专利名称：一种凝乳酶基因及其编码的氨基酸序列与应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，特别涉及一种由枯草芽孢杆菌诱变株分泌的凝乳酶的基因序列及其蛋白序列与应用。
背景技术：
在食品加工领域，尤其是奶酪加工领域，凝固酶是必不可少的添加剂。凝乳酶不仅可以使牛奶凝固，而且在奶酪成熟中具有不可忽视的作用(Kumar et al.，2005)。小牛皱胃凝乳酶首次被发现是一个偶然的机会，人们用动物的皮保存牛奶时，牛奶有时会出现凝固，之后小牛皱胃凝乳酶就被广泛应用在奶酪加工领域。自从1961起，由于世界乳酪业的高速发展，使得小牛凝乳酶供应持续短缺，科学家不断寻找能够替代小牛皱胃凝乳酶的蛋白酶。之后，人们发现了一些蛋白酶具有类似的凝乳效果。这些凝乳酶广泛分布在不同的生物和组织内(Chitpinityol and Crabbe, 1998)。因此，由于各类蛋白酶具有不同的理化性质、水解活性和凝乳活性，所以其用途就各不相同。人们通过向不同来源的奶液(奶牛，牦牛，山羊以及骆驼)中添加凝乳酶，并采用不同的加工手段，最终获得口味各异的奶酪。青藏高原(Qingha1-Tibet Plateau)是世界海拔最高的高原,气候环境恶劣，因此其拥有许多独特的生物质资源。牦牛，就是其中最典型的一种(Zi，2003)。牦牛常年以丰富的、无污染的草料为食，因此可以为当地居民提供大量的洁净的食物(牦牛乳，肉，酥油)。藏民们通常会将牦牛乳加工成各种乳制品，牦牛奶酪就是其中最主要且最常见的一种。牦牛乳在总蛋白含量，脂肪含量，酪蛋白组成方面与牛奶具有明显的差异(Brunner，1981 ；Liet al.，2010)，尤其特别的是牦牛乳中含有大量的β-casein，使传统凝乳酶的凝乳速度大大降低；其次，在牦牛乳奶液的PH通常在6.0-8.0之间，而传统的动物源和真菌源的凝乳酶在pH < 5.0情况下具有最大活性，那么在中性环境下具有高凝乳活性的凝乳酶非常适合牦牛乳奶酪的生产；第三 ，高温处理是牦牛乳制作奶酪之前的必要步骤，如果高温处理后立即添加凝乳酶，那么就缩短了前处理时间，在奶酪制备过程中，高温环境不仅可以提高酶的反应效率，而且会减少酶的用量，节约成本。然而，传统的凝乳酶通常只能在50°C以下的环境中保持活性的稳定(Ageitos et al., 2007 ；Kumar et al., 2005 ；Nouani et al., 2009),而在高温环境下会迅速失活，无法满足牦牛奶酪加工的需要。综上所述，传统的凝乳酶不再适用于牦牛乳奶酪的生产过程。因此，亟须开发出一种具有热稳定性的、高效凝结牦牛乳的凝乳酶。迄今为止，没有文献或专利报道过具备牦牛乳特异性、热稳定性、并在PH6.0-8.0保持高活性的微生物源凝乳酶，更没有明确这类蛋白质或其编码蛋白质的基因序列。
Ageitos, J.M.，Vallejo, J.A.，Sestelo, A.B.，Poza, Μ.，and Villa, T.G.(2007).Purification and characterization of a milk-clotting protease from Bacilluslicheniformis strain USC13.J Appl Microbiol 103,2205-2213.Brunner, J.(1981).Cow milk proteins:twenty-five years of progress.J DairySci 64,1038.Chitpinityol,S.,and Crabbe,M.(1998).Chymosin and aspartic proteinases.FoodChem 61,395-418.Kumar, S., Sharma, N., Saharan, M., and Singh, R.(2005).Extracellular acidprotease from Rhizopus oryzae -purification and characterization.ProcessBiochem40,1701-1705.Li, H.M.,Ma, Y., Dong, A., Wang, J., Li, Q., He, S., and Maubois, J.-L.(2010).Proteincomposition of yak milk.Dairy Sci Technol 90,111-117.Nouani, A., Belhamiche, N., Slamani, R., Belbraouet, S., Fazouane, F., andBelial, M.(2009).Extracellular protease from Mucor pusillus:purification andcharacterization.1nt J Dairy Technol 62,112-117.Zi, X.(2003).Reproduction in female yaks (Bos grunniens)and opportunitiesfor improvement.Theriogenology 59,1303-1312.
发明内容
本发明的目的是提供一种凝乳酶基因。本发明的另一个目的是提供一种本发明的基因编码的蛋白质。本发明的所述的凝乳酶，是指来自可高产凝乳酶的枯草芽抱杆菌(Bacillussubtilis)YB-3菌株的培养液、培养液的上清液或菌体的蛋白质。该菌种已经于2009年4月17日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址:中国.武汉.武汉大学，邮编430072，电话
(027)68754052，传真(027)68754833，E-mail:cctcciwhu.edu.cn，其保藏号为 CCTCC NO:M209075。
本发明的再一个目的是提供一种本发明的蛋白质的应用。为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案:本发明对菌株Bacillus subtilis YB-3产生的凝乳酶进行了纯化:
(I)乙醇分级沉淀法初步纯化凝乳酶。将粗酶液置于冰浴中，经过30-60%乙醇分级沉淀后，12，OOOg 30min离心获得的蛋白沉淀复溶于的50mM的pH 6.0的磷酸缓冲液中。经检测，沉淀中的凝乳酶活力回收达到71.4%。(2)分子筛层析法进一步纯化凝乳酶。通过SDS-PAGE电泳分析，表明:经过两步纯化，该凝乳酶已经达到电泳纯，其亚基分子量约为42+ IkDa ;最终，凝乳酶纯化倍数(表I)为9.5，回收率为19.1%，比活达到8889SU/mg。该凝乳酶，基于十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳的分子量为42±lkDa。菌株Bacillus subtilis YB_3产生的凝乳酶具备牦牛乳特异性,可以用于生产牦牛乳乳酪和牛乳乳酪中的应用。这里所说的牦牛乳特异性是指，当以不同哺乳动物奶液为底物时，菌株BacillussubtilisYB-3产生的凝乳酶对牦牛乳的凝乳活性最高，使牦牛乳最快凝固。菌株Bacillus subtilis YB-3产生的凝乳酶在ρΗ5.0-8.0时，具有较高的凝乳活性，其最适反应pH是6.0。该酶在pH5.0-8.0放置一小时保持较高的稳定性，在此范围外，其凝乳活性大幅度下降。该酶在40°C _80°C内都具有较高的凝乳活性，在70°C活性最强，在0-50°C放置一小时后，仍然能保留初始活力的100%，较稳定。当温度大于等于60°C时，该酶活力随着放置时间的变化迅速失活。
Ca2+、Al3+、K+离子对该凝乳酶有激活作用，而Fe2+、Cu2+、Zn2+对该凝乳酶有抑制作用。丝氨酸蛋白酶抑制剂PMSF、巯基蛋白酶抑制剂β-Mercaptoethanol、天冬氨酸蛋白酶抑制剂抑肽剂(P印statin)对该酶活力几乎无抑制作用，而EDTA对该酶凝乳活性有显著抑制作用。本发明分离克隆了菌株Bacillus subtilis YB_3产生的凝乳酶,所述凝乳酶具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。该凝乳酶的编码基因具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。
LC/MS/MS (HPLC-mass spectrometryanalysis)分析结果显不，该凝乳酶属于金属蛋白酶家族。在NCBI上进行比对，发现该凝乳酶编码基因与Bacillus subtilismetalloprotease gene (Bacillus subtilis 金属蛋白酶基因)同源性为 98.97%,有 16 个碱基不同。CDS区域编码基因对应的氨基酸比对结果发现相似度为99.03%，有五个氨基酸不同。本发明的优点为，1、该种凝乳酶，具有牦牛乳特异性，可以加速牦牛乳凝固，在牦牛乳酪生产领域具有广阔的应用前景。2、该种凝乳酶具备热稳定性，并在中性环境下保持高凝乳活性，所以与小牛皱胃凝乳酶相比，更适用于牦牛乳奶酪的制备。3、该酶也可以同时应用于普通牛奶的凝乳。
图1是凝乳酶的SDS-PAGE电泳分析，其中1_标准分子量蛋白，2_粗酶液，3_乙醇分级沉淀后凝乳酶液，4-分子筛层析后凝乳酶液；图2表示纯化凝乳酶的最适反应温度、pH和温度、pH稳定性,其中图2a表示凝乳酶的最适反应温度，图2b表示凝乳酶的温度稳定性；图2c表示凝乳酶的最适反应pH，图2d表示凝乳酶的pH稳定性。图 3表不Bacillus subtilis YB-3产生的凝乳酶(MCE from Bacillus subtilis)对于牛奶(cow milk)和牦牛奶(yak milk)的凝乳活性。其中以小牛皱胃凝乳酶Maxiren1800和真菌源凝乳酶MCE from Rhizomucor pusillus作为对照凝乳酶。图4表示纯化Bacillus subtilis YB-3产生的凝乳酶制备牛乳乳酪和牦牛乳乳
酪图5表示Bacillus subtilis YB-3产生的凝乳酶的指纹图谱与Bacilluspumilus金属蛋白酶(gi56405351)匹配结果。下划线为一致性序列。
具体实施例方式实施例一Bacillus subtilis YB-3的培养及发酵液的制备。Bacillus subtilis YB-3的摇瓶发酵在IOOml三角瓶中进行，其中包含30ml的发酵培养基。发酵培养基由10g/L酪蛋白，3g/L牛肉膏，5g/LNaCl，5g/LNa2HP04*12H20组成，初始pH 7.0。上述培 养基接种Iml的对数期的菌液，37°C，150转/分钟振荡培养。发酵结束后，发酵液离心5分钟除去菌体，离心力3020g，上清液即为粗酶液。
实施例二凝乳酶蛋白水解活性测定和凝乳活性的测定。凝乳酶测定方法参照IDF的方法157A: 1997。蛋白水解活性测定方法参照改良的Lorry法。实施例三菌株Bacillus subtilis YB-3所产凝乳酶的纯化程序。首先，粗酶液经过30-60%乙醇分级沉淀后，12，OOOg 30min离心获得的蛋白沉淀复溶于的50mM的pH 6.0的磷酸缓冲液中。上述复溶的酶液通过Waters protein pak i_125分子筛层析柱(7.5x300mm)进一步分离纯化，上述层析柱预先用50mM pH6.0磷酸缓冲液(含有0.15M Na2SO4)平衡。分离过程中，样品检测波长为OD28tl,流动相采用相同的缓冲液，流速1.0ml/min，每1.0ml洗脱液作为一个组分，分部收集。收集活性组分并通过Amicon Ultra (Milipore)超滤浓缩及脱盐。最终获得的酶浓缩液进行SDS-PAGE电泳分析(图1)。:经过两步纯化，该凝乳酶已经达到电泳纯，其亚基分子量约为42± IkDa ;最终，凝乳酶纯化倍数(表I)为9.5，回收率为19.1%，比活达到8889SU/mg。该凝乳酶，基于十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳的分子量为42±lkDa。表IBacillus subtilis YB-3所产凝乳酶的纯化步骤及结果:凝乳酶活性
权利要求
1.一种凝乳酶，其特征在于:其氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示。
2.根据权利要求1所述的凝乳酶，其特征在于:该凝乳酶最适凝乳pH是6.0 ;该酶在PH5.0-8.0放置一小时保持稳定。
3.根据权利要求1所述的凝乳酶，其特征在于:该凝乳酶最适凝乳温度70°C;在0-50°C放置一小时后，仍然能保留初始活力的100%。
4.根据权利要求1所述的凝乳酶，其特征在于:Ca2+、Al3+、K+离子对该凝乳酶有激活作用，而Fe2+、Cu2+、Zn2+对该凝乳酶有抑制作用。
5.根据权利要求1所述的凝乳酶，其特征在于:纯化后的酶的分子量按SDS-PAGE所确定为 42 土 lkDa。
6.根据权利要求1所述的凝乳酶，其特征在于:该凝乳酶对于牦牛乳具有底物特异性。
7.根据权利要求1所述凝乳酶用于生产奶酪、干酪素以及酸奶等乳制品中的应用。
8.根据权利要求1所述凝乳酶用于生产奶酪、干酪素以及酸奶等乳制品中的应用，其特征在于:所述乳制品的原料为牛奶或牦牛奶。
9.一种编码 如权利要求1所述凝乳酶的基因，其特征在于:其核苷酸序列如SEQ IDNO:1所示。
全文摘要
本发明提供了一种凝乳酶，其中，其氨基酸序列如SEQ ID NO2所示。本发明所述的凝乳酶具备牦牛乳底物特异性，该凝乳酶可用于制备牦牛乳乳酪。本发明还提供了一种编码权利要求1所述的凝乳酶的基因，其中，其核昔酸序列如SEQ ID NO1所示。本发明的优点为，该种凝乳酶使牦牛乳快速凝固，可以克服传统凝乳酶不适宜牦牛乳乳酪生产的问题，作为小牛皱胃凝乳酶的替代品，在牦牛乳深加工领域具备广泛的应用前景。
文档编号A23C19/02GK103243081SQ20121003301
公开日2013年8月14日 申请日期2012年2月14日 优先权日2012年2月14日
发明者不公告发明人 申请人:兰州小凉河生物技术有限责任公司