专利名称：V5抗原表位融合性酵母表达载体及构建方法
技术领域：
本发明属于基因生物工程领域，具体涉及一种V5抗原表位融合性酵母表达载体及构建方法。
背景技术：
酵母是最常用的基因生物工程宿主细胞，这是酵母是单细胞低等真核生物细胞， 不仅具有易培养、繁殖、生长条件要求不高等特点外，而且具有遗传背景清楚、基因结构、基因调控、代谢和蛋白质翻译后加工与哺乳动物细胞相似等特点。所以，用酵母细胞表达外源性基因具有良好的发展应用前景。验证外源性基因在酵母中是否表达，通常是选用外源性基因表达产物的特异性抗体或通过测试外源性基因表达产物的功能来实现。但外源性基因种类很多，许多无特异性商品化抗体，即是有特异性抗体也较昂贵；通过外源性基因表达产物的生物功能进行验证更加复杂，因为对外源性基因表达产物的生物功能有时难以建立方法进行验证，即是建立了方法也较复杂，特别是难验证某些新发现基因在酵母细胞中的表达更加困难。V5抗原是来自副黏液病毒猿猴病毒5的P和V蛋白的抗原表位，多由14个氨基酸(GlyLysProIlePr oAsnProLeuLeuGlyLeuAspSer Thr)组成。V5抗原表位抗体为一种通用性抗体，目前已经商品化。
发明内容
为了解决目前验证外源性基因在酵母细胞中的表达的困难，本发明提供了一种V5 抗原表位融合性酵母表达载体，可以有效地解决外源性在酵母细胞表达的验证问题。本发明采用的技术方案是1)以hvitrogen公司的pYestrp2载体为基本框架，通过PCR方法从酵母基因组扩增酵母强启动子GPD，并经Swa I和BamH I两酶切位点，将其插入到pYestrp2载体中，构建成GPD驱动的酵母表达载体，命名为pGPD ；2)人工合成两条V5抗原表位DNA单链，并分别在各单链的5 ‘端增加BamHI和 EcoR I黏性末端(小写所示)。为了能使V5抗原表位DNA能与下游基因相融合，同时在合成时，分别在正链的3'和反链5'端分别增设一个G和C (如下方框所示)，使V5抗原表位 DNA通过柔性短肽Gly (甘氨酸)-Ile (异亮氨酸)-即GGA-ATT-与下游基因相融合。人工合成的V5抗原表位(Vkpitope)DNA 正链为5 ‘ -gatccATGGGTAAGCCTATCCCTAACCCTCTCCTCGGTCTCGATTCTACA § g_3 ‘；反链为5' -aattc ■ TGTAGAATCGAGACCGAGGAGAGGGTTAGGGATAGGCTTACCCATg-3 ‘；3)将所合成的V5抗原表位DNA用退火缓冲配成5umol/L，等体积混合，常规退火形双股，将插入到PGPD的相应酶切位点，构建成可与V5抗原表位相融合的酵母表达载体 PGPDV5。
图1本发明V5抗原表位融合性酵母表达载体示意图。图2为本发明的技术路线示意图。图3与V5融合的TR蛋白在酵母细胞中的表达。图4AR在酵母细胞中的表达。图5V5抗原表位融合性AR的功能验证原理。其中各泳道为V5融合性TR在不同克隆酵母细胞中的表达。图6V5抗原表位融合性AR功能验证结果。其中各泳道为V5融合性AR在不同克隆酵母细胞中的表达。
具体实施例方式文中所用到的质粒pYESTrp2 购自 Invitrogen 公司。pcDNA/TR 购自 Clontech 公司pcDNA3. 1/AR (1、Takeyoshi, Μ. , Kuga, N. , Yamasaki, K. , Development of a highperformance reporter plasmid for detection of chemicals with androgenic activity. Arch. Toxicol. 2003 ；77 :274-279 ；2、徐莉春，孙宏，宋玲，王心如，雄激素受体(hAR) CAT报告基因筛选AR激动剂和拮抗剂的方法研究，环境与职业医学，2008 ； 25(3) :259-262 ；3、Li-Chun Xu, Hong Sun, Jian-Feng Chen, Qian Bian, Jie Qian, Ling Song, Xin-Ru Wang. Evaluation of androgen receptor transcriptional activities of bisphenol A, octylphenol and nonylphenol in vitro. Toxicology, 2005 ；216 :197-203 ；4> Li-Chun Xu, Lu Liu, Xiang-Mei Ren, Mei-Rong Zhang, Ning Cong, Ai-Qin Xu, Ji-Hong Shao. Evaluation of androgen receptor transcriptional activities of some pesticides in vitro. Toxicology, 2008 ；243 :59-65 ；5> Hong Sun, Li-Chun Xu, Jian-Feng Chen, Ling Song, Xin-Ru Wang. ^Efffect of bisphenol A, tetrachlorobisphenol A and pentachlorophenol on the transcriptional activities of androgen receptor-mediated reporter gene. Food and Chemical Toxicology. 2006 ； 44 :1916-1921.)由日本 Takeyoshi Masahiro 博士 (Chemical Evaluation and Research Institute)馈赠，申请人实验室保存。根据GeneBank中的GPD启动子DNA序列(gil71M2)，用PCR方法从酵母DNA提取液中扩增 GPD 启动子，上游引物为 5’ -CTGATTTAAATCGAGTTTA TCATTATCAATA-3，(SEQ ID No. 1)，下游引物为 5’-TCCGGATCCGTCGAAACTAAGTTCTTGGT-3’ (SEQ ID No. 2)。在引物的 5' 端分别设计Swa I和BamH I两酶切位点(下划线所示)，并增加3个保护碱基。PCR产物经常规纯化回收后备用。用Swa I和BamH I分别对载体pYESTrp2和GPD的PCR产物双切， 用T4连接酶将⑶P启动子与pYESTrp2载体相连，构建成GPD驱动的酵母表达载体(ρ⑶P)。V5抗原表位(V5印itope) DNA由上海生功合成，正链为5 ‘ -gatccATGGGTAAGCCTAT CCCTAACCCTCTCCTCGGTCTCGATTCTACA g g-3 ‘ (SEQ IDNo. 3)，反链为 5 ‘ -aattc ■ TGTAGAAT CGAGACCGAGGAGAGGGTTAGGGATAGGCTTACCCATg-3' (SEQ ID No. 4)。分别在正、反链的 5'端增设BamH I和EcoR I黏性末端(小写所示)。同时在正链的3'和反链5'端分别增设一个G和C(方框所示)，使V5印itope DNA后增加1个Gly (甘氨酸)密码子即GGA，以便与下游基因相融合。将单股V5印itope DNA用STES缓冲配成5 μ mol/L,各取20 μ L于PCR管中混合， 置于500m L水中加热至95°C，维持5min，立即停止加热，冷却至室温(约2h)，使之退火形成双股。对pGPD用BamH I和EcoR I双切，用DNA试剂盒回收载体片段，并用T4连接酶与 V5epitope DNA连接，连接产物转化于DH5 α，用营养琼脂/Amp平板筛选阳性克隆，转化子克隆质粒进行PCR鉴定，引物分别为GPD上游启动子引物和反向V5印itope DNA0对鉴定正确的质粒测序，将其命名为PGPDV5。实施例1 本发明对四环素阻遏蛋白(TR)在酵母细胞中的表达验证。四环素阻遏蛋白(TR)为对大肠杆菌四环素转座子的一种蛋白质，分子量20kD左右，目前未见其在酵母细胞中表达报道。以pcDNA/TR为模板，PCR扩增TR基因开放性阅读框(ORF)，上游引物为 5' -GTGgaattc @ ATGTCTAGATTAGATAAAAG-3 ‘ (EcoR I) (SEQ ID No. 5)，下游为 5' -AAGctcgagTTAATAAGATCTGAATTCCC-3' (Xhol I) (SEQ ID No. 6)。PCR 产物经DNA试剂盒纯化后，用EcoR I和Biol I双酶切，将切下的TR插入到V5融合酵母表达载体pGPDV5中，通过柔性短肽Gly (甘氨酸)-IIe (异亮氨酸)-Leu (亮氨酸)的密码子即GGA-ATT-CTG与V5抗原表位相融合，将所构建的载体命名为pGPDV5/TR。将载体pGPDV5/TR用醋酸锂(LiAC)方法转染于W303-1A酵母细胞，用SD/trp-平板筛选出阳性克隆，挑取3mm左右克隆，置于SD/-trp培养液中扩大培养，取对数生长期的酵母细胞，提取蛋白质，用Western blot方法进行分析，一抗用小鼠抗V5表位单克隆抗体IgG2aGnvitrogen公司产)，二抗用偶联有辣根过氧化物酶的羊抗小鼠的多克隆抗体 (IgG-HRP，北京天根公司产)。通过验证发现TR基因的在酵母细胞表达(图3)。实施例2 本发明对人雄激素受体(AR)在酵母细胞中表达及功能的验证1)人雄激素受体(Al )在酵母细胞中表达验证。人雄激素受体分子量约为llOkd。用PCR方法从pcDNA3. 1/AR中扩增AR 0RF,引物设计为上游5 ‘ -CAGgaattc [XX ATGGAAGTGCAGTTAGGGCT-3 ‘ (SEQ ID No. 7)，下游为 5' -CTActcgagTCACTGGGTGTGGAAATAGA -3' (SEQ ID No. 8)，各自含有EcoR I和Bio I酶切位点(小写所示)。PCR产物用试剂盒回收纯化，将其插入到PGPDV5的相应酶切位点，构建成pGPDV5/AR。V5抗原表位通过柔性短肽Gly (甘氨酸)-Ile (异亮氨酸)-Gln (谷氨酰氨)的密码子即GGA-ATT-CAA与AR相融
口 O按实施例1的方法将pGPDV5/AR转化于W303-1A酵母细胞，用相同的方法验证AR 在酵母细胞中的表达。由图4可见AR在酵母细胞中表达。2)人雄激素受体(AR)在酵母细胞中表达的功能验证。雄激素是通过与雄激素受体(AR)结合而发挥其功能的。AR与雄激素结合后可发生变构效应，激活受体复合物并使其能够与细胞核的DNA受体位点结合，此位点被称为雄激素效应元件(androgen response element, ARE)或雄激素受体互补核糖核酸，发挥雄激素效应。为了验证AR与V5抗原表位相融合后，是否对会AR的生物活性产生影响，我们将PGPDV5/AR转化于ARE调控的重组Lac Z酵母细胞(图5所示)。Lac Z基因编码β -半乳糖苷酶，但表达量是在ARE的调控之下。半乳糖苷酶可催化底物ONPG显黄色，如果AR 的生物活性未受到V5抗原表位影响，则在雄激素作用下，β -半乳糖苷酶表达量会明显升高，酵母细胞会底物ONPG明显显色，反之，则相反。 图6为V5抗原表位融合性AR功能验证结果，可见所挑取的6个酵母克隆，经雄激素(醋酸丙睾酮5X10_4mg/L)诱导6小时后，用ONPG显色后，于405nm比色，发现其OD值与空白对照明显不同，说明V5抗原表位与AR相融合后，对AR生物活性功能没有影响。
权利要求
1.一种酵母细胞表达载体，其特征在于该表达载体具有V5抗原表位，V5抗原表位可通过柔性短肽Gly-Ile-与下游基因相融合，将该载体命名为pGPDV5。
2.如权利要求1所说的酵母表达载体PGPDV5，其特征在于V5抗原表位DNA可在酵母强启动子GPD的驱动下与下游的外源性基因进行融合表达，且不会影响下游基因表达产物的生物活性。
3.—种酵母表达载体PGPDV5的构建方法，是1)以hvitrogen公司的pYestrp2载体为基本框架，通过PCR方法从酵母基因组扩增酵母强启动子GPD，并经Swa I和BamH I两酶切位点，将其插入到pYestrp2载体中，构建成 GPD驱动的酵母表达载体，命名为pGPD ；2)人工合成两条V5抗原表位DNA单链，正链为 5 ‘ -gatccATGGGTAAGCCTATCCCTAACCCTCTCCTCGGTCTCGATTCTACAGg-3 ‘；反链为 5 ‘ -aattcCTGTAGAATCGAGACCGAGGAGAGGGTTAGGGATAGGCTTACCCATg-3 ‘；3)将所合成的V5抗原表位DNA用退火缓冲配成5umol/L，等体积混合，常规退火形双股，将插入到PGPD的相应酶切位点，构建成可与V5抗原表位相融合的酵母表达载体 PGPDV5。
全文摘要
本发明涉及一种可与V5抗原表位相融合的酵母表达载体及其构建方法。所说的V5抗原表位相融合的酵母表达载体，是一种含有V5“标签”(tag)酵母表达载体，该“标签”可通过一个柔性短肽Gly-Ile-与下游基因相融合，不会影响下游表达蛋白的生物活性。其构建方法是以Invitrogen公司的pYestrp2载体作为基本框架，将酵母强启动子GPD插入到pYestrp2载体中，构建成酵母表达载体pGPD，再将5′和3′端具有BamHI和EcoRI黏性末端V5抗原表位DNA，插入到pGPD相应的酶切位点，构建成V5融合性酵母表达载体pGPDV5。pGPDV5可通过柔性短肽与下游基因相融合。由于V5抗体已经商品化，故本发明可以方便、特异性、有效地验证外源性基因的在酵母细胞中的表达，且费用相对较低。
文档编号C12N15/81GK102533843SQ201210053179
公开日2012年7月4日 申请日期2012年3月2日 优先权日2012年3月2日
发明者李湘鸣, 罗方妮, 葛宜枝 申请人:扬州大学