、STLPETTVVRRRDRGRSPRRRTPSPRRRRSQ、STLPETTVVRRRDRGRSPRRRTP 或STLPETTVVRRRDRGRo
3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述方法包括以下步骤: (a)通过PCR的方法构建含有所述HBV核心蛋白C末端氨基酸序列的真核表达质粒； (b)用步骤(a)中 所得质粒瞬时转染肝癌细胞4 6小时后给予筛选化合物处理48 96小时； (c)药物处理后收集细胞，以非变性琼脂糖凝胶电泳来筛选可诱导异常空载HBV核心颗粒包装的化合物。
4.根据权利要求3所述的方法，其中，所述肝癌细胞包括Huh7细胞或H印G2细胞。
5.根据权利要求4所述的方法，其中，所述肝癌细胞为Huh7细胞。
6.根据权利要求3所述的方法，其中，所述步骤(b)中筛选化合物处理为:将转染的肝癌细胞与筛选化合物共同培养。
7.根据权利要求3所述的方法，其中，所述步骤(c)具体为:经筛选化合物处理后收集细胞，取细胞裂解液上样于1.8%琼脂糖凝胶孔中，4°C电泳2 3小时；电泳结束后，虹吸法转膜过夜；将所得样品转移至硝酸纤维素膜上，用抗HBc抗体检测由筛选化合物诱导产生的异常核心颗粒。
全文摘要
本发明涉及一种抗HBV的化合物的筛选方法，其中，该方法以HBV核心蛋白C末端氨基酸序列为药物作用靶点来筛选抗HBV的化合物，所述HBV核心蛋白C末端氨基酸序列至少包含STLPETTVVRRRDRGR。本发明提供的筛选化合物的方法可用于筛选和发现诱导HBV核心颗粒的异常包装的抗HBV复制活性化合物，而且，还可以用于检测以其它方式获得的针对这些靶位点的用于治疗乙型病毒性肝炎的新型抗病毒药物的活性。
文档编号C12Q1/02GK103243172SQ20121002471
公开日2013年8月14日 申请日期2012年2月3日 优先权日2012年2月3日
发明者左建平, 南发俊, 杨莉, 童贤昆, 张仰明, 王桂凤, 唐炜 申请人:中国科学院上海药物研究所