专利名称：一种提高藏红花细胞合成藏红花色素的方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，特别涉及ー种提高藏红花细胞合成藏红花色素的方法。
背景技术：
藏红花(Crocus sativus L.)又名西红花、番红花、是鳶尾科番红花属球根类多年生草本植物，原产欧洲南部和伊朗，经印度传入西藏，故称为藏红花。藏红花作为ー种珍贵调味剂、香料和染料在欧洲已有几百年的悠久历史。藏红花还具有较高的药用价值，是ー种名贵的药材。作为药用国外最早记载于公元1550年左右《埃伯斯纸草书》之中，具有活血化瘀、散郁开结等奇特功效。作为传统中药在我国沿用己久，《本草纲目》中以番红花为其正名。我国传统中医认为藏红花具有活血化瘀、解郁安神、凉血解毒等功效，用于经闭、产后瘀阻、跌打损伤、伤寒、咳血吐血、温毒发斑、忧郁痞闷、惊悸发狂等症。现代药理学研究表明，藏红花柱头提取物及其提纯组分藏红花素(crocin)、藏红花苦素(picrocrocin)、藏红花酸(crocetin)等在抗肿瘤、调节免疫、治疗预防心脑血管疾病、抗抑郁症以及抗氧化等方面具有明确的药理效应。尤其在抗肿瘤方面功效显著，特别对对白血病、卵巣癌、结肠癌、乳头肉瘤、扁平细胞瘤和软组织肉瘤都具有较强的抑制作用，其毒副作用明显低于现常用抗肿瘤药物。藏红花原产于西班牙、希腊等南欧各国以及伊朗等地。由于其对生长环境要求较高，在我国仅西藏、新疆、浙江、江西、江苏、北京、上海有少量栽培。另外，传统方式栽培的藏红花品质參差不齐、产量和质量较低。因此，藏红花资源极其有限。我国主要是靠进口供药用，严重制约其在医药エ业中的应用。植物组织和细胞培养技术在药用植物生产上已得到广泛的应用，为名贵药和有价值的药用资源的生产提供了新的途径。已有大規模成功培养紫草、人參和青蒿等细胞生产紫草色素、人參皂甙和青蒿素等报道。利用植物细胞培养技术大規模生产藏红花素等活性物质是解决藏红花资源的有效方法之一。国内研究者先后开展了藏红花细胞培养生产藏红花素的研究工作，但存在的主要问题是产物产量低。如何提高藏红花细胞培养物中藏红花色素的含量是藏红花细胞培养技术产业化应用的关键。研究发现，诱导子处理能提高植物组织培养物中有用次生代谢产物的含量。诱导子是能够刺激植物细胞合成防御性次生代谢产物的物质，它可以通过改变次生代谢途径中催化酶的酶活力，引起次生代谢途径中代谢通量和反应速率的改变，从而提高次生代谢产物的产量，为植物细胞次生代谢的合成调控提供了新手段，引起了人们的广泛关注。利用诱导子来提高次生代谢产物，是目前在药用植物细胞培养中常用的方法，最常用的诱导子有真菌细胞壁水解物、壳聚糖、茉莉酸甲酷、金属尚子等。壳寡糖(也称壳聚寡糖、几丁寡糖，学名β-1，4-寡糖-葡萄糖胺)是由2 10个氨基葡萄糖分子通过β_1，4-糖苷键连接而成的碱性寡糖，由几丁质脱こ酰基后酸解或酶解得到。研究表明，壳寡糖作为ー种外源激发子，可激活植物的防御反应，通过抑制病菌入侵、诱导产生植保素、激活相关防御基因表达等途径提高植物的整体抗性。壳寡糖作为诱导子促进植物次生代谢产物积累的作用也备受关注。50和200ppm壳寡糖能显著提高希腊牛至(Origanum vulgare ssp. hirtum)多酌·含量(Heng Y 等，J. Agric. Food Chem. ,2012,60，136-143)。50-75mg/L壳寡糖具有诱导甘蔗叶积累多酚的作用(周桂等，南方农业科学，2011，42 (8)，874-877)。壳寡糖也能明显提高4°C保藏条件下樱桃中花青素含量(Garry K等，European Food Research and Technology, 233 (2), 351-358)。米用拌种结合叶喷方法用低聚壳寡糖处理丹參种子和叶片，低聚壳寡糖能较显著地促进丹參酮IIA含量的提高(张元等，安徽农业科学，2010，38 (34)，19316-19318)
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供ー种提高藏红花细胞合成藏红花色素的方法，该方法主要基于培养的藏红花细胞色素产量低的问题，提出利用壳寡糖作为新型诱导子，应用到藏红花细胞培养系统中以提高藏红花细胞合成藏红花色素能力。为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下ー种提高藏红花细胞合成藏红花色素的方法，它包括如下步骤(I)将藏红花愈伤组织接种到含有0. 5mg/L细胞分裂素、2mg/L细胞生长素和30g/L蔗糖的植物细胞培养基上，于20± 1°C培养25 30天；(2)将步骤⑴培养后的愈伤组织培养于含有60mg/L或20mg/L寡糖的植物细胞培养基中，所述的植物细胞培养基中添加0. 5mg/L细胞分裂素、2mg/L细胞生长素和20g/L蔗糖，于20±1°C培养26天。步骤(I)中，所述的藏红花愈伤组织为藏红花球茎或芽以常规方法处理诱导形成的愈伤组织。步骤(I)和步骤(2)中，所述的细胞分裂素为6-苄氨基嘌呤(以下简称6-BA)。步骤⑴中，所述的细胞生长素为萘こ酸(以下简称NAA)。步骤(I)中，所述植物细胞培养基为MS培养基。MS培养基为高盐培养基，含有高浓度的硝酸盐、钾离子和铵离子，微量元素种类较多，其配方可參见Murashige T，Skoog,FA. 1962，Physiol. Plant 15 :473_479。步骤⑵中，所述的细胞生长素为吲哚こ酸(以下简称IAA)。步骤(2)中，所述的寡糖为壳寡糖，分子量3000Da。步骤(2)中，所述的植物细胞培养基为1/2B5培养基(其中磷酸ニ氢钠、硝酸钾、硫酸铵、硫酸镁用量减半)。B5培养基配方可參见Gamborg OL7Miller RA7Ojima K. 1968，Exp.Cell Res. 50 :151-158。步骤(2)中，寡糖加入植物细胞培养基中的时机选择在步骤(2)的细胞培养之前或在步骤(2)的细胞培养之后15天以内。有益效果本发明的方法能够明显促进藏红花细胞合成藏红花色素的能力，达到提高藏红花色素产量的目的，而且生产的藏红花色素稳定，不易褐化。
具体实施例方式根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。实施例I : 选健康藏红花球茎，剥去球茎皮膜，将球茎洗净后于流水下冲洗过夜。用75% (v/V)こ醇浸泡lmin,再用O. I %升萊溶液消毒15min,之后用无菌水漂洗4次。用灭菌滤纸吸干球茎表面水分后切成O. 5 Icm3的小块。接种于含有2.0mg/L 2，4-D和O. 5mg/L 6-BA的MS培养基上，于20± 1°C下培养35天左右可获得藏红花球茎愈伤组织。将得到的藏红花球茎愈伤组织接种到MS培养基上，其中附加O. 5mg/L 6_BA、2mg/LNAA、30g/L蔗糖和6g/L琼脂，于20± I°C黑暗条件下培养，每25 30天继代一次。将继代培养26 28天的藏红花球茎愈伤组织接种到含有60mg/L壳寡糖的1/2B5培养基中，其中附加O. 5mg/L 6-BA、2mg/L IAA和20g/L蔗糖，于20± 1°C黑暗条件下振荡培养26天，转速130r/min。利用分光光度法测量藏红花色素的含量，其含量为22. 04mg/gdCW。在相同条件下，1/2B5培养基中不加壳寡糖为对照，藏红花色素的含量为12. 19mg/gdcw0可以看出，使用本发明方法培养的藏红花细胞，其藏红花色素的含量比对照提闻了 80. 8 。实施例2 将实施实例I中继代培养26 28天的藏红花球茎愈伤组织接种到1/2B5培养基中，其中附加O. 5mg/L 6-BA、2mg/L IAA和20g/L蔗糖，于20± 1°C黑暗条件下振荡培养，转速130r/min。在培养第4天时加入壳寡糖,终浓度为60mg/L,继续培养至26天，藏红花色素的含量比对照提闻了 121.3%。实施例3 将实施实例I中继代培养26 28天的藏红花球茎愈伤组织接种到1/2B5培养基中，其中附加0.5mg/L 6-BA、2mg/L IAA和20g/L蔗糖，于20± 1°C黑暗条件下振荡培养，转速130r/min。在培养第14天时加入壳寡糖,终浓度为60mg/L,继续培养至26天，藏红花色素的含量比对照提闻了 85.7%。实施例4 球茎按实施实例I方法消毒后切下芽点，置于不含激素的MS培养基上，萌发长出无菌芽，直接以无菌芽作为诱导愈伤组织诱导外植体材料，将其切成约O. 5 Icm的小段，接种于含有2. Omg/L 2，4-D和O. 25mg/L 6-BA的MS培养基上，于20± I°C培养获得藏红花芽愈伤组织。将得到的藏红花芽愈伤组织分别接种到MS培养基上，其中附加O. 5mg/L 6-BA,2mg/L NAA和30g/L蔗糖，于20± I°C黑暗条件下培养，每25 30天继代一次。将继代培养26 28天的藏红花芽愈伤组织接种到含有20mg/L壳寡糖的1/2B5培养基中，其中附加O. 5mg/L 6-BA、2mg/L IAA和20g/L蔗糖，于20± 1°C黑暗条件下振荡培养26天，转速130r/min。藏红花色素的含量为17. 78mg/g dew。在相同条件下，1/2B5培养基中不加壳寡糖为对照，其藏红花色素的含量为14. 61mg/g dew。使用本发明方法培养的藏红花细胞，其藏红花色素的含量比对照提高了 21. 7%。实施例5
将实施实例4中继代培养26 28天的藏红花芽愈伤组织接种到1/2B5培养基中，其中附加O. 5mg/L BA、2mg/L IAA和20g/L蔗糖，于20± 1°C黑暗条件下振荡培养，转速130r/min。在培养第4天时加入壳寡糖,终浓度为20mg/L,继续培养至26天，藏红花色素的含量比对照提高了 51.3%。
权利要求
1.ー种提高藏红花细胞合成藏红花色素的方法，其特征在于，它包括如下步骤 (1)将藏红花愈伤组织接种到含有O.5mg/L细胞分裂素、2mg/L细胞生长素和30g/L蔗糖的植物细胞培养基上，于20±1°C培养25 30天； (2)将步骤(I)培养后的愈伤组织培养于含有60mg/L或20mg/L寡糖的植物细胞培养基中，所述的植物细胞培养基中添加O. 5mg/L细胞分裂素、2mg/L细胞生长素和20g/L蔗糖，于20±1°C培养26天。
2.根据权利要求I所述的提高藏红花细胞合成藏红花色素的方法，其特征在于，步骤(I)中，所述的藏红花愈伤组织为藏红花球茎或芽以常规方法处理诱导形成的愈伤组织。
3.根据权利要求I所述的提高藏红花细胞合成藏红花色素的方法，其特征在于，步骤(I)和步骤(2)中，所述的细胞分裂素为6-苄氨基嘌呤。
4.根据权利要求I所述的提高藏红花细胞合成藏红花色素的方法，其特征在于，步骤(I)中，所述的细胞生长素为萘こ酸。
5.根据权利要求I所述的提高藏红花细胞合成藏红花色素的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述植物细胞培养基为MS培养基。
6.根据权利要求I所述的提高藏红花细胞合成藏红花色素的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的细胞生长素为吲哚こ酸。
7.根据权利要求I所述的提高藏红花细胞合成藏红花色素的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的寡糖为壳寡糖。
8.根据权利要求I所述的提高藏红花细胞合成藏红花色素的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的植物细胞培养基为1/2B5培养基。
9.根据权利要求I所述的提高藏红花细胞合成藏红花色素的方法，其特征在于，步骤(2)中，寡糖加入植物细胞培养基中的时机选择在步骤(2)的细胞培养之前或在步骤(2)的细胞培养之后15天以内。
全文摘要
本发明公开了一种提高藏红花细胞合成藏红花色素的方法，它包括如下步骤(1)将藏红花愈伤组织接种到含有0.5mg/L细胞分裂素和2mg/L细胞生长素的植物细胞培养基上，于20±1℃培养25～30天；(2)将步骤(1)培养后的愈伤组织培养于含有60mg/L或20mg/L寡糖的植物细胞培养基中，所述的植物细胞培养基中添加0.5mg/L细胞分裂素和2mg/L细胞生长素，于20±1℃培养26天。本发明方法能显著提高藏红花细胞合成能力，藏红花色素含量显著提高，得到的藏红花色素稳定、不易褐化。
文档编号C12N5/04GK102618484SQ201210086288
公开日2012年8月1日 申请日期2012年3月28日 优先权日2012年3月28日
发明者吴频梅, 孙镇, 袁丽红 申请人:南京工业大学