专利名称：云南红梨ΔPyTTG1基因及其原核表达载体和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于基因工程领域，具体涉及一种云南红梨色素调控和毛状体发生发育调控蛋白基因Λ PyTTGl及其原核表达载体，以及原核表达载体在制备APyTTGl蛋白和特异性抗体中的应用。
背景技术：
红色表皮是梨分子育种的重要性状指标。云南省因其独特的地理和气候条件而拥有较多的红皮梨种质资源，1986年以来先后已选育出早白蜜、美人酥、满天红和云红梨I号四个栽培品种。但生产中除云红梨I号外，其它3个品种都会因气候变化而导致着色较差甚至不着色，因此需要研究红梨果皮的着色机理。已有研究表明植物花青素的合成是由转录复合物MYB/bHLH/ WD40调控的。前人对MYB和bHLH研究较多，而对植物中的WD40蛋白研究较少。WD40蛋白含WD40基序(约40氨基酸的保守序列，以甘氨酸-组氨酸(GH)开始， 以色氨酸-天冬氨酸(WD)结尾)。WD40蛋白含1-10个串联的WD40基序，一般认为至少4 个以上的WD40基序才能形成高级和有功能的结构。研究表明WD40蛋白是一个结构多样、 功能各异的蛋白家族，通常它们具有两个共同特征一是结构域折叠成β_螺旋桨结构，一是形成多蛋白可逆组装但不具任何催化活性的平台，它们主要是在真核生物的蛋白质-蛋白质复合物形成中起作用。许多研究表明WD40蛋白在蛋白质复合物形成过程中具有支架作用。在植物中，WD40蛋白的作用主要是作为植物特异性发育事件如开花、花发育、分生组织形成、花粉发育和配子形成关键调节因子。WD40蛋白主要通过其WD结构域与其它蛋白互作，参与植物体内众多代谢反应的调控。Morita等人在牵牛花中发现具有隐性基因m (编码Jz7WDRl蛋白)的突变体中，除CHS外，花青素合成途径的结构基因的表达都协同地减少。 Wallker等人首次通过定位克隆和互补试验发现TTGl蛋白调控花青素的合成和毛状体分化。拟南芥TTGl蛋白含4个WD40基序，其(反7突变体的特点是缺乏表皮毛、种皮透明、种子不经休眠就直接萌发、植株完全缺乏花青素、具有异常的根发育模式等突变表型，这表明 TTGl的功能是多效的。棉花GhTTGl和GhTTG3具有拟南芥AtTTGl的类似功能不仅能够恢复拟南芥ttgl突变体形成毛状体和花青素，而且还能互补紫罗兰Ugl突变体在花瓣产生紫色斑点。De等人在矮牵牛中首次发现WD40蛋白PhANlI，其定位于细胞质，能够连接信号转导与转录激活，能够调控PhAN2 (MYB)的功能。玉米中PACl与矮牵牛和拟南芥中花青素调控蛋白ANlI、TTGl极为类似，且35S-PAC1能够互补ttgl突变体。Dressel等人发现WD 基序中单个氨基酸的突变(W158R)就可抑制DFR基因的表达，进而导致白花表型，且MiTTGl 的54. 1%高GC含量是进化的信号。Matus等人在拟南芥中异位表达葡萄WDRl导致拟南芥地上部分和莲座叶中花青素的合成，并通过GFP融合蛋白技术证明WDRl定位于细胞质和细胞核。Zhang等人通过酵母双杂交和植物过表达技术发现EGL3、GL3能够与TTGl (WD40)和 MYB蛋白(GL1，PAP1、PAP2、CPC、TRY)组合，形成MYB/bHLH/WD40复合物进行包括花青素生物合成和毛状体形成的多功能的调控。Brueggemann等人通过互补试验证实了苹果MdTTGl 具有类似拟南芥AtTTGl的功能。Baudry等人通过遗传和分子的方法发现TT2 (MYB)、TT8(bHLH)和TTGl (WDR)能够形成四元复合物直接调控BAN在植物中的表达。Payne等通过酵母双杂交证实了在拟南芥中GL3/GL1/TTG1复合物调控毛状体的发育。Bouyer通过克隆分析、异位表达和微注射试验提出了毛状体形成的捕获-耗尽机制在高浓度的毛状体促进蛋白GL3细胞中，GL3通过结合毛状体形成蛋白TTGl来耗尽临近细胞中的TTGl，从而导致毛状体形成，而周围的细胞因TTGl的减少而不能形成毛状体。而Zhao等人通过离子轰击试验证明了 1761，61^，61^和61^并不在邻近细胞间转移，而1 3-1^8，CPC则可在邻近细胞间转移，提出TTGl复合物直接调节激活子和抑制子，而抑制子的运动影响拟南芥叶上毛状体的类型。TTGl是多功效基因，Gonzalez等人还发现TTGl能够与MYB5和TT2 (MYB)形成复合物控制外种皮的分化。云南红梨果皮花青素的生物合成可能是由MYB/bHLH/WD40调控的。目前云南红梨和苹果中的PyTTGl基因已被克隆和转基因，但是还没有专门用于准确检测PyTTGl蛋白的亚细胞定位、高效的进行PyTTGl蛋白的纯化、高效分离PyTTGl蛋白所结合的蛋白和DNA片段及检测其在转基因植物中的表达情况的抗体。本发明选择着色最好且稳定的‘云红梨I 号’作为试验材料，开展云南红梨‘云红梨I号’PyTTGl转录因子基因的克隆、序列分析和原核表达、蛋白纯化抗体制备的工作，将弥补这方面的空白，也将为研究云南红梨及苹果WD40 转录因子TTGl在云南红梨果皮红色着色机理及其在植物毛状体发生发育机制中作用提供工具。
发明内容
本发明的目的在于提供一种云南红梨APyTTGl基因，该基因是云南红梨色素合成和毛状体发育调控蛋白/yrTGl基因的特异性片段，具有如SEQ ID NO. 3所示核苷酸序列或编码如SEQ ID NO. 4所示氨基酸序列的蛋白质；该基因来源于云南红梨。本发明另一目的是提供云南红梨APyTTGl基因的原核表达载体 pET32a-Z PyTTGl，该载体含有SPyTTGl基因，SPyTTGl基因的上游有T7启动子和细菌核糖体结合位点RBS，T7启动子的下游有可被IPTG诱导的操作子序列，基因的N端和 C端均带有6 XHis标签。本发明另一目的是将原核表达载体应用在制备云南红梨色素合成及毛状体发生发育调控特异性蛋白APyTTGl中。本发明另一目的是将原核表达载体应用在制备PyTTGl特异性抗体中，PyTTGl特异性抗体应用在PyTTGl和MdTTGl蛋白的亚细胞定位检测、PyTTGl蛋白的纯化、PyTTGl蛋白所结合的蛋白和DNA片段的高效分离、检测其在转基因植物中的表达情况、染色质免疫共沉淀(ChIP)中。本发明的上述目的是通过下述的技术方案得以实现的
I、原核表达载体的构建
(I)根据云南红梨Z1TiW基因(GenBank登录号为HQ641374)编码框及苹果、拟南芥、 玉米、紫苏、矮牵牛中/ 域 基因和原核表达载体pET-32a多克隆酶切位点，设计I对特异引物-F :5, -07gCCATGGAGAACTCTACGCAAGAATCG-3/ ,APyTTGl-R 5/ KgCTCGAG GTTCGGCTTTATTGAAAGGGTATCC-3;，在上下游引物的5'端分别加入NcoI和XhoI酶切位点及保护碱基(下划线部分为酶切位点，斜体部分为保护碱基)。以云南红梨总RNA为模板，用M-MLV反转录酶合成cDNA后使用APyTTGl-Y和进行扩增，得到特异性片段；
(2)回收zl/yr/iW全长片段；
(3)使用AfcoI和沿ol对APyTTGl片段和载体pET32a进行双酶切，分别回收、连接，获得原核表达载体pET32a-zl/y/7i 7。2、APyTTGl基因的原核表达
使用热刺激法将pET32a-zl/y/7i 7转入大肠杆菌TfoMiia (DE3)中，在IPTG诱导下筛选最佳表达条件，在最适条件下进行大量表达。3、APyTTGl蛋白的纯化
收集菌体，进行超声破碎，过镍柱进行纯化，收集纯化后的蛋白。4、使用Λ PyTTGl纯化蛋白制备PyTTGl抗体，使用Λ PyTTGl抗体可以检测PyTTGl 蛋白。本发明的重组载体pET32a-」/y/7^7可以表达获得纯化蛋白，制备的抗体可用于检测PyTTGl蛋白，本发明制备的APyTTGl抗体，可以弥补目前没有专门检测PyTTGl和 MdTTGl、分离PyTTGl所结合的蛋白质、PyTTGl蛋白的亚细胞定位的抗体，本发明的成果将为果树及花卉的分子育种奠定基础。
图I为本发明中提取的总RNA电泳示意图。图2为本发明基因扩增后的扩增产物电泳示意图。图3为本发明原核表达载体pET32a_APyTTGl电泳示意图，图中I是对照质粒 pET32a-PyMT ；2 是 pET32a_ ΔPyTTGl。图4为本发明原核表达载体pET32a_APyTTGl在16 °〇和37 °C、IPTG终浓度为
O.5 mM条件诱导下的表达情况示意图,其中I是转化pET-32a空载体Rosetta (DE3)菌体的总蛋白；2是IPTG诱导前原核表达载体的总蛋白；3-5是原核表达载体在16 °C、IPTG终浓度为O. 5 mM条件下诱导2、4、6 h后的表达情况；6_8是原核表达载体在37 °C、IPTG终浓度为O. 5 mM条件下诱导2、4、6 h后的表达情况；9是蛋白质分子量标准SM0431。图5为本发明中APyTTGl蛋白纯化条件的优化电泳示意图，其中I是表达 APyTTGl的Rosetta(DE3)细菌总蛋白；2是挂柱后的流穿液;3_5分别为30,150,500 mM 咪唑洗脱后的结果；6是500 mM洗脱后第二管的结果；7是蛋白分子量标准Marker0431。图6为本发明中APyTTGl蛋白纯化条件的优化电泳示意图，其中I是表达蛋白APyTTGl的Rosetta(DE3)细菌O. 5 mM IPTG诱导16 h的总蛋白；2是IPTG诱导前的 Rosetta(DE3)细菌总蛋白；3是蛋白分子量标准Marker0431 ;4_7是分别为150、200、300和 500 mM咪唑洗脱后的结果。图7为本发明中APyTTGl蛋白的纯化示意图，其中I是10 μ I的O. 1% BSA ;2是蛋白分子量标准Marker0441 ;3_10是APyTTGl蛋白在300 mM咪唑洗脱下的结果。图8为本发明中使用APyTTGl抗体检测35S:: PyTTGl转基因烟草叶片PyTTGl 蛋白表达示意图，其中1，2，3，5和6是转基因株系，5是野生型对照。图9为本发明原核表达载体pET32a_APyTTGl的构建策略示意图。
具体实施例方式下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明保护范围并不局限于所述内容。实施例中使用的试剂主要为分子生物学试验试剂，各种限制性内切酶、Pfu DNA聚合酶、RNA酶抑制剂、dNTP等为大连宝生物工程有限公司产品，反转录酶为Promaga公司的， PCR产物纯化试剂盒、质粒提取试剂盒购自上海生工生物技术有限公司，Rosetta (DE3)菌株和感受态细胞为北京Transgene公司产品，其余试剂均为国产分析纯。His Trap柱子(GE Health)，其它仪器均为分子生物学以及基因工程实验室常用仪器设备。所有引物序列合成和基因测序均在上海生工生物技术公司进行。本发明中所用方法如无特别说明均为常规方法。实施例I :原核表达载体pET32a_zl/y/7i 7的构建
(I)引物设计
根据云南红梨r/i 7基因(GenBank登录号为HQ641374)编码框及苹果、拟南芥、玉米、紫苏、矮牵牛中/ 域 基因和原核表达载体pET-32a多克隆酶切位点，设计I对特异引物 APyTTGl-F 5/ -07gCCATGGAGAACTCTACGCAAGAATCG-3'，APyTTGl-R 5/ KgCTCGAGGTTC GGCTTTATTGAAAGGGTATCC-3'，在上下游引物的5'端分别加入AfcoI和通ol酶切位点及保护碱基(下划线部分为酶切位点，斜体部分为保护碱基)。(2)总RNA的提取
使用异硫氰酸胍法提取红梨果皮的总RNA，电泳检测结果如图I。(3) RT-PCR
以云南红梨总RNA为模板，用M-MLV反转录酶合成cDNA后使用APyTTGl-Y和 APyTTGl-R进行扩增，获得片段。(4)APyTTGl 片段的回收
对PCR产物进行I %琼脂糖凝胶电泳后(见图2)，切下目的片段；使用胶回收试剂盒， 按照试剂盒说明书对目的片段进行回收。(5)原核表达载体的构建
使用AfcoI和通ο I对PCR纯化产物^PyTTGl和载体pET32a按照说明书进行双酶切，分别获得5’端带有AfcoI和3’端带有ZAoI的片段和pET32a载体，跑电泳后分别进行胶回收，按照摩尔比目的基因载体=3:1加样，然后加入连接液I，16 °C连接16 h(见图 3)。将100 μ I感受态大肠杆菌疋coli DH5 α加入6 μ I连接体系中混匀；混合液冰浴30 min, 42 °C热刺激45 s后，冰浴2 min ;加入900 μ I液体培养基S0C，37 °C >200 rpm摇床培养60 min使菌体复苏；培养结束后，常温8000 rpm离心I min收集菌体；在超净台上吸去上清，剩余约O. I ml时,使用移液枪混勻,接入带有Amp抗性的LB固体平板上,用无菌三角棒涂布均匀；37 °C过夜培养；挑取白色菌落，接种于LB液体+ Amp的培养基，37 °C ,180 rpm培养12 h后，提取质粒；进行酶切验证后，再送至上海生工生物工程公司测序进行测序验证插入基因的正确性，最后获得原核表达载体pET32a-zl/yr7i 7。实施例2 :原核表达载体pET32a_zl/yr7i 7的原核表达使用热刺激法将重组质粒pET32a-A/y/Ti 7转化入大肠杆菌TfoMiia (DE3)感受态细胞中，涂布于LB + Amp固体平板上，挑取pET32a-A/y/7i 7的重组菌落于LB + Amp液体培养基中，37 0C >200 rpm摇床培养过夜，按I : 100的比例接种于相同的LB培养基上培养至OD6tltl为O. 6-0. 8，加IPTG至终浓度为O. 5 mM，分别在16。。和37 °C下培养0、2、4、6 h后收集菌液用于分析总蛋白；收集后的菌液4 0C >12 000 rpm离心I min,弃上清液,沉淀用 100 μ I SDS 凝胶加样缓冲液(Tris-HCl 50 mM, pH 6. 8 ；SDS 2 % ；DTT 100 mM ;溴酚蓝 O. I %;甘油10 %)重悬，煮沸5 min后，12 000 rpm离心I min，取20 μ I上清液进行SDS-PAGE 检测；用考马斯亮蓝R-250染色液(O. I %考马斯亮蓝R-250，40 %甲醇，10 %冰乙酸)染色，脱色液(25 %甲醇，6 %冰乙酸)进行脱色后，使用凝胶成像系统进行拍照。结果显示插入有外源片段的重组质粒pET32a-A/y/7i 7经IPTG诱导后，在预期的蛋白分子量约29 kD (包括载体上TRX蛋白)左右有I条蛋白条带，而未诱导的转化重组质粒和pET-32a对照质粒未出现这条蛋白带(见图4)。表明在16 1和37 °C、IPTG终浓度为O. 5 mM下重组质粒 pET32a-A/>TTiW在大肠杆菌Tfo1Seiia (DE3)中诱导表达了 APyTTGl蛋白。因为低温诱导更有利于可溶性蛋白的形成，因此后续试验选用16 °C、IPTG终浓度为0.5 mM下进行诱导表达。实施例3 Δ PyTTGl蛋白的纯化，具体步骤如下
a、菌体破碎将在16°C、0. 5 mM IPTG下大量诱导表达I L后的菌体，经超声破碎菌体 (工作3 s,休息6 s) 5 min ；
b、收集上清和沉淀将菌体破碎液40C >12 000 rpm离心20 min，分别保留上清和沉
淀；
C、蛋白破碎上清液使用O. 22 μ m滤器进行过滤，除去杂质；
d、His-TrapHP柱的预处理使用5倍柱体积纯水洗柱；5倍柱体积结合缓冲液(磷酸钠缓冲液(PH7. 4) 20 mM, NaCl O. 5M，咪唑30 mM)平衡柱子，流速为I ml/min;
e、蛋白样品上柱流速为Iml/min,收集流出液；
f、洗柱使用5倍柱体积结合缓冲液(20mM磷酸钠缓冲液pH7.4，NaCl O. 5M，咪唑30 mM)洗脱；
g、洗脱分别使用5倍柱体积洗脱缓冲液(20mM磷酸钠缓冲液pH7.4，NaCl O. 5M，咪唑30、150、500mM)依次洗脱，收集洗脱液；
h、His-TrapHP柱的后处理5柱体积洗脱缓冲液(20 mM磷酸钠缓冲液ρΗ7· 4，NaCl
0.5 Μ，咪唑500 mM)洗去所有蛋白；5倍柱体积纯水洗柱；5倍柱体积20 %乙醇洗柱；柱子前后封口，于4 °C、20 %的乙醇中保存；
i、SDS-PAGE检测分别取50μ I各咪唑梯度流出液，加入5 μ I的5Χ蛋白上样缓冲液，混匀后，煮沸5 min,4 °C>13 000 rpm离心5 min后，各取20 μ I上样，进行SDS-PAGE 分析。结果如图5，经150 mM咪唑洗脱后，500 mM咪唑获得纯化蛋白。为进一步优化咪唑洗脱浓度，采用150，200，300和500 mM的咪唑梯度洗脱，结果如图6，表明300 mM咪唑是最佳的蛋白洗脱浓度。随后，采用300 mM咪唑进行大量纯化，结果如图7，获得了高纯度蛋白，使用IX磷酸缓冲液(PH7. 4)透析后，将第7泳道纯化的蛋白送云大生物制备兔的多克隆抗体。实施例4 PyTTGl蛋白特异性抗体的Western检测为检测PyTTGl蛋白特异性抗体的有效性，使用Λ PyTTGl蛋白抗体对35S: : PyTTGl转基因烟草进行了检测。具体过程如下
实验中使用的试剂与仪器如下
垂直蛋白电泳仪、PVDF 膜(millipore), Semi-Dry Transfer Cell (BIO-RAD)转膜
系统；
丙烯酰胺、二甲叉丙烯酰胺，10 %APS，TEMED,1X甘氨酸缓冲液，IX磷酸缓冲液， 1*PBT，脱脂奶粉，Whitman 3MM 滤纸等 SDS-PAGE 和 Western 试剂。蛋白样品制备蛋白样品和1/5体积5X蛋白上样缓冲液(Tris-HCl (pH6. 8)250 mM, SDS 10%, BPB 0.5%，甘油 50%，β -巯基乙醇5%)，95°C加热 5 min 后置于冰上 5 min。 常温 13 000 rpm、离心 Imin0I、SDS-PAGE 检测 Cl)配制SDS-PAGE凝胶；
(2)电泳需要恒流浓缩胶30 mA，分离胶40 mA。2、Western 操作
(1)转膜设定电流为2.O mA/cm2,转膜40 min ；
(2)封闭(5%的脱脂牛奶)；
(3)添加一抗(APyTTGl抗体)；
(4)添加二抗(羊抗兔的商业化抗体)；
(5)结果观察
弃二抗，洗涤后，加I ml工作液，浸润整个PVDF膜，使用成像系统Chemidoc XRS(BIO-RAD)进行成像观察，结果如图8，泳道1、2、3、5、6为转基因烟草总蛋白，4为野生型烟草的总蛋白，在转基因烟草中检测到PyTTGl蛋白的表达，而在野生型对照中未检测到 PyTTG蛋白，这表明本发明制备的多克隆抗体专一性强，适合进行PyTTGl蛋白的表达检测、 定位检测等。
权利要求
1.云南红梨SPyTTGl基因，其特征在于..MYTTGl基因具有如SEQID NO. 3所示核苷酸序列或编码如SEQ ID NO. 4所示氨基酸序列的蛋白质。
2.根据权利要求I所述的云南红梨Δ/>77^7基因，其特征在于基因来源于云南红梨。
3.权利要求I所述云南红梨WyTTGl基因的原核表达载体pET32a-』其特征在于该载体含有WyTTGl基因，IsPyTTGl基因的上游有T7启动子和细菌核糖体结合位点 RBS, T7启动子的下游有可被IPTG诱导的操作子序列，/TiW基因的N端和C端均带有6 XHis标签。
4.权利要求3的所述的原核表达载体在制备云南红梨色素合成及毛状体发生发育调控蛋白APyTTGl中的应用。
5.权利要求3的所述的原核表达载体在制备PyTTGl特异性抗体中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种云南红梨色素合成和毛状体发育调控蛋白PyTTG1基因ΔPyTTG1及其原核表达载体，本发明利用RT-PCR从云南红梨中克隆PyTTG1基因特异性片段ΔPyTTG1，并构建其原核表达载体，然后在大肠杆菌中进行表达，获得云南红梨ΔPyTTG1纯化蛋白，云南红梨ΔPyTTG1纯化蛋白应用在制备PyTTG1特异性抗体中、在PyTTG1蛋白表达检测中及免疫沉淀和染色质免疫共沉淀中；本发明中所制备的抗体特异性强，能够准确的检测PyTTG1蛋白的亚细胞定位、高效的进行PyTTG1蛋白的纯化、高效分离PyTTG1蛋白所结合的蛋白和DNA片段及检测其在转基因植物中的表达情况。
文档编号C12N15/29GK102586280SQ20121006499
公开日2012年7月18日 申请日期2012年1月13日 优先权日2012年1月13日
发明者崔道磊, 张晓东, 李昆志, 樊磊, 舒群, 苏俊, 陈丽梅 申请人:昆明理工大学