专利名称：一种分离培养肝脏原代细胞的方法
技术领域：
本发明涉及细胞领域，具体地，涉及ー种分离培养肝脏原代细胞的方法。
背景技术：
原代细胞作为ー种体外模型，在基因功能研究方面有其突出的优点可同时获得大量性状较均一的样本；与生物体内情况基本保持一致，可以在接近生理状态的情况下研究基因的表达；排除许多复杂因素干扰，如神经、激素的干扰；原代肝细胞具有较好的体 外实验重现性，基本維持了肝脏的代谢功能，特别是很好的保留了与体内一致的细胞色素P450酶(cytochrome P450)的水平，基本保留肝脏原有的代谢功能和细胞分化状态。肝细胞Ofepatocytes)是肝脏最主要的实质细胞类型，生理状况下占60 %，属于高度分化的多功能、实质性脏器细胞。肝细胞既能高度分化，又能很快进入细胞周期而增殖，在体外培养体系中，根据研究目的的不同，既有支持其増殖的培养体系，也有支持其分化的培养体系。肝细胞离体后，在不适宜的环境中很快出现肝细胞衰老和失功能，PH值不适合、无激素支持导致细胞死亡，基因的激活造成细胞凋亡等。原代肝细胞在一般培养条件下，几小时内便丧失其缝隙连接，几天内丧失其组织特异性代谢活动。现有技术中常用的肝细胞分离方法是灌流法，传统灌流法操作环节多，时间长，肝细胞容易损伤，活力低、效率低，纯度不高。因此，迫切需要制备体外培养活力旺盛、功能良好的猪肝脏原代细胞以满足细胞生物学、组织培养技术等研究的要求。
发明内容
本发明的目的在于提供一种分离培养肝脏原代细胞的方法，以克服上述现有技术中存在的缺陷。本发明提供的分离培养肝脏原代细胞的方法，包含以下步骤(I)从肝脏的肝门静脉输入灌流液；所述的灌流液，其IL配方为NaCl 8-9. 4g，KCl O. 2-0. 4，HEPES 2. 4-4. 8g,双蒸水定容至 1L, pH 值 7. 2-7. 4 ；(2)输入胶原酶灌流溶液，肝组织呈龟背状裂开后，停止灌流；(3)将消化成熟的肝脏浸泡于胶原酶溶液中；(4)加清洗液终止消化，过滤，收集肝细胞悬液；(5)离心，弃上清，用完全培养基重悬培养。所述步骤I)的肝脏为新鲜采集的离体肝脏，或新鲜离体肝脏经肝门静脉以80-100ml/min速度注射3倍以上肝体积的0_4°C预冷UW液，肝温降至10°C以下，保持1_4°C离体3h之内的肝脏。当肝温降至10°C以下后，可将肝脏置于冰盒或其他能够保持1_4°C的容器中保存肝脏不超过3h。本发明方法采用蠕动泵进行灌流，用无菌PBS排空蠕动泵管道内气泡。其中所述步骤(I)是以恒温37で灌流液开放灌流10-15min,流速50-60ml/min。其中所述步骤(2)胶原酶灌流溶液灌流流速50-60ml/min。
其中所述步骤(2)的胶原酶灌流液，其IL配方为NaCl 8-9. 4g，KCl 0. 2-0. 4g，HEPES 2. 4-4. 8g，Na2HPO4O. 5-0. 6g，CaCl2O. 10-0. 15g，II 型或 IV 型胶原酶 0. 5g，双蒸水定容至1L。其中所述步骤⑶浸泡时间为5-10min。其中所述步骤(4)清洗液配方为NaCl 8-9. 4g，KCl 0. 2-0. 4g，HEPES 2. 4-4. 8g，Na2HPO4O. 5-0. 6g, CaCl2O. 10-0. 15g，双蒸水定容至 IL0其中所述步骤(4)过滤是将肝脏细胞悬液通过两层纱布和两层细胞筛，纱布和细胞筛均用清洗液浸润，所述细胞筛上层100目，下层200目。本发明分离培养肝脏原代细胞所用几种溶液的配方见表I。表I灌流液，胶原酶灌流液，清洗液配方表
权利要求
1.一种分离培养肝脏原代细胞的方法，包含以下步骤 1)从离体肝脏的肝门静脉输入灌流液，所述的灌流液，其IL配方为NaCl8-9. 4g,KCl0.2-0. 4，HEPES 2. 4-4. 8g，双蒸水定容至 1L，pH 值 7. 2-7. 4 ； 2)输入胶原酶灌流液，肝组织呈龟背状裂开后，停止灌流； 3)将消化成熟的肝脏浸泡于胶原酶灌流液中； 4)加清洗液终止消化,过滤,收集肝细胞悬液； 5)离心，弃上清，用完全培养基重悬培养。
2.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述步骤I)的肝脏为新鲜采集的离体肝脏；或新鲜离体肝脏经肝门静脉以80-100ml/min速度注射3倍以上肝体积的0-4°C预冷UW液，肝温降至10°C以下，保持1_4°C离体3h之内的肝脏。
3.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述步骤I)是以恒温37°C灌流液开放灌流10-15min,流速 50-60ml/mino
4.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述步骤2)胶原酶灌流液灌流流速50_60ml/mino
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤2)的胶原酶灌流液，其IL配方为NaCl 8-9. 4g，KCl 0. 2-0. 4g, HEPES 2. 4-4. 8g, Na2HPO4O. 5-0. 6g, CaCl2O. 10-0. 15g, II 型或IV型胶原酶0. 5g，双蒸水定容至1L。
6.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述步骤3)浸泡时间为5-10min。
7.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述步骤4)清洗液配方为NaCl8-9. 4g，KCl 0. 2-0. 4g, HEPES 2. 4-4. 8g, Na2HPO4O. 5-0. 6g, CaCl2O. 10-0. 15g，双蒸水定容至 1L。
8.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述步骤4)过滤是将肝脏细胞悬液通过两层纱布和两层细胞筛，纱布和细胞筛均用清洗液浸润，所述细胞筛上层100目，下层200目。
9.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述步骤5)离心是将肝细胞滤液分别加入离心管中，400rpm,3min,弃上清,按与沉淀的体积比5_8 I加入权利要求7所述的清洗液，再次离心500rpm, 3min,弃上清。
10.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述步骤5)中完全培养基其配方为含20% FBS的DMEM培养基添加终浓度为200-600U/ml青霉素，20-60 u g/ml链霉素，1% -2%二甲基亚砜，l-10mg/L胰岛素，l-10mmol/L尼克酰胺,0. 1-lmmol/L抗坏血酸，用IM的NaHCO3 调节 pH 至 I. 2-7. 4。
全文摘要
本发明提供一种分离培养肝脏原代细胞的方法，包括以下步骤1)从肝脏的肝门静脉输入灌流液；2)输入胶原酶灌流液；3)将消化成熟的肝脏浸泡于胶原酶灌流液中；4)加清洗液终止消化，过滤，收集肝细胞悬液；5)离心，弃上清，用完全培养基重悬，培养。本发明方法操作简单，成本低，稳定高效，肝细胞得率高，活力高，易贴壁。此法可在实验室推广，成为科学研究的常规方法。
文档编号C12N5/071GK102634480SQ20121008369
公开日2012年8月15日 申请日期2012年3月27日 优先权日2012年3月27日
发明者方美英, 白莹, 董新星, 陈刚, 陈洁 申请人:中国农业大学