专利名称：一种检测传统豆酱发酵过程中真菌多样性的方法
技术领域：
本发明涉及一种检测传统豆酱发酵过程中真菌多样性的方法。
背景技术：
豆酱发酵过程中真菌种类繁多，这些真菌对豆酱发酵产生很大影响，可以改变豆酱发酵速度和产品风味，甚至会导致发酵失败。摸清豆酱发酵过程中真菌的多样性，对于实现豆酱工业化生产具有重要意义。但是现有对豆酱发酵过程中真菌种类及数量的研究中， 多以传统分离培养方法，即形态鉴定结果为主，传统的活菌计数方法局限于可培养的微生物，而很多微生物是不可培养的，因此丢失了许多不可培养微生物的信息。另外，传统分离培养方法工作量大，在对微生物菌群进行培养时，主观性比较强，不可避免地会造成菌株的富集或衰减，即人为改变了原始菌群的菌群构成，对研究结果造成的偏差较大。这就给客观认识微生物的存在状况造成了严重地障碍。
发明内容
本发明是要解决传统的检测豆酱发酵过程中真菌多样性的方法工作量大，检测结果不准确的问题，提供一种检测传统豆酱发酵过程中真菌多样性的方法。本发明检测传统豆酱发酵过程中真菌多样性的方法，按以下步骤进行一、称取 IOg豆酱样品，加入到50mL O. lmol/L的磷酸盐缓冲液中用移液器吹打至悬浮，再加入玻璃珠，振荡5min,然后于200r/min离心5min,收集上清液；二、将沉淀用O. lmol/L的磷酸盐缓冲液洗漆，然后于200r/min离心5min,收集上清液,重复此步骤3次；三、合并步骤一和步骤二获得的上清液，于9000r/min离心12min,弃上清,收集沉淀X,将沉淀X用5mL O. ImoI/ L的磷酸盐缓冲液洗涤3次，得洗净的菌体，向洗净的菌体中加入8mL O. lmol/L的磷酸盐缓冲液用移液器吹打至悬浮，振荡均匀，得预处理的样品；四、按照真菌DNAout说明书抽提预处理的样品中的真菌基因组DNA ;五、以真菌基因组DNA为模板进行第一次PCR扩增，将第一次PCR扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，然后采用胶回收试剂盒进行纯化，得产物A ； 六、将产物A稀释100倍，以稀释后的产物A为模板进行第二次PCR扩增，将第二次PCR扩增产物用I %琼脂糖凝胶电泳检测，然后采用胶回收试剂盒进行纯化，得产物B ;七、以产物B 作为上样样品，使用变性梯度凝胶电泳装置进行电泳，凝胶变性梯度范围为40% 70%，电泳电压为130V，电泳时间为6h，即完成检测传统豆酱发酵过程中真菌多样性；其中步骤三中第一次 PCR 扩增所用上游引物 nu-SSU-0817 序列为 5’-TTAGCATGGAATAATRRAATAGGA-3’， 下游引物nu-SSU-1536序列为5 ’ -ATTGCAATGCYCTATCCCCA-3，;步骤四中第二次PCR扩增所用上游引物nu-SSU-0817序列为5’ -TTAGCATGGAATAATRRAATAGGA-3’，下游引物 nu-SSU-1196 序列为 5’ -TCTGGACCTGGTGAGTTTCC-3’。本发明的优点待检测的豆酱样品不仅含有微生物细胞，还含有多种有机物质和无机盐，这些杂质会对DNA后续分析产生巨大影响。因此本发明采用间接法提取豆酱样品中总DNA，即先经过梯度离心、洗涤等步骤去除豆酱样品中的杂质，然后再收集细胞并裂解细胞。这种对样品预处理的方法所提取的总DNA的量具有较好的稳定性。本发明方法可以将不可培养微生物及数量极少的微生物都检测出来，使检测结果更加准确。可以在无需对菌种培养分离的情况下，对成分复杂的发酵样品直接取样进行分析，使试验过程简单便捷。而且该方法的灵敏度高、可重复性和可靠性好，能全面的反应菌群结构多样性。
具体实施例方式本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式
，还包括各具体实施方式
间的任意组合。
具体实施方式
一本实施方式检测传统豆酱发酵过程中真菌多样性的方法，按以下步骤进行一、称取IOg豆酱样品，加入到50mL O. lmol/L的磷酸盐缓冲液中用移液器吹打至悬浮，再加入玻璃珠，振荡5min,然后于200r/min离心5min,收集上清液；二、 将沉淀用O. lmol/L的磷酸盐缓冲液洗漆，然后于200r/min离心5min,收集上清液，重复此步骤3次，三、合并步骤一和步骤二获得的上清液，于9000r/min离心12min,弃上清，收集沉淀X，将沉淀X用5mL O. lmol/L的磷酸盐缓冲液洗涤3次，得洗净的菌体，向洗净的菌体中加入8mL O. lmol/L的磷酸盐缓冲液用移液器吹打至悬浮，振荡均匀，得预处理的样品；四、按照真菌DNAout说明书抽提预处理的样品中的真菌基因组DNA;五、 以真菌基因组DNA为模板进行第一次PCR扩增，将第一次PCR扩增产物用I %琼脂糖凝胶电泳检测，然后采用胶回收试剂盒进行纯化，得产物A ;六、将产物A稀释100倍，以稀释后的产物A为模板进行第二次PCR扩增，将第二次PCR扩增产物用I %琼脂糖凝胶电泳检测，然后采用胶回收试剂盒进行纯化，得产物B;七、以产物B作为上样样品，使用变性梯度凝胶电泳装置进行电泳，凝胶变性梯度范围为40% 70%，电泳电压为130V， 电泳时间为6h，即完成检测传统豆酱发酵过程中真菌多样性；其中步骤三中第一次PCR 扩增所用上游弓I物nu-SSU-0817序列为5 ’ -TTAGCATGGAATAATRRAATAGGA-3 ’，下游引物 nu-SSU-1536序列为5’ -ATTGCAATGCYCTATCCCCA-3’ ；步骤四中第二次PCR扩增所用上游引物 nu-SSU-0817 序列为 5 ’-TTAGCATGGAATAATRRAATAGGA-3 ’，下游引物 nu-SSU-1196 序列为 5’ -TCTGGACCTGGTGAGTTTCC-3’。本实施方式所述O. lmol/L的磷酸盐缓冲液的pH值为7. O。步骤四所述真菌DNAout购买自天泽基因工程有限公司，产品编号为60304-50。本实施方式所用胶回收试剂盒为上海华舜生物工程有限公司的DNA胶回收试剂盒(Gel Extraction Mini Kit)。
具体实施方式
二 本实施方式与具体实施方式
一不同的是步骤三中将沉淀X用 5mL0. lmol/L的磷酸盐缓冲液洗涤的方法具体为向沉淀X中加入5mL 0. lmol/L的磷酸盐缓冲液，然后用移液器吹打至悬浮，于9000r/min离心lOmin。其它与具体实施方式
一相同。
具体实施方式
三本实施方式与具体实施方式
一或二不同的是步骤五中第一次 PCR扩增的反应体系为50 μ L反应体系，由下列成分组成成分用量
真菌基因组DNA5.0μ
I μιηο /μ 引物 nu-SSU-08175.0μ
I μιηο /μ 引物 nu-SSU-15365.0μ
IOx Taq Buffer5.0μ
2.5mM dNTP Mixture4.0 μ
25mM MgCl25.0μ
5υ/μ Taq 酶Ι.Ομ
无菌水20.0μ PCR扩增条件为94°C预变性2min，94°C变性30s，52°C退火30s，72°C延伸45s，共 35个循环，再72 °C延伸7min，4°C保温。其它与具体实施方式
一或二相同。
具体实施方式
四本实施方式与具体实施方式
一至三之一不同的是步骤六中第二次PCR扩增的反应体系为50 μ L反应体系，由下列成分组成
成分用量
稀释后的产物A5.0μ
I μιηο /μ 引物 nu-SSU-08175.0μ
I μιηο /μ 引物 nu-SSU-11965.0μ
IOx Taq Buffer5.0μ
2.5mM dNTP Mixture4.0 μ
25mM MgCl25.0μ
5υ/μ Taq 酶Ι.Ομ
无菌水20.0μ PCR扩增条件为94°C预变性2min，94°C变性30s，50°C退火30s，72°C延伸45s，共 30个循环，再72 °C延伸7min，4°C保温。其它与具体实施方式
一至三之一相同。
具体实施方式
五本实施方式检测传统豆酱发酵过程中真菌多样性的方法，按以下步骤进行一、称取IOg豆酱样品，加入到50mL O. lmol/L的磷酸盐缓冲液中用移液器吹打至悬浮，再加入玻璃珠，振荡5min,然后于200r/min离心5min,收集上清液；二、 将沉淀用O. lmol/L的磷酸盐缓冲液洗漆,然后于200r/min离心5min,收集上清液,重复此步骤3次；三、合并步骤一和步骤二获得的上清液，于9000r/min离心12min,弃上清， 收集沉淀X，将沉淀X用5mL O. lmol/L的磷酸盐缓冲液洗涤3次，得洗净的菌体，向洗净的菌体中加入8mL 0. lmol/L的磷酸盐缓冲液用移液器吹打至悬浮，振荡均匀，得预处理的样品；四、按照真菌DNAout说明书抽提预处理的样品中的真菌基因组DNA;五、以真菌基因组DNA为模板进行第一次PCR扩增，将第一次PCR扩增产物用I %琼脂糖凝胶电泳检测，然后采用胶回收试剂盒进行纯化，得产物A ;六、将产物A稀释100倍，以稀释后的产物A为模板进行第二次PCR扩增，将第二次PCR扩增产物用I %琼脂糖凝胶电泳检测，然后采用胶回收试剂盒进行纯化，得产物B ;七、以产物B作为上样样品，使用变性梯度凝胶电泳装置(美国CBS公司生产的2401DGGE电泳装置)进行电泳，先清洗玻璃板， 自然风干后，在安装好胶外套垫圈的DGGE电泳装置中用GM-40梯度灌胶器进行制胶，丙烯酰胺浓度为8. 0% (体积)，并根据实验需要插入16孔的梳子，将胶置于45°C烘箱中聚合40min，在DGGE电泳装置中倒入IXTAE电泳缓冲液，拔出梳子，固定胶板后，将胶板盒浸入预热至60°C的电泳缓冲液箱里，将循环的流通管与电泳槽连接好，用电泳缓冲液冲洗上样孔，并加满电泳槽的上槽，打开热循环搅拌器进行Buffer循环，50V恒压预电泳约30min，凝胶变性梯度范围为40% 70%，电泳电压为130V，电泳时间为6h，银染检测，扫描照相，即完成检测传统豆酱发酵过程中真菌多样性；其中步骤三中第一次PCR 扩增所用上游弓I物nu-SSU-0817序列为5 ’ -TTAGCATGGAATAATRRAATAGGA-3 ’，下游引物 nu-SSU-1536序列为5’ -ATTGCAATGCYCTATCCCCA-3’ ；步骤四中第二次PCR扩增所用上游引物 nu-SSU-0817 序列为 5 ’-TTAGCATGGAATAATRRAATAGGA-3 ’，下游引物 nu-SSU-1196 序列为 5’ -TCTGGACCTGGTGAGTTTCC-3’。步骤三中将沉淀X用5mL O. lmol/L的磷酸盐缓冲液洗涤的方法具体为向沉淀 X中加入5mL O. lmol/L的磷酸盐缓冲液，然后用移液器吹打至悬浮，于9000r/min离心 IOmin0步骤五中第一次PCR扩增的反应体系为50 μ L反应体系，由下列成分组成
成分用量
真菌基因组DNA5.0μ
I μιηο /μ 引物 nu-SSU-08175.0μ
Iμιηο /μ 引物 nu-SSU-15365.0μ
IOx Taq Buffer5.0μ
2.5 mM dNTP Mixture4.0 μ
25mM MgCl25.0μ
5υ/μ Taq 酶Ι.Ομ
无菌水20.0μ PCR扩增条件为94°C预变性2min，94°C变性30s，52°C退火30s，72°C延伸45s，共 35个循环，再72 °C延伸7min，4°C保温。步骤六中第二次PCR扩增的反应体系为50 μ L反应体系，由下列成分组成成分用量
稀释后的产物A5.0|iL
1 (j_mol/[xL 引物 nu-SSU-08175.0|iL
l(j_mol/[jL 引物 nu-SSU-11965.0|iL
10x Taq Buffer5.0|iL
2.5mM dNTP Mixture4.0|iL
25mM MgCl25.0|iL
5U/[xL Taq 酶1.0|iL
无菌水20.0|iLPCR扩增条件为94°C预变性2min，94°C变性30s，50°C退火30s，72°C延伸45s，共 30个循环，再72 °C延伸7min，4°C保温。本实施方式所述0. lmol/L的磷酸盐缓冲液的pH值为7. 0。步骤四所述真菌DNAout购买自天泽基因工程有限公司，产品编号为60304-50。本实施方式所用胶回收试剂盒为上海华舜生物工程有限公司的DNA胶回收试剂 盒(Gel Extraction Mini Kit)。本实施方式获得的DGGE (变性梯度凝胶电泳)图谱条带清晰，无堆积现象，分离效 果较好。本实施方式所采用的传统发酵豆酱样品采集于齐齐哈尔市拜泉县，在豆酱发酵阶 段，采用本实施方式的方法可检测到9种真菌,包括扩张青霉(Penicillium expansum)、米 曲霉(Aspergillus oryzae)、大毛霉(Phycomycetes)、普通青霉(Penicillium commune) > 犁头霉(Absidia)、总状毛霉(Mucor racemosus)、雅致放射毛霉(Actinomucor elegans)、 曲霉(Aspergillus)和一种不可培养的真菌，且多组平行实验结果相同。同样的传统发 酵豆酱样品采用传统分离培养方法只分离出来4种真菌,米曲霉(Aspergillus oryzae)、 大毛霉(Phycomycetes)、普通青霉(Penicillium commune)和扩张青霉(Penicillium expansum)，实验结果说明本实施方式的方法灵敏度更高，检测结果更加准确，可以检测出 不可培养微生物或数量极少的微生物，能更全面的反应菌群结构多样性。
权利要求
1.一种检测传统豆酱发酵过程中真菌多样性的方法，其特征在于检测传统豆酱发酵过程中真菌多样性的方法，按以下步骤进行一、称取IOg豆酱样品，加入到50mL O. Imol/ L的磷酸盐缓冲液中用移液器吹打至悬浮，再加入玻璃珠，振荡5min，然后于200r/min离心5min,收集上清液；二、将沉淀用O. lmol/L的磷酸盐缓冲液洗漆，然后于200r/min离心5min，收集上清液，重复此步骤3次；三、合并步骤一和步骤二获得的上清液，于9000r/ min离心12min,弃上清,收集沉淀X,将沉淀X用5mL O. lmol/L的磷酸盐缓冲液洗漆3次， 得洗净的菌体，向洗净的菌体中加入8mL O. lmol/L的磷酸盐缓冲液用移液器吹打至悬浮， 振荡均匀，得预处理的样品；四、按照真菌DNAout说明书抽提预处理的样品中的真菌基因组DNA ;五、以真菌基因组DNA为模板进行第一次PCR扩增，将第一次PCR扩增产物用I % 琼脂糖凝胶电泳检测，然后采用胶回收试剂盒进行纯化，得产物A ;六、将产物A稀释100 倍，以稀释后的产物A为模板进行第二次PCR扩增，将第二次PCR扩增产物用I %琼脂糖凝胶电泳检测，然后采用胶回收试剂盒进行纯化，得产物B ;七、以产物B作为上样样品，使用变性梯度凝胶电泳装置进行电泳，凝胶变性梯度范围为40% 70%，电泳电压为130V， 电泳时间为6h，即完成检测传统豆酱发酵过程中真菌多样性；其中步骤三中第一次PCR 扩增所用上游弓I物nu-SSU-0817序列为5 ’ -TTAGCATGGAATAATRRAATAGGA-3 ’，下游引物 nu-SSU-1536序列为5’ -ATTGCAATGCYCTATCCCCA-3’ ；步骤四中第二次PCR扩增所用上游引物 nu-SSU-0817 序列为 5 ’-TTAGCATGGAATAATRRAATAGGA-3 ’，下游引物 nu-SSU-1196 序列为 5’ -TCTGGACCTGGTGAGTTTCC-3’。
2.根据权利要求I所述的一种检测传统豆酱发酵过程中真菌多样性的方法，其特征在于步骤三中将沉淀X用5mL O. lmol/L的磷酸盐缓冲液洗涤的方法具体为向沉淀X中加入 5mL 0. lmol/L的磷酸盐缓冲液,然后用移液器吹打至悬浮,于9000r/min离心lOmin。
3.根据权利要求I所述的一种检测传统豆酱发酵过程中真菌多样性的方法，其特征在于步骤五中第一次PCR扩增的反应体系为50 μ L反应体系，由下列成分组成成分用量真菌基因组DNA5.0μ Iμιηο /μ 引物 nu-SSU-08175.0μ Iμιηο /μ 引物 nu-SSU-15365.0μ IOx K/g Buffer5.OpL2.5mM dNTP Mixture4.0μ 25mM MgCl25.0μ 5υ/μ Taq 酶Ι.Ομ 无菌水20.0μ PCR扩增条件为94°C预变性2min，94°C变性30s，52°C退火30s，72°C延伸45s，共35个循环，再72*€延伸保温。
4.根据权利要求I所述的一种检测传统豆酱发酵过程中真菌多样性的方法，其特征在于步骤六中第二次PCR扩增的反应体系为50 μ L反应体系，由下列成分组成成分用量稀释后的产物A5.0μ I μιηο /μ 引物 nu-SSU-08175.0μ I μιηο /μ 引物 nu-SSU-11965.0μ 10χ K/g Buffer5.OpL.2.5mM dNTP Mixture4.0μ .25mM MgCl25.0μ .5υ/μ Taq 酶Ι.Ομ 无菌水20.0μ PCR扩增条件为94°C预变性2min，94°C变性30s，50°C退火30s，72°C延伸45s，共30个循环，再72*€延伸保温。
全文摘要
一种检测传统豆酱发酵过程中真菌多样性的方法，涉及一种检测传统豆酱发酵过程中真菌多样性的方法。是要解决传统的检测豆酱发酵过程中真菌多样性的方法工作量大，检测结果不准确的问题。方法称取豆酱样品，加入到磷酸盐缓冲液中悬浮，再加入玻璃珠振荡，离心，收集上清液；将沉淀洗涤，离心，收集上清液；离心弃上清，将沉淀用洗涤，得菌体，向菌体中加磷酸盐缓冲液吹打至悬浮，振荡，得预处理的样品；抽提预处理的样品中的真菌基因组DNA；PCR扩增得产物A；将产物A稀释，PCR扩增得产物B；以产物B作为上样样品，使用变性梯度凝胶电泳装置进行电泳，即完成。本发明方法简单、灵敏度高、可重复性和可靠性好，全面反应菌群结构多样性。
文档编号C12Q1/68GK102586453SQ20121006553
公开日2012年7月18日 申请日期2012年1月13日 优先权日2012年1月13日
发明者凌宏志, 宋刚, 柴洋洋, 葛菁萍, 赵丹, 陈丽, 高冬妮 申请人:黑龙江大学