专利名称：肝素黄杆菌肝素酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的冻干保存方法
技术领域：
本发明涉及一种肝素酶I、II、III的冻干保存方法，尤其涉及一种由氯化钙和海藻糖组成的保护剂，用于冻干过程中肝素酶I、II、III的活性保护。
背景技术：
肝素酶是指一类能够特异性裂解肝素和类肝素主链糖苷键的酶，最初是从肝素黄杆菌中发现并分离出来的，其后，又陆续在一些微生物和动物组织中发现存在肝素酶。肝素酶的应用十分广泛，如清除血液中残存肝素、防止凝血、生产低分子肝素、研究肝素的结构。目前有学术论文报道的肝素酶大约有10多种，得到较为细致研究的只有来自肝素黄杆菌的3种酶，分别是肝素酶I、肝素酶II、肝素酶III。肝素酶I、II、III分别是分子量大约 43、78、66kd的单体蛋白质，其等电点均在9.0左右，应用和研究非常广泛。肝素酶是一种很容易失活的酶，Daniel等[Daniel etal, (1992) J. Bio. Chem. 267(34)24347-24355]简述了对纯化的三种肝素酶做的稳定性研究，肝素酶I溶液在 4°C短期保存即失活50%，而经过一次冷冻融化或冻干融化，只能分别保留45%和25%的活性。肝素酶II经过一次冷冻融化或冻干融化，都可保留大约75%活性。肝素酶III溶液在4°C短期保存基本不失活，而经过一次冷冻融化或冻干融化，只能保留20%到30%的活性。给肝素酶I溶液中添加2mg/ml牛白蛋白，可在三种处理条件下保持85 %以上的活性，而加入5%的半乳糖，则能保留40-80%的活性。肝素酶II溶液中即使添加了所述两种保护剂，也基本无促进效果。添加牛白蛋白，可使肝素酶111活性收率提高20-25 %，但添加半乳糖反而使活性更加不稳定。对于需要保持生物活性的酶类物质的保存和使用，冻干粉是一种很有效的方法。 干燥的酶类一般具有更高的稳定性，也方便运输。但是酶类一般都对热敏感，所以需要采用冷冻干燥法。先将待干燥的酶液在低温下冻结，然后低温抽真空让水分由固体状态直接升华为水蒸气并从酶中排除而实现干燥。但是在酶冻结过程中有些比较脆弱的酶仍会发生失活现象，需要加入某种保护剂，比如海藻糖、蔗糖、白蛋白、明胶等。不同的保护剂适用于不同的酶。对肝素酶做冻干保护的研究报道可检索到的很少，主要在Daniel等 [Danieletal, (1992) J. Bio. Chem. 267(34)24347-24355]的研究中，但给出的信息也不全面，有些结果也与我们的结果有差异。其中肝素酶I在没有保护剂的情况下经过一次冻干融化保留25%的活性的结果与我们的实验结果接近(33. 8% )。肝素酶II经过一次冻干融化保留75%活性的结果则与我们的实验结果(38. 3% )相差较大。肝素酶III经过一次冻干融化保留30%活性的结果与我们的实验结果接近(47. 2% )。本发明给出一种以氯化钙和海藻糖为内容的冻干保护剂，用于将肝素酶I、II、III 冻干，在保护剂作用下维持了较高的活性。这样制得的酶冻干粉便于储存、运输、使用，提高了应用价值。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种肝素酶I、II、III的冻干保存方法，尤其涉及一种由氯化钙和海藻糖组成的保护剂，用于冻干过程中肝素酶I、II、III的活性保护。该方法可对3种酶的冻干起到显著保护作用，冻干粉复水后肝素酶I的活性回复率为 73. 9% (对照为33. 8% )，肝素酶II的活性回复率为98. 8% (对照为38. 3% )，的活性回复率为77. 4% (对照为47. 2% )。在本发明的第一方面，本发明提供了肝素酶I和/或II的冻干保存方法，包括下述步骤步骤I、制备肝素酶I、II溶液，采用TriS-HCl缓冲液、乙酸-乙酸钠缓冲液、乙酸-乙酸钙缓冲液等作为溶解上述肝素酶的溶剂；步骤2、制备保护剂溶液制备海藻糖溶液以及任选的氯化钙溶液，或者二者的混合溶液，采用Tris-HCl缓冲液、乙酸-乙酸钠缓冲液、乙酸-乙酸钙缓冲液等作为溶解上述保护剂的溶剂；步骤3、将步骤2中获得的保护剂溶液和步骤I中获得的肝素酶I和/或II的溶液的混合；步骤4、将混合液冻干。在本发明的第二方面，本发明提供了肝素酶III的冻干保存方法，包括下述步骤步骤I、制备肝素酶III溶液，采用Tris-HCl缓冲液、乙酸-乙酸钠缓冲液、乙酸-乙酸钙缓冲液等作为溶解上述肝素酶的溶剂；步骤2、制备保护剂溶液制备海藻糖溶液，采用Tris-HCl缓冲液、乙酸-乙酸钠缓冲液、乙酸-乙酸钙缓冲液等作为溶解上述保护剂的溶剂；步骤3、将步骤2中获得的保护剂和步骤I中获得的肝素酶III的溶液的混合；步骤4、将混合液冻干。在上述实施方案中，优选步骤I中用于溶解肝素酶I、II和/或III的溶剂为 Tris-HCl缓冲液(pH7. 0)，更优选该溶剂为10 50mM的Tris-HCl缓冲液(pH7. 0)，最优选 IOmM 的 Tris-HCl 缓冲液(pH7. 0)；在上述实施方案中，优选步骤I中肝素酶I、II和/或III在溶液中的浓度为 0. l-100IU/ml，更优选为 l-10IU/ml，最优选为 2_5IU/ml。在上述实施方案中，优选步骤2中使用的溶剂为Tris-HCl缓冲液(pH7. 0)，更优选该溶剂为10 50mM的Tris-HCl缓冲液(pH7. 0)，最优选IOmM的Tris-HCl缓冲液 (pH7. 0)；在上述实施方案中，优选步骤2中氯化钙溶液的浓度为40mM_2M，更优选 IOOmM-IM ;优选海藻糖的浓度为20-50% (w/v)，更优选50% (w/v)。在上述实施方案中，优选步骤3中，保护剂溶液与步骤I中获得的肝素酶I、II和 /或III的体积比为1/1-20/1，更优选2/1-10/1，最优选5/1-10/1。在优选的实施方案中，在步骤3中，可以同时或者顺序加入氯化钙和海藻糖溶液；在优选的实施方案中，在步骤3中，当仅仅用于肝素酶I时，混合之后，氯化钙的浓度为20mM，海藻糖的浓度为5% (w/v(g/ml)，即5g/100ml)。
在优选的实施方案中，在步骤3中，当用于肝素酶II时，混合之后，氯化钙的浓度为IOmM,海藻糖的浓度为10% (w/v(g/ml))。在优选的实施方案中，在步骤3中，当用于肝素酶III时，混合之后，海藻糖的浓度 % 10% (w/v(g/ml))。在上述实施方案中，优选在步骤4中，通过以下方式将溶液冻干将加有保护剂的肝素酶在-70°C冷冻结冰，然后置于冷冻干燥器冻干腔内，抽真空过夜干燥。在进一步优选的实施方案中，本发明的肝素酶I、II的冻干保存方法，包括下述步骤步骤I、肝素酶I、II溶液的制备取制备的肝素酶I、II在100倍体积的IOmM Tris-HCl缓冲液(pH7. 0)中透析过夜，测定活性后，调整浓度至酶活力2-5IU/ml，分别装入I. 5ml EP (实验室用小型塑料离心管，1.5ml装量规格)管中。步骤2、保护剂氯化钙溶液和海藻糖溶液的制备预先配制含50% (m/v)海藻糖的IOmM Tris-HCl缓冲液(pH7. 0)以及任选的含 IOOmM 氯化钙的 IOmM Tris-HCl 缓冲液(pH7. 0)。步骤3、保护剂和肝素酶I、II溶液的混合将适当量的上述氯化钙溶液和海藻糖溶液分别加入到肝素酶溶液中，定容到 IOOul。轻轻振荡摇匀，使氯化钙含量达到0-20mM(0 <= c <= 20mM)，海藻糖含量达到 5-10 % (w/v)。步骤4、混合液冻干将加有保护剂的肝素酶在_70°C冷冻结冰，然后置于冷冻干燥器冻干腔内，抽真空过夜干燥。在上述步骤3中，加入保护剂之后，还可以测定酶活力，以进行活性对比。在另一进一步优选的实施方案中，本发明的肝素酶III的冻干保存方法，包括下述步骤步骤I、肝素酶III溶液的制备取制备的肝素酶III在100倍体积的IOmM Tris-HCl缓冲液(pH7. 0)中透析过夜，测定活性后，调整浓度至酶活力2-5IU/ml，装入I. 5ml EP(实验室用小型塑料离心管， 1.5ml装量规格)管中。步骤2、保护剂海藻糖溶液的制备预先配制含50% (m/v)海藻糖的IOmM Tris-HCl缓冲液(pH7. 0)。步骤3、保护剂和肝素酶III溶液的混合将适当量的上述海藻糖溶液加入到肝素酶溶液中，定容到lOOul。轻轻振荡摇匀， 使海藻糖含量达到5-10% (w/v)。步骤4、混合液冻干将加有保护剂的肝素酶在_70°C冷冻结冰，然后置于冷冻干燥器冻干腔内，抽真空过夜干燥。在上述步骤3中，加入保护剂之后，还可以测定酶活力，以进行活性对比。在上述实施方案中，
步骤I所述的酶液的缓冲体系为IOmM Tris-HCl缓冲液(pH7. 0)。步骤2所述的冻干保护剂的缓冲体系为IOmM Tris-HCl缓冲液(pH7. 0)。步骤2所述的冻干保护剂的组成为氯化钙(0_20mM)，海藻糖(5_10% w/v)。步骤3所述的冻干保护剂，用于肝素酶I的组成为氯化钙20mM，海藻糖5%。步骤3所述的冻干保护剂，用于肝素酶II的组成为氯化钙10mM，海藻糖10%。步骤3所述的冻干保护剂，用于肝素酶III的组成为海藻糖10%。对用本发明方法保存的混合冻干粉进行活性测定，证明活性保留率极高。活性保留率的测定方法如下将冻干的肝素酶以IOOul纯化水复水溶解，测定酶活力，与冻干前酶活力相比较，
计算酶活保留率。
具体实施例方式以下通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。实施例所用肝素酶为来自肝素黄杆菌发酵培养后由菌体中分离纯化得到，酶制备过程见发明人早先提交的发明专利“一种肝素酶I、II、III的制备方法”申请号201110241260. 4。a、取制备的肝素酶I、II、III在100倍体积的IOmM Tris-HCl缓冲液(pH7. 0)中透析过夜，测定活性后，调整浓度至酶活力2IU/ml，分别装入I. 5ml EP管中，每管50ul ；b、将适当量的预先配制的含IOOmM氯化钙的IOmM Tris-HCl缓冲液(pH7. 0)和含50% (w/v)海藻糖的IOmM Tris-HCl缓冲液(pH7. 0)分别加入到肝素酶溶液中，定容到 lOOul，轻轻振荡摇匀，使肝素酶I溶液中除缓冲液外含氯化钙20mM、海藻糖5%，使肝素酶 II溶液中除缓冲液外含氯化钙10mM、海藻糖10%，使肝素酶III溶液中除缓冲液外含海藻糖 10 ;C、将加有保护剂的肝素酶在_70°C冷冻结冰，然后置于冷冻干燥器冻干腔内，抽真空过夜干燥；d、将冻干的肝素酶以IOOul纯化水复水溶解，测定酶活力，与冻干前酶活力相比较，计算酶活保留率。在步骤d中，测定酶活力的具体方法如下肝素酶I、II活性测定在5ml石英比色皿中加入在30°C预热过的2. 5ml肝素浓度为 lmg/ml 的 1^8-11(1(501111，含0&(12101111，？117. 0)缓冲液，移取 5-20 酶液，摇匀后在 232nm测定吸光值，读取每分钟的变化量。根据摩尔消光系数计算单位时间产生的双键的摩尔数，并由此计算酶液的单位活性(IU/ml)。肝素酶III (硫酸乙酰肝素酶)(肝素酶III实际上是一种硫酸乙酰肝素酶，测定时采用的底物不是肝素，而是硫酸乙酰肝素)活性测定在Iml石英比色皿中加入在30°C 预热过的0. 5ml硫酸乙酰肝素浓度为lmg/ml的Tris-HCl (50mM，含CaCl2IOmM, pH7. 0)缓冲液，移取5-20 u I酶液，摇匀后在232nm测定吸光值，读取每分钟的变化量。根据摩尔消光系数计算单位时间产生的双键的摩尔数，并由此计算酶液的单位活性(IU/ml)。对照组的试验在上述步骤进行实验时，设立独立的对照组，在步骤b时添加不含氯化钙和/或海藻糖的Tris-HCl缓冲液，其余处理和测定都相同。
经测定，本发明实施例中，肝素酶I的活性回复率为73. 9% (对照为33.8%)，肝素酶II的活性回复率为98. 8% (对照为38. 3%)，肝素酶III的活性回复率为77. 4% (对照为47. 2% )。其中尤其显著的是对肝素酶II的保护，经过多次实验验证活性回复率都接近 100%。总的来说，与已报道方法相比，对肝素酶II、III的冻干保护效果均优于报道的牛白蛋白和半乳糖。对肝素酶I的冻干保护效果略低于报道的牛白蛋白，而高于半乳糖。但是牛白蛋白是个分子量接近肝素酶的蛋白质，其大量加入对于监测酶蛋白的存在有不利影响，而CaCl2和海藻糖都是小分子，而且非蛋白类，不影响酶蛋白的监测。
权利要求
1.一种肝素酶I和/或II的冻干保存方法，包括下述步骤步骤I、制备肝素酶I和/或II溶液；步骤2、制备保护剂溶液制备海藻糖溶液以及任选的氯化钙溶液；步骤3、将步骤2中得到的保护剂溶液和步骤I中得到的肝素酶I、II溶液混合；步骤4、将混合液冻干。
2.一种肝素酶III的冻干保存方法，包括下述步骤步骤I、制备肝素酶III溶液；步骤2、制备保护剂溶液制备海藻糖溶液，；步骤3、将步骤2中获得的保护剂和步骤I中获得的肝素酶III的溶液的混合；步骤4、将混合液冻干。
3.根据权利要求I或2的冻干保存方法，其中，步骤I所述的酶溶液中，Tris-HCl缓冲液、乙酸-乙酸钠缓冲液、乙酸-乙酸钙缓冲液等作为溶解上述肝素酶的溶剂。
4.根据权利要求I或2的冻干保存方法，其中，步骤2所述的保护剂溶液中，Tris-HCl缓冲液、乙酸-乙酸钠缓冲液、乙酸-乙酸钙缓冲液作为溶解上述保护剂的溶剂。
5.根据权利要求I的冻干保存方法，其中，步骤2所述的冻干保护剂的组成为氯化钙0-20mM，海藻糖5-10% (w/v)。
6.根据权利要求I的冻干保存方法，其中，步骤3所述的冻干保护剂，用于肝素酶I的组成为氯化钙20mM，海藻糖5% (w/v)。
7.根据权利要求I的冻干保存方法，其中，步骤3所述的冻干保护剂，用于肝素酶II的组成为氯化钙10mM，海藻糖10% (w/v)。
8.根据权利要求2的冻干保存方法，其中，步骤3所述的保护剂为海藻糖10% (w/v)。
9.根据权利要求I的冻干保存方法，包括下述步骤步骤I、肝素酶I和/或II溶液的制备取制备的肝素酶I和/或II在100倍体积的IOmM Tris-HCl缓冲液(pH7. O)中透析过夜，测定活性后，调整浓度至酶活力2-5IU/ml，分别装入I. 5ml EP管中；步骤2、制备保护剂溶液预先配制含50% (m/v)海藻糖的IOmM Tris-HCl缓冲液(pH7. O)以及任选的含IOOmM 氯化钙的IOmM Tris-HCl缓冲液(ρΗ7· O)；步骤3、混合保护剂溶液和肝素酶I、II溶液将适当量的上述氯化钙溶液和海藻糖溶液分别加入到肝素酶溶液中，定容到IOOul ； 振荡摇匀，使氯化钙含量达到0-20mM，海藻糖含量达到5-10% (w/v)；步骤4、混合液冻干将加有保护剂的肝素酶在_70°C冷冻结冰，然后置于冷冻干燥器冻干腔内，抽真空过夜干燥。
10.根据权利要求2的冻干保存方法，包括下述步骤步骤I、制备肝素酶III溶液取制备的肝素酶III在100倍体积的IOmM Tris-HCl缓冲液(pH7. O)中透析过夜，测定活性后，调整浓度至酶活力2-5IU/ml，装入I. 5ml EP管中；步骤2、制备保护剂溶液预先配制含50% (m/v)海藻糖的IOmM Tris-HCl缓冲液(ρΗ7· O)；步骤3、混合保护剂溶液和肝素酶III溶液将适当量的上述海藻糖溶液加入到肝素酶溶液中，定容到IOOul ;振荡摇匀，使海藻糖含量达到5-10% (w/v)；步骤4、混合液冻干将加有保护剂的肝素酶在_70°C冷冻结冰，然后置于冷冻干燥器冻干腔内，抽真空过夜干燥。
全文摘要
本发明涉及一种肝素酶I、II、III的冻干保存方法，尤其涉及一种由任选的氯化钙和海藻糖组成的保护剂，用于冻干过程中肝素酶I、II、III的活性保护。在保护剂作用下，维持了较高的活性。这样制得的酶冻干粉便于储存、运输、使用，提高了应用价值。
文档编号C12N9/96GK102586217SQ20121004675
公开日2012年7月18日 申请日期2012年2月28日 优先权日2011年12月16日
发明者史绍鹏, 李锂, 马小来 申请人:深圳市海普瑞药业股份有限公司