专利名称：一种诱导人脐血cd34+细胞分化为朗格罕斯细胞的体外培养方法
技术领域：
本发明涉及通过含有粒-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，肿瘤坏死因子α(TNF-α )，干细胞因子(SCF)和FMS样酪氨酸酶3配体(Flt3L)的培养基中培养脐血CD34+细胞，使它们分化朗格罕斯细胞的体外诱导方法，并且由此产生的朗格罕斯细胞具有纯度高、产量大的特点，并具有识别、摄取、加工和处理抗原的能力，启动免疫应答的功能。
背景技术：
干细胞具有在培养基中无限分裂的能力，并且在特异性的分化刺激的刺激下产生构成组织的特化细胞。根据它们的分化潜能，干细胞分为胚胎干细胞(ES细胞)和组织特异性干细胞。ES细胞是在胚泡期从胚胎内细胞团(ICM)分离而来，并且是多潜能的，即它们实际上能够分化为在生物体中发现的全部类型的细胞。相反，组织特异性干细胞在胚胎发育过程中器官形成的阶段出现，并且它们是器官特异性的和多功能的，即它们通常定向产生构成特定器官的细胞。这些组织特异性干细胞在大多数成年人器官中保留并履行不断补充正常或病理性发生的细胞损失的关键任务。代表性的组织特异性干细胞包括在骨髓中存在的造血干细胞和间充质干细胞。造血干细胞产生各种血细胞如红细胞和白细胞；间充质干细胞产生结缔组织细胞，例如成骨细胞，成软骨细胞，脂肪细胞和成肌细胞。几年来，由于人胚胎干细胞的成功分离，干细胞的临床应用已经吸引越来越多的兴趣。干细胞最值得注意的潜在应用是它们作为细胞替代治疗的细胞供应的理想来源。本发明的发明者发现能够使脐血CD34+细胞分化成高纯度及高产量的朗格罕斯细胞的物质，并且发现GM-CSF、TNE- a、SCF和Flt3L联合应用可诱导脐血单核细胞成为具有识别、摄取、加工和处理抗原的能力，启动机体免疫应答的朗格罕斯细胞。目前尚未报道通过在含有GM-CSF、TNE- a、SCF和Flt3L的培养基中培养它们，能够使脐血CD34+细胞分化为高纯度、高产量及具有识别、摄取、加工和处理抗原的能力，启动免疫应答功能的朗格罕斯细胞。具体应用于在制备具有识别、摄取、加工和处理抗原及启动免疫应答功能的生物材料；所制备的生物材料将作为人造皮肤或皮肤移植中的辅助材料。
发明内容
本发明的目的是提供一种使脐血CD34+细胞分化为高纯度、高产量及具有识别、摄取、加工和处理抗原的能力，启动机体免疫应答功能的朗格罕斯细胞的方法。为了实现上述目的本发明采用如下技术方案一种诱导人脐血CD34+细胞分化为朗格罕斯细胞的体外培养方法，其步骤如下
O首先从人的脐血中分离出人脐血单个核细胞，然后对单个核细胞进行磁珠分选，得到⑶34+细胞。
2)在添加粒-巨噬细胞集落刺激因子、肿瘤坏死因子α、干细胞因子和FMS样酪氨酸激酶3配体的RPMI1640培养基中培养所述⑶34+细胞。3)将所述培养基在37°C，5%C02条件下，培养至少6天，每2 3天更换一次培养液，获得朗格罕斯细胞。
上述的朗格罕斯细胞能够在制备具有识别、摄取、加工和处理抗原及启动免疫应答功能的生物材料中的应用。所述生物材料可以为人造皮肤或皮肤移植中的辅助材料
在本发明中，GM-CSF是维持朗格罕斯细胞发育及分化的最根本的细胞因子；TNF-a则抑制培养细胞向巨噬细胞分化，并维持朗格罕斯细胞于未成熟状态，使其具有强的抗原提呈作用；实验证明=GM-CSF和TNF-α联合应用可诱导脐血单个核细胞成为具有未成熟表型的朗格罕斯细胞。如果在相同但缺少GM-CSF和TNF-α情况下，细胞不能分化为朗格罕斯细胞。另外如果只用GM-CSF和TNF-α处理它们，则其增殖受到抑制。SCF和Flt3L加入含有GM-CSF和TNF- α的培养基中，则可见显著地增加朗格罕斯细胞的扩增数量和增大朗格罕斯细胞的集落。该结果提示在培养脐血CD34+细胞以获得朗格罕斯细胞的本发明的方法中，GM-CSF和TNF- α刺激干细胞分化为朗格罕斯细胞，SCF和Flt3L刺激细胞增殖。另夕卜，当只使用所述因子的一种时不能获得充足的朗格罕斯细胞。
图 I 为在含有 200U/mL GM_GSF、50U/mL TNF-α、lU/mL SCF 和 5U/mL Flt3L 的培养基中培养6天的朗格罕斯细胞的贴壁细胞的显微照片(X100)；
图 2 为在含有 200U/mL GM_GSF、50U/mL TNF-α、lU/mL SCF 和 5U/mL Flt3L 的培养基中培养12天的朗格罕斯细胞的贴壁细胞的显微照片(X100)；
图3为4种方案培养6天、12天后的⑶Ia+的细胞百分比；
图4为4种方案培养12天后的HLA-DR+的细胞百分比；
图5为4种方案培养12天后的CD80+的细胞百分比；
图6为4种方案培养12天后的⑶40+的细胞百分比；
图 7 为在含有 200U/mL GM_GSF、50U/mL TNF-α、lU/mL SCF 和 5U/mL Flt3L 的培养基中培养12天的朗格罕斯细胞表型(⑶la)、抗原提呈分子(HLA-DR)和共刺激分子(⑶80、⑶40)的流式细胞检测结果；
图 8 为在含有 200U/mL GM_GSF、50U/mL TNF-α、lU/mL SCF 和 5U/mL Flt3L 的培养基中培养6天的朗格罕斯细胞扫描电镜结果。
具体实施例方式实施例I分离脐血中的⑶34+细胞 I.人脐血单个核细胞的分离
①避光情况下，15mL离心管中加入IOmL人淋巴细胞分离液(密度为1.077)，将51^脐血小心加在淋巴细胞分离液上，并形成清楚的界面。②室温,水平离心400g (2500rmp , r=14. 5 cm) , 25min。③此时可见离心管中形成5层最上面是血浆，血浆层和淋巴细胞分离液之间的白色雾状层是单个核细胞层，淋巴细胞分离液层和最下层红细胞之间的白膜层是粒细胞层。④吸去最上层的血浆，收集血浆层和淋巴细胞分离液交界面的单个核细胞，尽量全部吸出单核细胞到新的15mL离心管中。⑤加入IOmL冰PBS缓冲液洗漆单个核细胞,室温离心200 g (IOOOrmp, r=14. 5cm) , IOmin0弃上清,并尽量去除残留的淋巴细胞分离液。⑥用冰的无血清RPMI1640培养液重悬细胞沉淀，并进行细胞计数后，室温离心 200 g (lOOOrmp, r=14. 5 cm)，IOmin,弃上清,得到单个核细胞沉淀。2.磁珠分选⑶34+细胞
①加100 μ L冰的无血清RPMI1640培养液重悬从脐血中分离出的单个核细胞沉淀，再先加入适量的FCR Blocking Reagent (I X IO7细胞/10 μ L)混匀细胞，再加入CD34MicroBeads (I X IO7 细胞/10 μ L)混匀细胞，置于 4°C，避光，30min。②加入IOmL冰的无血清RPMI1640培养液洗涤细胞，室温避光离心200g, IOmin (lOOOrmp, r=14. 5 cm),弃上清。③加入无血清RPMI1640培养液(500 μ L/108细胞)重悬细胞沉淀(如果细胞量不足IO8则按IO8算)。④将MS分选柱固定于MiniMACS分选架上，调整好位置，以500 μ L无血清湿润分选柱。⑤在分选柱下放一塑料离心管，将细胞悬液加入分选柱内，让其自然流下。⑥收集直接通过分选柱的液体，再连续3次以500 μ L无血清RPMI1640培养液冲洗分选柱，一并收集流过分选柱的液体，此即为CD34-细胞。⑦将分选柱与分选架分开，分选柱下重新放一塑料离心管。⑧吸取500 μ L的无血清RPMI1640培养液于分选柱内，以配套的注射内芯加压冲洗，收集流过的液体，此即为Anti-human⑶34+磁珠标记的细胞(⑶34+细胞)。结果
I.上述人脐血单个核细胞的密度梯度离心分离法密度梯度离心分离法可从每mL人脐血中分离单个核细胞量约为(I. I ±0. 24) X IO6, n=6其中η表示实验的重复次数。2.人脐血单个核细胞中的CD34+细胞磁珠分选法采用CD34+直接磁珠分选法可从人脐血单个核细胞中分离纯化出约占单个核细胞总数I. O I. 5%的⑶34+细胞，即IO4个CD34+细胞/mL脐血。实施例2朗格罕斯细胞的体外诱导及产量 步骤
I.将磁珠分选所得的CD34+细胞行细胞计数，按I X IO4个细胞/cm2接种于24孔板中，以RPMI1640完全培养基加下列四个方案的细胞因子培养，见表I。表中各因子的浓度为各因子在每mL的RPMI1640培养基中的终浓度。表I细胞因子组合体外诱导朗格罕斯细胞的方案
权利要求
1.一种诱导人脐血CD34+细胞分化为朗格罕斯细胞的体外培养方法，其步骤如下O首先从人的脐血中分离出人脐血单个核细胞，然后对单个核细胞进行磁珠分选，得到⑶34+细胞；2)在添加粒-巨噬细胞集落刺激因子、肿瘤坏死因子α、干细胞因子和FMS样酪氨酸激酶3配体的RPMI1640培养基中培养所述⑶34+细胞；3)将所述培养基在37°C，5%C02条件下，培养至少6天，每2 3天更换一次培养液，获得朗格罕斯细胞。
2.根据权利要求I所述一种诱导人脐血CD34+细胞分化为朗格罕斯细胞的体外培养方法，其特征在于所述粒-巨噬细胞集落刺激因子的浓度为200U/mL，肿瘤坏死因子α的浓度为50U/mL，干细胞因子的浓度为lU/mL，FMS样酪氨酸激酶3配体的浓度为5U/mL。
3.权利要求I所述的朗格罕斯细胞在制备具有识别、摄取、加工和处理抗原及启动免疫应答功能的生物材料中的应用。
4.权利要求3所述的生物材料为人造皮肤或皮肤移植中的辅助材料。
全文摘要
一种使脐血CD34+细胞分化为朗格罕斯细胞的体外诱导培养方法，其包括在含有粒-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，肿瘤坏死因子α(TNF-α)，干细胞因子(SCF)和FMS样酪氨酸激酶3配体(Flt3L)的培养基中培养人脐血CD34+细胞，使之分化为朗格罕斯细胞。并且由此产生的朗格罕斯细胞具有纯度高、产量大的特点，并具有识别、摄取、加工和处理抗原的能力，启动免疫应答的功能。
文档编号C12N5/071GK102634483SQ201210064959
公开日2012年8月15日 申请日期2012年1月13日 优先权日2012年1月13日
发明者周灵, 彭代智, 王丽华 申请人:中国人民解放军第三军医大学第一附属医院