专利名称：一种具有多氯联苯降解功能固氮蓝藻的分离筛选方法
技术领域：
本发明属于微生物的筛选方法领域，特别涉及一种具有多氯联苯降解功能固氮蓝藻的分离筛选方法。
背景技术：
有机氯化合物由于其突出的持久性、生物积累性和生物毒性等特征而受到全世界的广泛关注。虽然目前很多国家已禁止了对有机氯农药的使用，但它们仍广泛的残留于农业土壤、水体以及食物当中，对人类健康造成巨大的威胁。由于微生物能够通过矿化、共代谢、浓缩等作用对有机氯农药进行特异性降解的优势明显，微生物原位降解修复技术是当前有机氯污染土壤的主流。固氮蓝藻主要是蓝藻门念珠藻目(Nostocales)鱼腥藻属(Anabeana)和念珠藻属 (Nostoc)的多种丝状异型胞,能够在固氮酶作用下从大气中固定N2转变为NH4+等生源氮素。固氮蓝藻固氮作用主要应用于水稻田营养氮素的提供，对于水稻土肥力稳定，以及水稻生长和稻米产量增加具有重要的现实意义。近年来对固氮蓝藻具有降解有机氯化合物能力的发现，使得固氮蓝藻在稻田的应用具有显著的“固氮”和“降解”双重作用。因此对固氮蓝藻原位修复水稻土的研究具有不可替代的优势。一直以来，有关固氮蓝藻的科学研究主要集中在固氮藻种的固氮活性测定及其生理生化机制分析，固氮调控基因及固氮酶结构表征等方面，有关藻种筛选的特别是抗逆性藻种的筛选研究还未深入，且针对固氮蓝藻对土壤污染物的降解研究也仅限于实验室的小试阶段，实验主要将培养于液体培养基中固氮蓝藻暴露于污染物中，通过批次实验来研究固氮蓝藻对某种污染物的降解效率，降解半衰期，降解动力学等参数。该方法简便易行，对掌握固氮蓝藻的降解特异性及其降解机理有很好的作用，但该方法并不能很好的解决筛选和分离具有降解功能藻种的技术难题，以实现原位微生物修复的现实意义。目前已有的藻类筛选技术主要集中在对能源藻种的筛选以及通过微生物平板筛选、离体筛选以及基因克隆等技术手段实现。微生物平板筛选方法虽然能够起到筛选的作用，但很难解决如固氮蓝藻生长需氧量等条件，且筛选效率较低，很难在短时间内筛选出大量的目标藻种；离体筛选和基因克隆虽然目标性强，能够快速筛选出所需的目标藻种，但其只有在前期鉴定出功能基因的基础上才能实验，且花费成本大，不利于原位技术的推广应用。
发明内容
为了解决现有筛选方法中存在的难以满足固氮蓝藻生长需氧量条件、筛选效率较低等问题，本发明提供一种成本低，操作简便，效率高，特异性强，利于工程推广的具有多氯联苯降解功能固氮蓝藻的分离筛选方法。本发明采用的技术方案是一种具有多氯联苯降解功能固氮蓝藻的分离筛选方法，其特征在于所述方法包括以下步骤I)配置无氯培养基，加入琼脂糖后灭菌，待冷却至60°C加入多氯联苯，混合均匀后倒入分离筛选装置中相应的筛选区中，冷却固定，作为筛选藻种的固体培养基；2)将采集至野外土壤中经过预培养的混合藻液进行离心分离，弃上清，用无氯培养基重悬细胞，混匀后得到所述混合藻液的浓缩液；3)将步骤2)中得到的混合藻液的浓缩液倒入步骤I)中的固体培养基上；4)将所述分离筛选装置于培养室恒温培养。本发明的具体原理为多氯联苯的微生物降解的基本原理为脱氯或脱氯化氢，因此将混合藻液暴露于含有多氯联苯的无氯固体培养基中，因固氮蓝藻生长环境中缺乏生长所必须的氯离子，就会诱导具有潜在脱氯功能的固氮蓝藻降解多氯联苯脱氯或氯化氢，从而达到自身生长和多氯联苯降解的目的，因此能够脱氯的固氮蓝藻藻种得以存活且长势良好，藻种密度变大，无法脱氯的藻种难以存活或长势较弱或长势缓慢。本发明中使用的无氯培养基理论上只需不含氯离子，且能够提供固氮蓝藻生长所需的必要无机盐即可；本发明是以其他形式钙盐代替氯化钙，本发明优先选用磷酸二氢钙； 本发明需将多氯联苯均匀分散于固体培养基中，达到理想的筛选目的。本发明具体推荐一种具有降解功能固氮蓝藻的分离筛选装置，包括可拆卸的平板底座和平板盒盖；所述的平板底座包括底板和桶体，所述底板和所述桶体通过卡扣固定连接；所述桶体内设有多个可拆卸的环形培养基挡板，将所述底板分割成不同大小的环形筛选区，所述培养基挡板通过卡扣固定在所述底板上；所述平板盒盖上设有用于固定所述平板底座的固定装置和与所述培养基挡板配合使用的环形培养基定型模具，顶部设有隔板装置，所述培养基定型模具通过卡扣固定在所述平板盒盖上；所述培养基挡板内设有卡槽，所述平板盒盖上设有与所述卡槽相对应位置的固定体，所述固定体嵌入所述卡槽将所述培养基挡板和所述平板盒盖固定相连。进一步，所述固定体是末端呈60°角的实心三角锥，所述卡槽是末端呈60°角的空心三角锥，所述固定体通过与所述卡槽镶嵌固定所述培养基挡板和所述平板盒盖。进一步,所述培养基挡板可根据不同的实验需求选取内径为20mm-75mm的圆环。进一步,所述培养基定型模具是半径为17. 5mm_77. 5mm的圆环。进一步，所述隔板装置内装有可替换的隔菌透气薄膜。进一步，本发明所述的装置材料均为透明PVE材料。本发明中，上述分离筛选装置的使用方法首先根据实验需求设计实验分组，选择合适的培养基挡板，并通过卡扣将其安装固定在平板底座上，形成具有环形的独立小单元的筛选区。将加入琼脂糖和多氯联苯的已灭菌的固体培养基倒入相应的筛选区中冷却固定。选择和培养基挡板配套的培养基定型模具，并将其通过卡扣固定于平板盒盖上，再将平板盒盖通过固定装置和固定体与平板底座相固定，形成密闭的空间。此时培养基定型模具伸入冷却中的培养基中进行造模。隔板装置中安装有隔菌透气的薄膜以达到隔绝细菌，提供氧气的目的。待培养基冷却后，将平板盒盖小心拿起，卸下固定装置和固定体。取预培养后的混合藻液，离心弃上清，用无氯培养基重悬混匀后均匀平铺于已造模好的筛选区内，再次盖上平板盒盖，于指定条件下进行培养筛选。待实验完成后，挑选适合的藻落进行后续培养，如需更换培养基，只需解开卡扣，卸下底板和平板盒盖即可。
进一步，步骤I)中所述的无氯培养基中各物质的配方浓度为硝酸钠I. 5g/L，七水合硫酸镁O. 075g/L,乙二胺四乙酸二钠O. 001g/L，三水磷酸氢二钾O. 04g/L，磷酸二氢钙 O. 057g/L，碳酸钠O. 02g/L,柠檬酸O. 006g/L,柠檬酸铁铵O. 006g/L, A5溶液lmL/L，所述A5 溶液中各物质的配方浓度为硼酸2. 86g/L，氯化锰I. 81g/L，七水合硫酸锌O. 222g/L，五水合硫酸铜O. 079g/L，二水合钥酸钠O. 39g/L，六水合硝酸钴O. 39g/L。进一步，步骤I)中所述的琼脂糖的用量为O. 1-0. 7g，所述多氯联苯的用量为 O. 01-0. 35mg。进一步，步骤I)中所述的固体培养基的用量为10_70mL。进一步，步骤2)中所述的预培养的混合藻液为1/2BG11培养基。进一步，步骤2)中所述的混合藻液的浓缩液的细胞密度为2X 106-107Cells/mL ； 所述的离心转速为2500-4500rpm,离心时间为10_30min ;更进一步,优选的所述的混合藻液的浓缩液的细胞密度为5X106cells/mL，离心转速为4000rpm，离心时间为lOmin。进一步，步骤4)中所述的恒温培养条件为温度25°C，湿度70%，光照 20001ux，光暗比 I I。本发明中技术人员应根据实际混合藻液的情况，合理选择混合藻液的预培养方案，如藻密度较大则可直接进行筛选，如藻密度较少，则需进行预培养，本发明优先选择 1/2BG11培养基为预实验培养基,如混合藻液不适合在同一种培养基上培养，还需进行不同培养基的预培养筛选。本发明的有益效果体现在筛选效率高，能在短时间内筛选出大量的目标藻种，筛选成本低，利于实际应用推广，操作简便且特异性强，是目前关于固氮蓝藻筛选较为有效的方法，具有广泛的应用前景。
图I是本发明使用的分离筛选装置的平板盒盖结构示意图。图2是本发明使用的分离筛选装置的平板底座结构示意图。图3是本发明实施例2的筛选效果图。
具体实施例方式实施例I一种具有多氯联苯降解功能固氮蓝藻的分离筛选方法，其特征在于所述方法包括以下步骤I)配置无氯培养基，加入琼脂糖后灭菌，待冷却至60°C加入多氯联苯，混合均匀后倒入分离筛选装置中相应的筛选区中，冷却固定，作为筛选藻种的固体培养基；2)将采集至野外土壤中经过预培养的混合藻液进行离心分离，弃上清，用无氯培养基重悬细胞，混匀后得到所述混合藻液的浓缩液；3)将步骤2)中得到的混合藻液的浓缩液倒入步骤I)中的固体培养基上；4)将所述分离筛选装置于培养室恒温培养。本发明的具体原理为多氯联苯的微生物降解的基本原理为脱氯或脱氯化氢，因此将混合藻液暴露于含有多氯联苯的无氯固体培养基中，因固氮蓝藻生长环境中缺乏生长所必须的氯离子，就会诱导具有潜在脱氯功能的固氮蓝藻降解多氯联苯脱氯或氯化氢，从而达到自身生长和多氯联苯降解的目的，因此能够脱氯的固氮蓝藻藻种得以存活且长势良好，藻种密度变大，无法脱氯的藻种难以存活或长势较弱或长势缓慢。本发明中使用的无氯培养基理论上只需不含氯离子，且能够提供固氮蓝藻生长所需的必要无机盐即可；本发明是以其他形式钙盐代替氯化钙，本发明优先选用磷酸二氢钙； 本发明需将多氯联苯均匀分散于固体培养基中，达到理想的筛选目的。本发明具体推荐一种具有降解功能固氮蓝藻的分离筛选装置，特点是包括可拆卸的平板底座I和平板盒盖2 ;所述的平板底座I包括底板11和桶体12，所述底板11和所述桶体12通过卡扣13固定连接；所述桶体12内设有三个可拆卸的环形培养基挡板15，将所述底板11分割成四个环形筛选区17，所述培养基挡板15通过卡扣14固定在所述底板11 上；所述平板盒盖2上设有用于固定所述平板底座I的固定装置21和四个与所述培养基挡板15配合使用的环形培养基定型模具23，顶部设有隔板装置25，所述培养基定型模具23 通过卡扣24固定在所述平板盒盖2上；所述培养基挡板15内设有卡槽16，所述平板盒盖 2上设有与所述卡槽16相对应位置的固定体22，所述固定体22嵌入所述卡槽16将所述培养基挡板15和所述平板盒盖2固定相连。进一步，所述固定体22是末端呈60°角的实心三角锥，所述卡槽16是末端呈 60°角的空心三角锥，所述固定体22通过与所述卡槽16镶嵌固定所述培养基挡板15和所述平板盒盖2。进一步，所述培养基挡板15可根据不同的实验需求选取内径为20mm-75mm的圆环。进一步,所述培养基定型模具23是半径为17. 5mm-77. 5mm的圆环。进一步，所述隔板装置25内装有可替换的隔菌透气薄膜。进一步，本发明所述的装置材料均为透明PVE材料。本发明中，上述分离筛选装置的使用方法首先根据实验需求设计实验分组，选择合适的培养基挡板，并通过卡扣将其安装固定在平板底座上，形成具有环形的独立小单元的筛选区。将加入琼脂糖和多氯联苯的已灭菌的固体培养基倒入相应的筛选区中冷却固定。选择和培养基挡板配套的培养基定型模具，并将其通过卡扣固定于平板盒盖上，再将平板盒盖通过固定装置和固定体与平板底座相固定，形成密闭的空间。此时培养基定型模具伸入冷却中的培养基中进行造模。隔板装置中安装有隔菌透气的薄膜以达到隔绝细菌，提供氧气的目的。待培养基冷却后，将平板盒盖小心拿起，卸下固定装置和固定体。取预培养后的混合藻液，离心弃上清，用无氯培养基重悬混匀后均匀平铺于已造模好的筛选区内， 再次盖上平板盒盖，于指定条件下进行培养筛选。待实验完成后，挑选适合的藻落进行后续培养，如需更换培养基，只需解开卡扣，卸下底板和平板盒盖即可。进一步，步骤I)中所述的无氯培养基中各物质的配方浓度为硝酸钠I. 5g/L，七水合硫酸镁0. 075g/L,乙二胺四乙酸二钠0. 001g/L，三水磷酸氢二钾0. 04g/L，磷酸二氢钙 0. 057g/L，碳酸钠0. 02g/L,柠檬酸0. 006g/L,柠檬酸铁铵0. 006g/L, A5溶液lmL/L,所述 A5溶液的配方为硼酸2. 86g/L，氯化锰I. 81g/L，七水合硫酸锌0. 222g/L，五水合硫酸铜 0. 079g/L，二水合钥酸钠0. 39g/L，六水合硝酸钴0. 39g/L。进一步，步骤I)中所述的琼脂糖的用量为0. 1-0. 7g，所述多氯联苯的用量为
6O. 01-0. 35mg。进一步，步骤I)中所述的固体培养基的用量为10_70mL。进一步，步骤2)中所述的预培养的混合藻液为1/2BG11培养基。进一步，步骤2)中所述的混合藻液的浓缩液的细胞密度为2X 106-107Cells/mL ； 所述的离心转速为2500-4500rpm,离心时间为10_30min ;更进一步,优选的所述的混合藻液的浓缩液的细胞密度为5X106cells/mL，离心转速为4000rpm，离心时间为lOmin。进一步，步骤4)中所述的恒温培养条件为温度25°C，湿度70%，光照2000lux， 光暗比I : I。本发明中技术人员应根据实际混合藻液的情况，合理选择混合藻液的预培养方案，如藻密度较大则可直接进行筛选，如藻密度较少，则需进行预培养，本发明优先选择 1/2BG11培养基为预实验培养基,如混合藻液不适合在同一种培养基上培养，还需进行不同培养基的预培养筛选。实施例2本实施例所述底板11半径为90mm ;所述桶体12高为20mm ;所述培养基挡板15 高度为20mm,宽度为5mm ;所述的卡槽16是宽度为Imm,深度为10mm、末端呈60°角的空心三角锥；所述固定装置21的高度为20mm ;所述固定体22是深度为10mm，宽度为1mm、末端呈60°角的实心三角锥；所述的培养基定型模具23为高度和厚度分别为IOmm和7mm的圆环。附图给出了本发明其中一种实施例，即设置了 3块培养基挡板15和相应的4块培养基定型模具23，将筛选区17划分为宽度为15mm的4个隔离区进行后续实验，但本发明的实施方式不限于此。选取3块半径分别为27. 5mm, 47. 5mm和67. 5mm的培养基挡板15,通过卡扣13使它们固定在平板底座I上，形成4个距离为15mm的环形独立筛选区17，装置效果如图2所
/Jn ο先配置无氯BGll培养基200mL(硝酸钠O. 3g，七水合硫酸镁O. 015g,乙二胺四乙酸二钠O. 0002g,三水磷酸氢二钾O. 008g,磷酸二氢钙O. 012g,碳酸钠O. 004g,柠檬酸
O.0012g,柠檬酸铁铵O. 0012g,硼酸O. 572mg,氯化锰O. 362mg,七水合硫酸锌O. 0444mg,五水合硫酸铜O. 0158mg, 二水合钥酸钠O. 078mg,六水合硝酸钴O. 078mg)，再加入琼脂糖2g， 将所得的培养基灭菌后分成4份，待冷却至60°C后，分别加入多氯联苯1254溶液O. Img,
O.2mg,0. 4mg和lmg,由外而内倒入上述独立筛选区17,选择和培养基挡板15配套的培养基定型模具23，将其通过卡扣24固定于平板盒盖2上，再将平板盒盖2通过固定装置21和固定体22和平板底座I相固定，形成密闭的空间，自然冷却造模成型。隔板装置25中安装有隔菌透气的薄膜以达到隔绝细菌，提供氧气的目的。待培养基冷却后，将平板盒盖2小心拿起，卸下固定装置21和固定体22。将5X 106celIs/mL混合藻液于4000rpm离心10分钟,弃上清，用少量液体培养基重悬混匀后均匀平铺于已造模的独立筛选区17内，再次盖上平板盒盖2，置于恒温气候室倒置培养2周，培养条件25±2°C ;湿度70% ;光暗比I : I。经过2周的培养，不同浓度的4个独立筛选区都有不同程度的藻类存活，但加入Img多氯联苯1254筛选区藻类量最少，说明该装置能够实现耐受多氯联苯藻类的筛选。比较有较多藻类存活的3个独立筛选区，我们发现，随着固体培养基中多氯联苯1254浓度的增大，藻类的浓度明显减少，说明随着多氯联苯浓度的增大，能够耐受并降解多氯联苯的藻数量都在减少，这也说明该装置能够实现具有降解多氯联苯功能的固氮蓝藻快速有效的分离筛选的目的。本说明书实施例所述的内容仅仅是对发明构思的实现形式的列举，本发明的保护范围的不应当被视为仅限于实施例所陈述的具体形式，本发明的保护范围也及于本领域技术人员根据本发明构思所能够想到的等同技术手段。
权利要求
1.一种具有多氯联苯降解功能固氮蓝藻的分离筛选方法，其特征在于所述方法包括以下步骤1)配置无氯培养基，加入琼脂糖后灭菌，待冷却至60°C加入多氯联苯，混合均匀后倒入分离筛选装置中相应的筛选区中，冷却固定，作为筛选藻种的固体培养基；2)将采集至野外土壤中经过预培养的混合藻液进行离心分离，弃上清，用无氯培养基重悬细胞，混匀后得到所述混合藻液的浓缩液；3)将步骤2)中得到的混合藻液的浓缩液倒入步骤I)中的固体培养基上；4)将所述分离筛选装置于培养室恒温培养。
2.如权利要求I所述的一种具有多氯联苯降解功能固氮蓝藻的分离筛选方法，其特征在于步骤I)中所述的无氯培养基中各物质的配方浓度为硝酸钠I. 5g/L，七水合硫酸镁0.075g/L，乙二胺四乙酸二钠0. 001g/L，三水磷酸氢二钾0. 04g/L，磷酸二氢钙0. 057g/L, 碳酸钠0. 02g/L，柠檬酸0. 006g/L，柠檬酸铁铵0. 006g/L, A5溶液lmL/L。
3.如权利要求I所述的一种具有多氯联苯降解功能固氮蓝藻的分离筛选方法，其特征在于步骤I)中所述的固体培养基的用量为10-70mL。
4.如权利要求I所述的一种具有多氯联苯降解功能固氮蓝藻的分离筛选方法，其特征在于步骤I)中所述的培养基中琼脂糖含量为0. 1-0. 7g ;所述多氯联苯的用量为0.01-0. 35mg。
5.如权利要求I所述的一种具有多氯联苯降解功能固氮蓝藻的分离筛选方法，其特征在于步骤2)中所述的预培养的混合藻液为1/2BG11培养基。
6.如权利要求I所述的一种具有多氯联苯降解功能固氮蓝藻的分离筛选方法，其特征在于步骤2)中所述的混合藻液的浓缩液的细胞密度为2X 106-107cells/mL。
7.如权利要求I 6之一所述的一种具有多氯联苯降解功能固氮蓝藻的分离筛选方法，其特征在于步骤2)中所述的离心转速为2500-4500rpm，离心时间为10_30min。
8.如权利要求I所述的一种具有多氯联苯降解功能固氮蓝藻的分离筛选方法，其特征在于步骤4)中所述的恒温培养条件为温度25°C，湿度70%，光照20001UX，光暗比
全文摘要
本发明公开了一种具有多氯联苯降解功能固氮蓝藻的分离筛选方法，所述方法包括以下步骤1)配置无氯培养基，加入琼脂糖后灭菌，待冷却至60℃加入多氯联苯，混合均匀后倒入分离筛选装置中相应的筛选区中，冷却固定，作为筛选藻种的固体培养基，将所述固体培养基置于平板上；2)将采集至野外土壤中经过预培养的混合藻液进行离心分离，弃上清，用无氯培养基重悬细胞，混匀后得到所述混合藻液的浓缩液；3)将步骤2)中得到的混合藻液的浓缩液倒入步骤1)中的固体培养基上；4)将所述分离筛选装置于培养室恒温培养。本发明筛选效率高，能在短时间内筛选出大量的目标藻种，筛选成本低，利于实际应用推广。
文档编号C12R1/89GK102586118SQ20121005494
公开日2012年7月18日 申请日期2012年3月5日 优先权日2012年3月5日
发明者张杭君, 胡赐明, 贾秀英, 韩丽, 黄黎明 申请人:杭州师范大学