专利名称：一种通过dl-氨基酸去消旋化制备d-氨基酸的生物催化方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，涉及生物催化制备D-氨基酸的新工艺。特别是利用粪产碱杆菌细胞催化DL-氨基酸去消旋化制备D-氨基酸的生物催化方法。
背景技术：
在自然界中，D-氨基酸是稀有的非蛋白源氨基酸，其数量约占已发现的300多种氨基酸的10%左右。随着医学和生物学的发展，发现D-氨基酸与某些疾病如白内障、早年痴呆、肾脏病等密切相关。此外，D-氨基酸已越来越多地作为手性中间体用于手性药物、手性农药以及手性食品添加剂的合成，在医药、农药和食品领域有广泛应用。D-氨基酸的制备方法主要包括化学法和生物法。化学法主要包括化学拆分法和化学不对称合成法。化学拆分法工艺路线复杂，拆分收率低。化学不对称合成采用价格昂贵的手性源、手性助剂或手性催化剂，得到的D-氨基酸光学纯度不高。生物法包括生物拆分法、生物不对称合成法和生物去消旋化法。生物法具有过程简单、转化效率高、副产物少、分离纯化工艺简单等优点，已成为D-氨基酸的主流生产技术。生物拆分法以酰化酶、脂肪酶等酶为生物催化剂对衍生的DL-氨基酸进行拆分，D-氨基酸的理论收率为50%，涉及衍生、去衍生等步骤，工艺普适性差。生物不对称合成法如转氨酶法以D-转氨酶为生物催化剂，价格高昂的酮酸为原料、另一个D-氨基酸为氨供体，分离工艺相当复杂。
发明内容
本发明的目的是提供一种光学纯度高、分离工艺简单的D-氨基酸制备方法。为实现本发明目的而采用的技术方案是这样的，一种通过DL-氨基酸去消旋化制备D-氨基酸的方法，以一种DL-氨基酸为原料，通过以下步骤获得所述DL-氨基酸中的 D-对映体
a)细胞培养将粪产碱杆菌接种到培养基中，采用所述DL-氨基酸中的L-对映体作为诱导剂加入培养基中，30°C下培养24h，离心，获得湿菌体；
b)细胞通透性处理采用丙酮对步骤a)所获得的湿菌体处理5 20min，离心，用生理盐水洗涤，获得通透性细胞；
c)酶催化反应将步骤b)所获得的通透性细胞加入蒸馏水中，使其悬浮，加入所述原料，30°C下反应24 72h，使原料DL-氨基酸中的L-对映体氧化脱氨形成酮酸；
d)D-氨基酸分离将步骤c)的反应液离心以去除细胞，所获得的离心液加入盐酸酸化至pH2 3，浓缩至干，得D-氨基酸盐酸盐；将所述D-氨基酸盐酸盐溶于乙醇中，过滤，向滤液中加入环氧丙烷以脱除盐酸，获得D-氨基酸。生产工艺路线是
权利要求
1.一种通过DL-氨基酸去消旋化制备D-氨基酸的方法，其特征在于以DL-氨基酸为原料，通过以下步骤获得所述DL-氨基酸中的D-对映体a)细胞培养将粪产碱杆菌菌株接种到培养基中，采用所述DL-氨基酸中的L-对映体作为诱导剂加入培养基中，30°C下培养24h，离心，获得湿菌体；b)细胞通透性处理采用丙酮对步骤a)所获得的湿菌体处理5 20min，离心，用生理盐水洗涤，获得通透性细胞；c)酶催化反应将步骤b)所获得的通透性细胞加入蒸馏水中，使其悬浮，加入所述原料，30°C下反应24 72h，使原料DL-氨基酸中的L-对映体氧化脱氨形成酮酸；d)D-氨基酸分离将步骤c)的反应液离心除去细胞，所获得的离心液加入盐酸酸化至 pH2 3，浓缩至干，得D-氨基酸盐酸盐；将所述D-氨基酸盐酸盐溶于乙醇中，过滤，向滤液中加入环氧丙烷以脱除盐酸，室温下搅拌30min，过滤，固体用无水乙醇洗涤，烘干，得对映纯D-氨基酸。
2.如权利要求I所述的一种通过DL-氨基酸去消旋化制备D-氨基酸的方法，其特征在于所述原料DL-氨基酸选自DL-丙氨酸、DL-亮氨酸、DL-缬氨酸、DL-蛋氨酸、DL-丝氨酸、DL-天冬氨酸、DL-谷氨酸、DL-苯丙氨酸、DL-酪氨酸、DL-色氨酸、DL-赖氨酸或DL-鸟氨酸；其中步骤a)中，所述L-对映体是与所述原料具有相同R基的L-丙氨酸、L-亮氨酸、L-缬氨酸、L-蛋氨酸、L-丝氨酸、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-苯丙氨酸、L-酪氨酸、L-色氨酸、 L-赖氨酸或L-鸟氨酸。
3.如权利要求I所述的一种通过DL-氨基酸去消旋化制备D-氨基酸的方法，其特征在于步骤 a)中粪产碱杆菌菌株选自 Alcaligens faecali I. 767、I. 924、I. 1799、I. 7686、I.2006,1. 1837。
4.如权利要求I所述的一种通过DL-氨基酸去消旋化制备D-氨基酸的方法，其特征在于步骤b)中所述丙酮溶液的浓度为30%。
5.如权利要求I所述的一种通过DL-氨基酸去消旋化制备D-氨基酸的方法，其特征在于步骤c)中，所述原料浓度为O. 02 O. 2mol/L。
6.如权利要求I所述的一种通过DL-氨基酸去消旋化制备D-氨基酸的方法，其特征在于步骤d)中，所述环氧丙烷与DL-氨基酸的摩尔比为2 2. 4 I。
全文摘要
本发明提供一种通过DL-氨基酸去消旋化制备D-氨基酸的生物催化方法。以经通透性处理后的粪产碱杆菌细胞为生物催化剂，利用其中的L-氨基酸氧化酶在空气存在下将DL-氨基酸的L-对映体特异性氧化脱氨为相应的酮酸，D-对映体保留，同时利用共表达的过氧化氢酶分解反应过程中产生的过氧化氢。本发明的方法避免了传统拆分方法的衍生和去衍生步骤，具有过程简单、成本低廉，产品光学纯度高，环境友好的特点，适合D-氨基酸的工业化生产。
文档编号C12P41/00GK102586384SQ201210049258
公开日2012年7月18日 申请日期2012年2月29日 优先权日2012年2月29日
发明者何从林, 夏仕文, 徐红梅, 方国兰 申请人:重庆凯乐尔生物催化技术有限公司, 重庆邮电大学