专利名称：α1,2-岩藻糖转移酶基因沉默的体细胞克隆猪及其生产方法与应用的制作方法
a 1,2-岩藻糖转移酶基因沉默的体细胞克隆猪及其生产方法与应用本发明涉及一种a 1，2-岩藻糖转移酶基因沉默的体细胞克隆猪及其生产方法与应用，属于转基因生物育种领域。在养猪业中，断奶前后断奶仔猪腹湾(post-weaning diarrehea, PffD)与水肿病(edema disease, ED)是一种重要的传染病。此病从仔猪出生到断奶这一阶段的死亡率高达11. 5% 29. 5%，给养猪业造成了极大地经济损失。当前一些对仔猪腹泻与水肿病的预防性措施，如提高管理水平、改善卫生环境、注射药物以及亚单位疫苗接种，·尽管在一定程度上减少了病况的发生与流行，但并没有从根本上去寻求解决，找到一种全新的仔猪腹泻与水肿病的预防与控制策略迫在眉睫。从长远来看，采用遗传学方法从遗传本质上提高猪对病原的抗性，开展抗病育种具有治本的功效。产肠毒素大肠杆菌(EnterotoxigenicE. coli, ETEC)是引起仔猪断奶后水肿与腹泻病、生长发育不良甚至死亡的主要病原菌，其致病因子主要是肠毒素和黏附素。黏附素(adhesion)又称菌毛(fimbriae)或定居因子(colonization factor),是ETEC菌体表面的一种纤毛样突出物,能与宿主小肠上皮细胞刷状缘相应受体结合，细菌在仔猪小肠黏膜上黏附、定居、繁殖，并产生肠毒素，通过渗透，弓丨发组织胺的释放，导致血管壁损伤，水分大量渗出而引起水肿与腹泻病。因此，PWD和ED产生的前提条件是该细菌能否定植在宿主肠道粘膜表面，仔猪对该病原的易感性则在很大程度上取决于其小肠粘膜上皮细胞上是否存在F18菌毛的受体以及具有显性遗传特性。研究表明，a I, 2-岩藻糖转移酶(a I, 2-fucosyltransferas,FUTl)基因是ECF18受体蛋白基因的最佳候选基因。RNA干扰(RNA interference, RNAi)是指一种分子生物学上由双链RNA诱发的基因沉默现象，其机制是通过阻碍特定基因的翻译或转录来抑制基因表达，以其周期短、效率高和低成本的优点，是研究基因功能、防治病毒、治疗疾病和改良品种制备转基因动物的理想途径之一。当细胞中导入与内源性mRNA编码区同源的双链RNA时，该mRNA会发生降解而导致基因表达沉默。鉴于在基因沉默方面的高效性和简单性，该技术已被广泛作为探索基因功能和基因治疗等领域的工具。慢病毒(Lentivirus)载体是以HIV-I (人类免疫缺陷I型病毒)为基础发展起来的基因治疗载体。区别一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。慢病毒载体的研究发展得很快，研究的也非常深入。目前慢病毒也被广泛地应用于RNAi的研究中，但是在哺乳动物中的研究并不多。现阶段将目的基因导入靶细胞和组织的方法主要包括真核表达质粒的转染和病毒载体介导的基因转移方法等。与真核表达质粒相t匕，利用高效的慢病毒系统，病毒载体介导的基因转移可以整合入宿主的基因组中，具有更好的稳定性。质粒的转染效率明显低于慢病毒载体，因为质粒转染不少属于瞬时表达，目的基因常常随时间的延长而发生丢失，会随着有丝分裂而吸收或者导致核酸酶活性的升高，而且质粒不能转染非分裂细胞。慢病毒载体介导的RNAi具有高效，稳定和特异性很强的特点，它能在哺乳动物的受体细胞实现长时间稳定的效应。为了进一步研究FUTl基因的功能以及探索一条利用RNAi技术培育抗仔猪腹泻与水肿病的猪新品种，我们针对猪FUTl基因的编码区选取了 4个不同位点的片段，在Invitrogen 公司商品化的载体 pcDNA 6. 2-Gff/EmGFP-miR 和 pLenti6. 3/V5-DEST 的基础上，构建了 4个关于FUTl基因的RNAi慢病毒表达载体。将构建好的真核表达载体利用脂质体共转染293T细胞，通过Real-timePCR和Western Blot的方法综合筛选出2条针对FUTl基因有效的RNAi靶位点，选取干扰效应最显著的第3个靶位点来构建慢病毒表达载体并包装成慢病毒。将该RNAi慢病毒颗粒感染梅山猪胎儿成纤维细胞，并添加一定浓度的灭稻瘟素(Blasticidin，BSD)筛选出稳定细胞系。通过体细胞核移植技术生产了基于该转基因细胞系的克隆胚胎，并选择同期发情的皖北黑猪作为待孕受体母猪，将经体外培养得到的早 期胚胎植入母猪体内妊娠后，获得了 a 1，2-岩藻糖转移酶基因沉默的克隆猪。本发明要解决的技术问题是提供一种a 1，2-岩藻糖转移酶基因沉默的体细胞克隆猪。本发明要解决的另外一个技术问题是提供通过转基因生物育种，生产a 1，2_岩藻糖转移酶基因沉默的体细胞克隆猪的方法。对于a 1，2_岩藻糖转移酶基因沉默的体细胞克隆猪，本发明采用的技术方案是，将该猪的基因组整合了一段a 1，2-岩藻糖转移酶基因的RNAi核苷酸序列，使得该基因在表达过程中发生转录后水平的沉默。对于生产a 1，2_岩藻糖转移酶基因沉默的体细胞克隆猪的方法，本发明采用的技术方案是，包括以下步骤(I)借助基因工程方法构建猪a 1，2-岩藻糖转移酶基因的RNAi慢病毒表达载体pLenti6. 3/V5-DEST-EmGFP-FUTI ；(2)通过细胞转染及细胞筛选技术筛选出a 1，2-岩藻糖转移酶基因被高效沉默的猪胎儿成纤维细胞系；(3)利用体细胞核移植技术进行克隆猪的生产。作为优选，上述生产方法步骤(I)的基本过程为以猪a 1，2_岩藻糖转移酶基因的编码区作为靶位点，设计合成相应的互补的两条miRNA寡核苷酸单链，经退火形成双链后，连接到RNAi表达载体pCDNA 6. 2-GW/EmGFP-miR上，并在目的片段上下游分别分别添加酶切位点Asc I和Pme I，然后PCR扩增EmGFP+FUTl片段，约930bp，连接至慢病毒表达载体pLenti6. 3/V5-DEST ,命名为pLenti6. 3/V5-DEST-EmGFP_FUTl。本发明a 1，2-岩藻糖转移酶基因沉默的体细胞克隆猪可用于培育抗仔猪腹泻与水肿病猪新品种。本发明的有益效果是RNAi技术以其在基因沉默方面周期短、效率高和低成本的优点，是探索基因功能和基因治疗等领域的理想途径之一。当细胞中导入与内源性mRNA编码区同源的双链RNA时，该mRNA会发生降解而导致基因表达沉默。试验首次将该技术应用于大动物体水平上探索FUTl基因的功能，以及培育抗仔猪腹泻与水肿病猪新品种的研究。在构建慢病毒载体方面，与传统shRNA载体相比，试验通过miRNA RNAi载体系统运用micro RNA(miRNA)结合更多细胞内源机制元素，在细胞中更高效的表达RNA发夹结构，实现更高效的基因沉默。质粒中含有pol II启动子，这是一种人的巨细胞病毒早期即亥IJ启动子，可高水平构成性表达miRNA，并且能在大多数哺乳动物细胞株中表达。此外，该质粒可同时表达报告基因EmGFP和目的miRNA，所以EmGFP与miRNA的表达具有100%的相关性，这使得miRNA的表达可在任何细胞类型中进行示踪。
以该转基因细胞系作为供体细胞进行核移植，所获得的克隆胚胎经验证可以在体外培养发育至囊胚，并与对照组相比无显著差异。最后，选择重构后经体外培养得到的早期胚胎植入待孕受体母猪妊娠，获得了 8头转基因克隆猪，且转基因的阳性率为100%，为进一步研究FUTl基因的功能以及培育抗仔猪腹泻与水肿病猪新品种奠定了基础。一 . FUTl基因RNAi片段的设计与表达载体构建登陆网址 http://rnaidesigner.invitrogen.com/rnai express/,使用Invitrogen公司的在线设计软件Invitrogen' s RNAi Designer,将猪FUTl基因编码区的核苷酸序列(GeneBank登录号U70883. 2)输入。软件给出10个长度为21nt的片段序列，起始位点不同，以星级数提示对此靶点的作用潜力。使用BLAST排除和其他编码序列/EST同源的序列，使得设计的靶mRNA与猪细胞内已知的任何基因没有同源性，从而尽量排除shRNA非特异性抑制其它基因片段的可能。从中选取4个最佳片段和并一段不针对任何基因的阴性对照片段，并依次命名为FUT1-1、FUT1-2、FUT1-3、FUT1_4以及NC。合成相应的互补的两条miRNA寡核苷酸单链，互补的miRNA寡核苷酸单链经退火形成双链，BsaI酶切Invitrogen公司商品化的pcDNA 6. 2-Gff/EmGFP-miRRNAi表达载体，用T4DNA连接酶连接退火形成的双链与酶切后的质粒载体，转化、摇菌、提取质粒并测序，分别构建成 pcDNA6. 2-EmGFP-FUTl-l, pcDNA6. 2-EmGFP-FUTl_2，pcDNA6. 2-EmGFP-FUTl_3，pcDNA6. 2-EmGFP-FUTl-4 和 pcDNA6. 2-EmGFP-NC 载体。二 FUTl基因过表达载体的构建根据猪FUTl基因序列的编码区设计引物，上游引物FUTl-Fl 5/ GTCAgaattcGCCACCATGTGGGTCCCCAGCCG 3'，带有EcoRI 酶切位点，下游引物 FUTl-Rl :5' GAATgtcgacGAAGGCCCAGCCAACATCTG 3丨，带有SalI酶切位点。以Trizol法提取新鲜的猪肺脏组织总RNA，并以此为模板进行 RT_PCR，PCR 反应条件94°0预变性31^11，941 30s, 60°C 30s, 68°C lmin，共30个循环，最后68°C延伸lOmin。将PCR扩增的FUTl基因片段与真核表达载体pEGFP-Nl分别用EcoRI和SalI进行双酶切，纯化后，T4DNA连接酶进行连接，转化至大肠杆菌DH5 a，菌液PCR鉴定阳性克隆，抽提质粒进行酶切鉴定，将菌液PCR和酶切鉴定均呈阳性的样品送至生物公司进行测序，保留测序正确的克隆。三.RNAi有效靶点的筛选转染前一天，利用胰蛋白酶消化293T细胞，接入24孔板，分别使细胞置于500 yl的DMEM+10% FBS培养基，5% C02、95%湿润空气、37°C培养。转染前细胞调整至80%的培养密度，转染当天，从293T细胞中移除培养基，分别换上新鲜的400 ill DMEM+10%FBS培养基(不含抗生素)，37°C孵育。I) RNAi有效靶点mRNA水平的筛选a)0. Iu g过表达载体与0. 7 ii g的4个干扰载体及阴性对照pcDNA6. 2-NC与50 ylopti MEM 混匀后，室温放置 5min ;b)10iil Lipofec tamin 2000 加入到 250 不含抗生素和血清的opti MEM培养基，混匀后，室温放置5min ；c) 二者混合后室温放置20min ；37. 5°C, 5% C02培养箱培养4-6h，更换培养基为含10% FBS的DMEM培养基。转染48h后，荧光显微镜观察细胞的转染效率。Trizol法裂解细胞，提取RNA，反转录成cDNA，使用SYBRGreen荧光定量PCR法检测各个干扰载体的干扰效率。PCR条件为95°C 2min，95°C 20s,58°C 15s,72°C 20s，共30个循环。PCR结束后，进行熔解曲线实验，升温温度从60°C到95°C。用2_a ACt法进行基因表达的相对定量，外源验证各靶位点在mRNA水平的干扰效率。2) RNAi有效靶点蛋白水平的验证 将已成功构建好的RNAi载体和阴性对照载体pcDNA6. 2-EmGFP-NC用DraI单酶切，切除原有载体中的EmGFP，电泳回收大片段，并将该片段进行自连，转化至大肠杆菌DH5 a，进行菌液PCR鉴定，抽提质粒进行测序鉴定，构建成了不含有EmGFP基因的四个RNAi载体和pcDNA6. 2-NC载体。转染前一天，利用胰蛋白酶消化293T细胞，接入6孔板，分别使细胞置于2ml DMEM+10% FBS培养基，5% C02、95%湿润空气、37°C培养。转染前保证细胞培养密度达到80%，转染当天，从293T细胞中移除培养基，分别换上新鲜的I. 5ml DMEM，37°C孵育。a) 0. 5 y g过表达质粒与3. 5 y g的4个干扰载体及阴性对照 pcDNA6. 2-NC % 250 u I DMEM 混匀后，室温放置 5min ；b) 20 u I Lipof ectamin 2000加入到480 u I不含抗生素和血清的DMEM培养基，混匀后，室温放置5min ；c) 二者混合后室温放置20min ；37. 5°C,5% C02培养箱培养4_6h，更换培养基为含10% FBS的DMEM培养基。转染72h后，荧光显微镜观察细胞的转染效率。裂解细胞中的总蛋白，对其进行Westernblot，外源验证各靶位点在蛋白水平的干扰效率。四.RNAi有效靶点慢病毒表达载体的构建设计引物，在目的片段上下游分别分别添加酶切位点Ascl和Pmel，以干扰效应最显著的3号靶位点片段的pcDNA6. 2-EmGFP-FUTl-3载体为模板，PCR扩增EmGFP+FUTl_3片段，约 930bp。PCR 反应条件95°C 预变性 3min，94°C 30s, 56°C 30s, 68°C lmin，共 30 个循环，最后68°C延伸lOmin。回收PCR产物,连接至酶切后的Invitrogen公司商品化的慢病毒表达载体pLenti6. 3/V5-DEST ，转化、摇菌、提取质粒并测序验证，构建成pLenti6. 3/V5-DEST-EmGFP-FUTl-3 载体。五 RNAi载体的慢病毒包装复苏早代次的293T细胞(代数低于20代)于IOcm皿中，转染前调整细胞融合度至80%,按I : 5的比例传至15个poly-(D-lysine) (PDL)包被的IOcm皿中,10ml (DMEM+10% FBS+1 % P/S)培养液，37°C、5% CO2细胞培养箱中继续培养约24h。转染前的2-3h，将培养基换成5ml不含抗生素的DMEM+10% FBS0转染时，无菌离心管内加入250 u I无血清与抗生素的opti MEM培养基，然后向其中加入所制备的各DNA溶液，即慢病毒表达质粒6 ii g、包装质粒Lentiviral Packaging Mix 6iig,混合均勻。在另一无菌离心管中加入250 ill无血清的DMEM培养基，向其中加入Lipofectamine 2000转染试剂24 yl，轻轻混匀，室温下温育5分钟。把稀释后的DNA与稀释后的Lipofectamine 2000进行混合，轻轻地颠倒混匀，不要振荡。混匀后，在室温下温育20分钟，37. 5°C, 5% C02培养箱培养4-6h，更换培养基为含10% FBS的DMEM培养基。转染48h后，收集293T细胞上清液(第一次收液)。细胞更换新鲜的完全培养基，继续培养至72-80h，收集病毒上清，与第一次收集的混合，4°C、3000rpm离心lOmin，除去细胞碎片以0. 45 u m醋酸纤维素膜的滤器过滤上清液，得到慢病毒液，Iml/管进行分装，_80°C保存。六.猪胎儿成纤维细胞转基因细胞系的建立将处于对数生长期的目的细胞进行胰蛋白酶消化，制成细胞悬液。将细胞悬液(细胞数约为5X IO4)接种于6-well中，371、5%0)2浓度的培养箱培养细胞至密度达到约80%。根据最佳MOI值测定的结果选择合适的MOI值，加入适宜量的慢 病毒，同时加入浓度终为6 ii g/ml的Polybrene增强感染,24h后换成没有病毒和Polybrene的完全培养基继续培养，感染48-72h后观察细胞中EmGFP的表达情况，并拍照记录感染结果。选择荧光率较高的细胞，加入终浓度为8 u g/ml的Blasticidin进行药物筛选，持续观察细胞的生长情况，筛选前期由于细胞大量死亡会释放有害物质，因此需每1-2天换一次培养基。在加药后的5天左右，细胞数量锐减，此后可2-3天换液一次，持续筛选2周后，把抗生素浓度降到筛选浓度的50%进行维持培养，约2-3周后将稳转的细胞扩增，得到的细胞一部分进行冻存为后续的实验做准备，一部分收样进行检测。七.目的片段整合鉴定与FUTl基因RNAi效率的检测分别对建立的非转基因细胞和慢病毒感染的细胞用DNA提取试剂盒提取基因组DNA，PCR检测目的基因在转基因细胞中的整合情况。PCR反应条件为94°C 3min，94°C 30s,58°C 30s, 72°C 10s，共 35 个循环。Primer Express 3. O软件以跨内含子的方式设计FUTl基因引物、内参基因HPRTl引物。分别对慢病毒感染的3组细胞即RNAi组、阴性对照组以及空白对照组用Trizol裂解提取总RNA，并经RNA-free DNaseI处理，以避免基因组DNA污染，然后反转录为cDNA，RT-PCR验证退火温度，使用SYBR Green荧光定量PCR法检测各个载体的干扰效率。PCR条件为95°C预变性10min，95°C 15s, 60°C lmin，共30个循环。PCR结束后，进行熔解曲线分析，升温温度从60°C到95°C。用I一法进行基因表达的相对定量。九.转基因克隆胚胎的生产与移植体外成熟的猪卵母细胞脱除卵丘后，在体视镜下挑选排出第一极体且卵周隙明显的卵母细胞，同时用显微操作液TCB(HEPES缓冲的含7. g/mlCB，2% FBS的TCM199)洗涤准备的体细胞，将卵母细胞和转基因细胞一起放入显微操作碟的核移植操作液TCB中，并将操作碟置于装有38. 5°C恒温热台的显微操作台。去核采用盲吸法，即用固定针吸持卵母细胞，用注射针拨动使卵母细胞使极体位于5点处，去核针从3点钟位置进针，吸取第一极体及其周围约1/5-1/4可能含有卵母细胞核的胞质，之后用去核针吸取转基因细胞(直径约15-20 u m,折光性强，圆形，光滑的)，从去核切口进入卵母细胞透明带下注入，轻轻点压透明带，使体细胞与胞质膜紧密接触。操作完后将重构卵转移到石蜡油覆盖好的T2液滴中,在38. 50C的恒温箱中中恢复30min。融合和化学辅助激活将T2中已恢复好的重构卵在化学辅助激活液(PZM-3+10 ii g/mL CHX+10 u g/mL CB)激活lOmin，然后分批移入融合/激活液中洗涤3遍，每批10枚放入已经铺满融合液的融合槽内，用拉制的很细的实心玻璃针拨动重构胚胎，使供体细胞-受体卵细胞膜接触面与与电场方向垂直，用CF-150B融合仪(BLS，匈牙利)施加单个156v/mm，100 u s的直流电脉冲诱导融合同时电激活，随后用T2 (HEPES缓冲的含2% FBS的TCM199)培养液洗涤3遍，立即转入盖矿物油的T2中，30min后在体视镜下判定融合。将融合的重构胚用胚胎培养液洗涤3遍后转入预平衡4h以上的胚胎培养滴PZM3内，每个培养滴50 ill培养10-15枚胚胎。在38. 5°C、5% CO2UOO %
条件下培养，胚胎发育至二细胞、四细胞期时，选择同期发情的皖北黑猪作为待孕受体母猪 进行胚胎移植。
权利要求
1.α 1，2-岩藻糖转移酶基因沉默的体细胞克隆猪，其特征在于，该猪的基因组整合了一段α I，2-岩藻糖转移酶基因的RNAi核苷酸序列，使得该基因在表达过程中发生转录后水平的沉默。
2.根据权利要求I所述猪的生产方法，包括以下步骤 (1)借助基因工程方法构建猪α1，2_岩藻糖转移酶基因的RNAi慢病毒表达载体pLenti6. 3/V5-DEST-EmGFP-FUTI ； (2)通过细胞转染及细胞筛选技术筛选出α1，2-岩藻糖转移酶基因被高效沉默的猪胎儿成纤维细胞系； (3)利用体细胞核移植技术进行克隆猪的生产。
3.根据权利要求2所述的生产方法，所述步骤(I)的基本过程为 以猪α 1，2-岩藻糖转移酶基因的编码区作为靶位点，设计合成相应的互补的两条miRNA寡核苷酸单链，经退火形成双链后，连接到RNAi表达载体pcDNA 6. 2-Gff/EmGFP-miR上，并在目的片段上下游分别分别添加酶切位点Ascl和Pmel，然后PCR扩增EmGFP+FUTl片段，约930bp，连接至慢病毒表达载体pLenti6. 3/V5-DEST ,命名为pLenti6. 3/V5-DEST-EmGFP-FUTl0
4.α 1，2-岩藻糖转移酶基因沉默的体细胞克隆猪在培育抗仔猪腹泻与水肿病猪新品种中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种α1，2-岩藻糖转移酶基因沉默的体细胞克隆猪及其生产方法与应用。本发明针对猪α1，2-岩藻糖转移酶基因构建了RNAi慢病毒表达载体，包装慢病毒颗粒后，感染猪胎儿成纤维细胞，以该转基因细胞系为核供体，生产了基因组整合有一段α1，2-岩藻糖转移酶基因的RNAi核苷酸序列的克隆猪，为进一步研究该基因的功能以及培育抗仔猪腹泻与水肿病猪新品种奠定了基础。
文档编号C12N15/867GK102703506SQ20121003296
公开日2012年10月3日 申请日期2012年2月10日 优先权日2012年2月10日
发明者吴蓉花, 周娜汝, 张宇, 张运海, 张远亮, 李运生, 章孝荣, 章美玲, 陈建文, 陶佳, 随刘才, 韩春杨 申请人:安徽农业大学