嗜酸性喜温硫杆菌的基因无痕敲除和整合方法

专利名称：嗜酸性喜温硫杆菌的基因无痕敲除和整合方法
技术领域：
本发明涉及一种嗜酸性喜温硫杆菌的基因无痕敲除和整合方法，尤其涉及一种无痕敲除嗜酸性喜温硫杆菌染色体基因或将外源基因插入嗜酸性喜温硫杆菌染色体的方法， 以及一种染色体基因无痕敲除和整合中用于同源重组的自杀型质粒载体PSDUDI，和一种嗜酸性喜温硫杆菌中表达大范围核酸内切酶的质粒pSDUl-1-SceI。
背景技术：
嗜酸性喜温硫杆菌(Acidithiobacillus caduls,简称A. caldus),是一类革兰氏阴性专性自养硫氧化细菌，在细菌浸矿中发挥十分重要的作用，能够显著提高铁氧化细菌如 Acidithiobacillus ferroxidans、Leptospirillum ferrooxidans 等的浸矿效率。近年来研究发现A.可从下述3个方面提高铁氧化细菌caldus 的浸矿效率(I)A. caldus 的生长，能利用附着在矿物表面的固体硫，暴露出矿物表面，从而使近况细菌充分接触到矿物并起作用；(2)A. caldus生长产生的有机物有助于促进异养或混合营养型浸矿细菌的生长；(3)A. caldus的代谢物具有表面活性作用，促进单质硫溶解[1] (Dopson M, Lindstorm EB. ；Appl Environ Microbiol. ;1999 ;Vol. 65 ;Νο· I ;36_40)。因此,A. caldus 的生长对细菌浸矿效率具有重要影响，引起了人们的广泛关注。但是，作为自养细菌，A. caldus具有生长缓慢，代时长，细胞得率低等特点，而且浸矿液中常常含有毒性重金属离子，也抑制了其生长。因此，用遗传学的方法深入研究A. caldus的生长代谢和改造A. caldus，提高其生长速率，是当前该领域的一个重要课题。对于嗜酸性喜温硫杆菌的遗传操作方法，研究进展比较缓慢，发明人所在实验室在国际上率先使用接合转移方法将外源基因通过大肠杆菌转移到A. caldus菌内[2](Liu X， Lin J, Zhang Z,et al. , J. Microbiol. Biotechnol. , 2007, Vol. 17,No. 1,162-167)。之后发明人所在实验室又在国际上率先使用电转化方法将外源基因转入A. caldus菌内，提高了转化效率，简化了操作[3] (Chen L, Lin J, Li B, Lin J, Liu X. , J Microbiol Biotechnol.， 2010，Vol. 20，No. 1，39-44)。基因敲除和整合是深入研究细菌基因功能、细菌生长代谢和细菌分子改造的重要方法，Rawlings所在的实验室曾报道利用A. caldus自身同源重组系统，将A. caldus的arSB和tetH基因置换为Km基因，从而达到基因敲除的目的[4] (Leonardo J. van Zyl,Jolanda M. van Munster,and Douglas E. Rawlings. ,Appl Environ Microbiol. ,2008, Vol. 74, No. 18，5686-5694)，但是此敲除方法的效率不稳定，从23株菌中筛到I株arsB敲除菌株，从249株菌中筛到I株tetH敲除菌株，而且此敲除方法每敲除一个基因，需要引入一个抗生素抗性基因，鉴于在A. caldus能够使用的有效抗生素数目有限，所以此敲除方法无法在同一株菌中敲除多个基因，除此之外没有在A. caldus中敲除基因的报道。因此，国际上尚无闻效无痕敲除A. caldus基因或将外源基因插入A. caldus染色体方法的报道
发明内容
针对基因敲除和整合是深入研究细菌基因功能、生长代谢和细菌分子改造的重要方法，而国际上尚无高效无痕敲除A. caldus基因或将外源基因插入A. caldus染色体方法的报道，本发明提出了一种无痕敲除嗜酸性喜温硫杆菌染色体基因或将外源基因插入嗜酸性喜温硫杆菌染色体的方法，以及一种A. caldus基因无痕敲除和整合中用于同源重组的自杀型质粒载体PSDUDI，和一种用于酶切染色体的大范围核酸内切酶的表达质粒 pSDUl-1-SceI。本发明所述无痕敲除嗜酸性喜温硫杆菌染色体基因或将外源基因插入嗜酸性喜温硫杆菌染色体的方法，步骤包括构建同源重组的自杀型质粒载体，在载体的多克隆位点处插入同源臂得到同源重组质粒，将构建的同源重组质粒通过化学转化法转入大肠杆菌 SMlO菌株，通过接合转移法将同源重组质粒从E. coliSMlO菌转入嗜酸性喜温硫杆菌中， 平板筛选单交换子并进一步鉴定，构建大范围核酸内切酶I-SceI的表达质粒并用电转化法转入单交换子中，平板筛选双交换子并进一步鉴定；其中所述自杀型质粒载体是pSDUDI，质粒pSDUDI的核苷酸序列如SEQ ID No. I所示；所述同源重组质粒是pSDUDI-Λ soxYZ，将其从E. coliSMlO菌转入嗜酸性喜温硫杆菌中的方法是将收集到的E. coliSMlO和嗜酸性喜温硫杆菌(A. caldus)菌液按照I : 3 的比例混合后，取50ul滴到接合平板上的滤菌膜上，37°C放置48h后，用5mL洗涤液洗涤滤膜，得到的细胞悬液梯度稀释后涂布加入卡那霉素的Starky-Na2S2O3固体培养基上，37°C， 培养7 10天；其中用于接合转移的A. caldus培养条件和收集方法是菌株于Starky_S° 液体培养基中39°C，125r/min培养4 7天后，低速低温离心去除细胞悬液中Starky_S°培养基带入的硫粉，取上清12000r/min离心5min收集细胞,并用洗漆液清洗三次；所述平板筛选单交换子并进一步鉴定的方法是挑取筛选平板上的菌落，溶于无菌水中，取菌液为模板，使用引物oriT EcoR sen和oriT Sal ant特异性扩增自杀型质粒载体上接合转移基因oriT，并以野生型菌株染色体为模板作为阴性对照，以质粒 pSDUDI-AsoxYZ为模板作为阳性对照，琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，正对照所在的泳道会产生740bp的PCR产物条带；负对照在相应的区域则无PCR产物条带；挑取的验证样品中，若在相应区域产生与正对照相似的条带，为单交换子，若无条带产生与负对照相似，为假阳性；对单交换子进一步鉴定方法是提取单交换子染色体，在被敲除基因的同源臂外侧设计引物2520YANZH sen和2520YANZH ant用PCR扩增，并以野生型菌株染色体为阴性对照，如果琼脂糖凝胶电泳检测显示以单交换子染色体为模板PCR扩增得到的条带比阴性对照大7 8Kb，则进一步确定是单交换子，若无，则为假阳性；上述引物序列是oriT EcoR sen ATTCCGGAATTCGCTCGTCCTGCTTCTCTTCGoriT Sal ant TCACGCGTCGACCGGGATTCAACCCACTCG2520YANZH sen CCGGGTTCCTGGTAAGTC2520YANZH ant GCTTACTGGCACTGCGATTA所述大范围核酸内切酶I-SceI的表达质粒是pSDUl-I-Scel,质粒pSDUl-I-Sce I 的核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示；所述大范围核酸内切酶I-SceI的表达质粒用电转化法转入单交换子中的方法
5是单交换菌株于Starky-S°液体培养基中，125r/min, 39 °C振荡培养4 7天至指数生长后期，低速低温离心去除细胞悬液中Starky-S°培养基带入的硫粉,取上清12000r/min,离心 5min收集细胞，并用渗透压逐渐降低的清洗液重复清洗细胞，制备电转化感受态细胞，提取 pSDUl-1-SceI质粒并与收集到的细胞以体积比为I : 40 55混合，电压10，500V/cm,电阻400 Ω，电容25 μ F进行电转化；上述去除细胞悬液中Starky_S°培养基带入的硫粉优选的方法是收集到的菌液
4。。，800 X g，离心 IOmin ；所述平板筛选双交换子方法是电转化后将菌悬液加入到Starky_S°液体培养基中，37°C，50 60rpm过夜培养后加入氯霉素，转速提高到100 120r/min再培养36_60h 后，梯度稀释涂布于加入氯霉素的筛选平板上，37°C倒置培养10 15天；在筛选平板上挑取菌落，在被敲除基因上下游150 250bp处设计引物2520test sen和2520test ant,用菌落PCR扩增，如果琼脂糖凝胶电泳检测显示只在300 500bp处有目的条带，则初步判断是双交换子；上述引物序列是2520test sen AAATTGCGGAAAGTCTCG2520test ant TGGGTATCGGTGATGTGC所述双交换子的进一步鉴定方法是将筛选到的双交换子菌落培养后提取染色体，在被敲除基因同源臂的外侧设计引物2520YANZH sen和2520YANZH ant PCR扩增验证被敲除基因上下游区域，以双交换子染色体为模板用PCR扩增，并以野生型菌株染色体为阴性对照，如果琼脂糖凝胶电泳检测显示以双交换子染色体为模板扩增得到的产物比阴性对照小，且差值是被敲除基因的大小，则进一步确定是双交换子。一种应用于嗜酸性喜温硫杆菌染色体基因无痕敲除和整合的同源重组自杀型质粒载体，其特征在于，所述质粒载体命名为PSDUDI，质粒pSDUDI的核苷酸序列如SEQ IDNo. I所示；其中所述质粒载体必须包含接合转移基因oriT，大范围核酸内切酶I-SceI酶切位点，用于筛选的卡那霉素抗性基因Km和氨苄青霉素抗性基因Amp，以及适于同源臂插入的多克隆位点MCS。其中，所述插入的同源臂核苷酸片段必须大于1Kb，优选的，所述插入的同源臂核苷酸片段为1.5Kb。上述同源重组的自杀型质粒载体pSDUDI包含接合转移基因oriT，使质粒可以从大肠杆菌SMlO菌株成功转入喜温硫杆菌中；包含大范围核酸内切酶I-SceI酶切位点，使大范围核酸内切酶可以成功切断插入同源重组质粒的染色体，提高了同源臂发生第二次交换的效率；包含卡那霉素抗性基因Km，作为单交换子的筛选标记；包含氨苄青霉素抗性基因 AmpR，为同源重组质粒转入大肠杆菌SMlO菌株提供了筛选标记；设计了多克隆位点MCS，为同源臂的插入提供了便利。上述同源重组的自杀型质粒载体pSDUDI的构建方法是第一设计载体上用于插入同源臂的多克隆位点的DNA序列MCSl rTTrrTACTAGTCTAGAGCTCGGATCCACGCGT Sail SpeI XbaI SacI BamHl MluI MCS2 C ATATGCAATTGAAGCTTGGTACCGCGGCTAGCGGCCGC NdeI MfeI HindIII KpnI SacII NheI NotI第二以质粒 pSIMPLE-19EcoR V/BAP Vector (购自 TAKARA 公司)为模板，使用引物pMD19Sal sen、pMD19EcoR ant, PCR扩增获得质粒的复制子(ColElori)及氨节青霉素抗性基因(AmpR)部分，以质粒 RP4 (Datta, N.，R. ff. Hedges ;J. Bacteriol. ； 1971 ； 108 1244-1249.)为模板，使用引物oriT EcoR sen,oriT Sal ant，PCR扩增获得接合转移起始位点oriT，将两次PCR得到的产物用EcoRI和SalI双酶切，纯化后，用T4DNA连接酶连接， RKE. coliDH 5 α，利用氨苄青霉素筛选转化子，提取质粒并进行验证，该质粒为构建过程中的中间质粒，命名为PMD-or iT。第二以质粒pMD-oriT为模板,使用引物MCS sen和oriT MCS ant扩增质粒复制部分ColElori、氨苄青霉素抗性基因AmpR和接合转移起始位点oriT，以pJRD215 (Davison， J.，M. Heusterspreute ；Gene ；1987 ；51 :275-280.)为模板，使用引物 Km MCS sen 和 Km MCS ant扩增卡那霉素抗性基因，同时合成多克隆位点，将两次PCR得到的产物使用BamHI 和HindIII双酶切，纯化后，用T4DNA连接酶连接，转化E. coliDH 5α，利用卡那霉素和氨苄青霉素筛选转化子，提取质粒并进行验证，该质粒为构建过程中的中间质粒，命名为 PMD-oriT-Km-MCS ；第三以中间质粒PMD-oriT-Km-MCS为模板，使用弓丨物MCS BamHI sen和oriT ApaIant扩增多克隆位点MCS2、质粒复制部分ColElori、氨苄青霉素抗性基因AmpR和接合转移基因oriT,以pJRD215为模板，使用引物I-SceI ApaI sen和Km BamHI ant扩增卡那霉素抗性基因，同时合成大范围核酸内切酶I-SceI酶切位点，将两次PCR得到的产物使用 BamHI和ApaI双酶切，纯化后，用T4DNA连接酶连接，转化E. coliDH 5 α，利用卡那霉素和氨苄青霉素筛选转化子，提取质粒并进行验证，该质粒即为A. caldus基因无痕敲除和整合中用于同源重组的自杀型质粒载体PSDUDI，大小为3. 9Kb，其核苷酸序列如SEQ ID No. I所
/Jn ο
上述大范围核酸内切酶I-SceI酶切位点的DNA序列是
TAGGGATAACAGGGTAAT
上述引物序列是
pMD19Sal sen
TCACGCGTCGACGCGGTAATACGGTTATCCAC
pMD19EcoR ant
TCCGGAATTCAATGGTTTCTTAGACGTCAGGT
MCS sen
CCCAAGCTTGGTACCGCGGCTAGCGGCCGCGCGGTAATA
oriT MCS ant
CGGGATCCGAGCTCTAGACTAGTCGACCGGGATTCAACC
Km MCS sen
CGCGGATCCATCGATACGCGTCGGATGAATGTCAGCTACTKm MCS ant CCCAAGCTTCAATTGCATATGGGCGGTGGAATCGAAATCMCS BamHI sen CGTGGATCCACGCGTCCGCCCATATGCAATTGAoriT ApaI ant TATAGGGCCCCGACCGGGATTCAACCCAI-SceI ApaI sen GTGAGGGCCCATAGGGATAACAGGGTAATATGAATGTCAGCTACTGGKm BamHI ant CTGGATCCGAGCTCTAGACTAGTCGACAATCGAAATCTCGTGATGG一种应用于嗜酸性喜温硫杆菌中表达大范围核酸内切酶的表达质粒，其特征在于，所述质粒命名为pSDUl-1-SceI，质粒pSDUl-1-Sce I的核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示；其中所述质粒pSDUl-1-SceI由质粒载体pSDUl，启动子tac，大范围核酸内切酶表达基因I-SceI构成。上述用于酶切染色体的大范围核酸内切酶的表达质粒pSDUl-1-SceI的构建方法是第一以质粒pACBSR(C. D. Herring, J. D. Glasner, F. R. Blattner. ；2003 ；331 153-163.)上氯霉素抗性基因开放阅读框为基础，通过两轮PCR，将原来的启动子替换为可以在A. caldus MTH-04中使用的质粒pBR322(购自TAKARA公司)上的四环素抗性基因启动子P2。第一轮PCR:以质粒pACBSR为模板，引物Cm Slsen, Cm ant扩增氯霉素抗性基因开放阅读框；第二轮PCR 以第一轮扩增的PCR产物切胶回收后作为模板，使用引物CmS2sen、 Cm ant进行PCR扩增，扩增产物816bp，获得了含有启动子P2的氯霉素抗性基因。上述引物序列是Cm Slsen GCGGTAGTTTATCACAGTTAAATTGCTAACGCAGTCAGGCACCGTGTATGGAGAAAAAAATCACTGGCmS2sen CTGAGAATTCATGCATTCATGTTTGACAGCTTATCATCCATAAGGTTTAATGCGGTAGTTTATCACAGCm ant CTTCGTGCACATTCATCCGCTTATTATCACTT第二以质粒PJRD215 为模板，引物 P215sen、P215ant 扩增 pJRD215 的 oriV、 mob及rep部分，将获得的pJRD215扩增部分与优化启动子的氯霉素抗性基因部分，分别用 Alw44I、EcoT22I双酶切后，用T4DNA连接酶连接，转化E. coliDH 5α，利用氯霉素筛选转化子，提取质粒并进行验证，，该质粒即为中间质粒PSDU。上述引物序列是P215sen CTTCGTGCACTCCTTGCAATACTGTGTTP215ant CTTCATGCATCCCAAGCTTAGAGCATACATCTGGAAGCA第三以质粒pSDU 为模板，引物 pSDU-EcoT sen 和 pSDU-XhoI ant 扩增 oriV,mob，rep及氯霉素抗性部分，以质粒载体pMMB6为模板,引物tac_XhoI sen和tac_EcoT ant扩增tac启动子部分，将两次PCR得到的产物使用EcoT22I和XhoI双酶切，纯化后，用T4DNA 连接酶连接，转化E. coliDH 5 α，利用氯霉素筛选转化子，提取质粒并进行验证，该质粒即为中间质粒pSDUl-tac。上述引物序列是pSDU-EcoT sen CTTCATGCATTCATGTTTGACAGCTTATCpSDU-XhoI ant ACTCCTCGAGAGAGCATACATCTGGAAGCAtac-XhoI sen ACTCCTCGAGATCGACTGCACGGTGtac-EcoT ant CTTCATGCATTGTTTCCTGTGTGAAATTG第四以质粒pSDUl-tac 为模板，使用引物 pSDUlEcoT-Xba sen 和 tac Bam-Pst ant扩增质粒载体和启动子部分pSDUl-tac，以质粒pACBSR为模板，使用引物0F131Bamsen 和 0F132XbaI ant[5] (C. D. Herring, J. D. Glasner,F. R. Blattner. ；2003 ；331 :153-163.)扩增I-SceI表达基因，将两次PCR得到的产物使用BamHI和XbaI双酶切，纯化后，用T4DNA 连接酶连接，转化E. coliDH 5 α，利用氯霉素筛选转化子，提取质粒并进行验证，该质粒即为用于酶切染色体的大范围核酸内切酶的表达质粒pSDUl-1-SceI。上述引物序列是pSDUlEcoT-Xba sen CTTCATGCATTCTAGATCATGTTTGACAGCTTATCtac Bam-Pst I ant TCGCGGATCCTCCTGCAGTGTTTCCTGTGTGAAATTGOFl31 Bam sen TTACGCGGATCCAGGAGGGTACCTATATGCATATGAAAAACATCAAAAAAAACC0F132XbaI ant TTCTTCTCTAGAACGTCGGGCCCTTATTTCAGGAAAGTTTCGGAGGAG上述平板筛选双交换子优选的方法是电转后将菌悬液加入到Starky_S°液体培养基中，37°C，50r/min过夜培养后加入氯霉素，加入氯霉素的量是使其终浓度为30 μ g/ mL ;所述转速提高到100r/min后，再培养48h (时间太短I-SceI酶的酶切效果不明显，时间太长，野生菌的生长占优势)。上述菌落PCR筛选双交换子的方法中(以基因敲除为例说明)，在被敲除基因上下游150 250bp处设计引物，该引物应符合以下要求以野生型菌株染色体为模板时PCR 扩增出目的条带，而以单交换子染色体为模板，使用该对引物PCR扩增，除在相同大小处有条带，在300 500bp处也有条带。本发明将含有大范围核酸内切酶I-SceI酶切位点的同源重组质粒采用接合转移的方式转入A. caldus中，同时利用细胞自身的同源重组系统，将同源重组质粒定向插入到 A. caldus染色体中，筛选到的单交换子电转入I-SceI表达质粒，在I-SceI酶切断染色体的压力下，单交换子染色体发生第二次同源重组，优化筛选方法，最终筛选到双交换菌株，从而实现基因的敲除或插入。本发明在实施的过程中，同时构建了用于同源重组的自杀型质粒载体pSDUDI，可以作为A. caldus基因敲除或整合的通用载体，以及在A. caldus中有效表达I-SceI酶的质粒pSDUl-1-SceI，为A. caldus中基因的无痕敲除或整合提供了便利，为
9A. caldus的深入研究和改造提供了新的途径。本发明在国际上首次创建了在嗜酸性喜温硫杆菌中高效无痕敲除或整合基因的方法，并成功敲除A. caldus的硫代谢相关基因soxYZ，而且在双交换子筛选平板上，平均每 25个菌落可筛到I个双交换子。


图I.双交换子的PCR验证结果。PCR模板分别为W，野生型菌株的染色体；D，单交换子的染色体；S，双交换子的染色体；M，DNA Marker，从上到下大小依次是 15, OOObp, 10, OOObp, 7, 500bp, 5, OOObp, 3,OOObp0图2.自杀型质粒载体pSDUDI的物理图谱。图3.质粒pSDUl-1-SceI的物理图谱。图4 :嗜酸性喜温硫杆菌基因无痕敲除和整合原理。
具体实施例方式实施例I敲除嗜酸性喜温硫杆菌硫代谢相关基因soxYZI.质粒 pSMPLE-19EcoR V/BAP Vector (购自 TAKARA 公司)，pJRD215[7](购自 Biovector Co. , LTD Davison J. , M. Heusterspreute, N.Chevalie；Gene ；51 ;275_280)的提取使用TaKaRa MiniBEST Plasmid Purification Kit Ver. 2. O 质粒小提试剂盒(购自TaKaRa公司，货号DV801A)，具体操作如下(I) 20ml LB培养基中加入相应的抗生素，接种I %活化的菌种，37°C，200r/min,振荡培养12 14h。(2)取5ml培养好的菌液倒入离心管中，12, 000r/min离心3min,吸净上清。(3)向收集的菌体中加入250 μ I的SolutionI (含RNaseAl) ,Vortex,充分悬浮细胞沉淀后的菌液转移到I. 5ml的EP管中。(4)加入250 μ I的Solutionll，轻轻地上下翻转5 6次，使菌体充分裂解，形成透明溶液。注菌体裂解一定要充分，形成透明溶液，且操作要迅速，此步不宜超过5min。(5)加入400 μ L的4°C SolutionIII,轻轻地上下翻转混合5 6次,直至形成紧实凝集块，然后室温静置2min。(6) 12, 000r/min 离心 IOmin0(7)将试剂盒中的 Spin Column 安置于 Collection Tube 上。(8)取上清轻柔地转移至Spin Column中，然后12，000r/min离心Imin,弃滤液。(9)将 500 μ I 的 RinseA 加入 Spin Column 中，12，000r/min 离心 30sec,弃滤液。(10)将 700 μ I 的 RinseB 加入 Spin Column 中，12, 000r/min 离心 30sec,弃滤液。(11)重复(9)，倾倒残液后，再 I, 2000r/min 离心 Imin0(12)将Spin Column安装于新的I. 5ml的离心管上,在Spin Column膜中央处加入30 μ L的65°C预热的灭菌ddH20，室温静置3min。
(13) 12, 000r/min 离心 Imin 洗脱 DNA。
2. PCR扩增质粒复制部分ColElori、氨苄青霉素抗性基因AmpR
以质粒 pSMPLE-19EcoR V/BAP Vector 为模板，使用引物 pMD19Sal sen、pMD19EcoR ant，PCR扩增获得质粒的复制子(ColElori)及氨苄青霉素抗性基因(AmpR)部分。
(I)上述引物序列如下
pMD19 Sal sen
TCACGCGTCGACGCGGTAATACGGTTATCCAC
pMD19 EcoR ant
TCCGGAATTCAATGGTTTCTTAGACGTCAGGT
(2)反应体系的配制
ddH20 21 μ I ； Premi X PrimerSTAR HS 25μ L ；引物 MCS sen I. 5 μ L (O. 3 μ Mfinalconc.)；引物 oriT MCS ant I. 5 μ L (O. 3 μ M final conc.);模板 DNA(质粒pMD-oriT-sor-Km) :1 μ L。(Premix PrimerSTAR HS 购自 TaKaRa 公司，货号DR040A)
(3)聚合酶链式反应(PCR)反应程序94°C 2min ;之后98°C 10s, 55 °C 15s，72°C 3min，共 29 个循环；最后 72°C IOmin0
(4) DNA凝胶电泳检测。
3. PCR扩增获得接合转移起始位点oriT
以质粒RP4为模板，使用引物oriT EcoR sen,oriT Sal ant，PCR扩增获得接合转移起始位点oriT。
上述引物序列如下
oriT EcoR sen ATTCCGGAATTCGCTCGTCCTGCTTCTCTTCG
oriT Sal ant TCACGCGTCGACCGGGATTCAACCCACTCG
4.将2和3中得到的PCR产物纯化后，EcoRI (TaKaRa Code :D1040A) 37°C酶切后纯化回收，再 SalUTaKaRa Code :D1080A) 37°C酶切
EcoRI 酶切体系EcoRI I μ L ；10XH Buffer 2 μ L ;DNA < I μ g ;灭菌水 up to20 μ L0
Sail 酶切体系Sail I μ L ；10XH Buffer 2 μ L ;DNA 彡 I μ g ;灭菌水 up to20 μ L0
5.酶切液纯化后利用T4DNA连接酶(TaKaRa Code :D2011A) 16°C过夜连接
连接体系10XT4 DNA Ligase Buffer 2. 5 μ L ；DNA 片段约 0. 3pmol ；
载体 DNA 约 O. 03pmol ；T4DNALigase I μ L ；dH20 up to 25 μ L
6.连接液转入E. coliDH5a感受态细胞中
(I)取50 μ L冰浴上融化的感受态细胞，加入连接液，轻轻混匀，在冰浴中放置30mino
(2) 42°C水浴中热激45s，然后快速将管转移到冰浴中2min，该过程不要摇动离心管。
(3)向每个离心管中加入500 μ L无菌的LB培养基(不含抗生素)，混匀后置于
37°C，200r/min培养lh，使细菌复苏。
(4)吸取50 μ L已转化的感受态细胞加入含卡那霉素和氨苄青霉素的LB琼脂培养基上，将细胞均匀涂开。将平板置于37°C至液体被吸收，倒置平板，37°C过夜培养。7.挑取筛选平板上的菌落，溶于10 μ L无菌水中，菌落PCR筛选转化子，转化子菌悬液接种于20mL LB培养基中，37°C过夜培养，提取转化子质粒，酶切验证，该质粒为中间质粒 PMD-oriT。菌落PCR 反应体系模板 2 μ 1，引物各 I μ I (10 μ Μ)，Premix Taq (TaKaRa Code DRR003A) 12. 5 μ 1，超纯水 8· 5μ I。菌落PCR 反应程序94°C IOmin ;之后 98°C 10s, 55°C 15s, 72°C lmin/Kb,共 34 个循环；最后72°C IOmin08. PCR扩增质粒复制部分ColElori、氨苄青霉素抗性基因AmpR和接合转移基因 oriT 利用引物MCS sen和oriT MCS ant,以质粒PMD-oriT为模板，PCR扩增出质粒复制部分ColElori、氨苄青霉素抗性基因AmpR和接合转移基因oriT。上述引物序列如下MCS sen CCCAAGCTTGGTACCGCGGCTAGCGGCCGCGCGGTAATAoriT MCS ant CGGGATCCGAGCTCTAGACTAGTCGACCGGGATTCAACC9. PCR扩增卡那霉素抗性基因，同时合成多克隆位点利用引物Km MCS sen和Km MCS ant,以质粒pJRD215为模板，PCR扩增出卡那霉素抗性基因，同时合成多克隆位点。上述引物序列如下Km MCS sen CGCGGATCCATCGATACGCGTCGGATGAATGTCAGCTACTKm MCS ant CCCAAGCTTCAATTGCATATGGGCGGTGGAATCGAAATC10.将 8 和 9 中得到的 PCR 产物纯化后，BamHI (TaKaRa Code D1010A) 30°C酶切后纯化回收，再 HindIII (TaKaRa Code :D1060A) 37°C酶切BamHI 酶切体系BamHI I μ L ；10XK Buffer 2 μ L ;DNA < I μ g ;灭菌水 up to 20 μ L0HindIII 酶切体系HindIII I μ L ; 10XM Buffer 2 μ L ;DNA 彡 I μ g ;灭菌水 up to 20 μ L。11.酶切液纯化后利用T4DNA连接酶(TaKaRa Code :D2011A) 16°C过夜连接。12.连接液转入E. coliDH5a感受态细胞中。13.挑取筛选平板上的菌落，溶于10 μ L无菌水中，菌落PCR筛选转化子，转化子菌悬液接种于20mL LB培养基中，37°C过夜培养，提取转化子质粒，酶切验证，该质粒为中间质粒 PMD-oriT-Km-MCS。14. PCR扩增多克隆位点MCS2、质粒复制部分ColElori、氨苄青霉素抗性基因AmpR 和接合转移基因oriT
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利用引物MCSBamHI sen和oriT ApaI ant，以质粒PMD-oriT-Km-MCS为模板，PCR 扩增出多克隆位点MCS2、质粒复制部分ColElori、氨苄青霉素抗性基因AmpR和接合转移基因 oriT。上述引物序列如下MCS BamHI sen CGTGGATCCACGCGTCCGCCCATATGCAATTGAoriT ApaI ant TATAGGGCCCCGACCGGGATTCAACCCA15. PCR扩增卡那霉素抗性基因，同时合成大范围核酸内切酶I-SceI酶切位点利用引物I-SceI ApaI sen和Km BamHI ant,以质粒pJRD215为模板,PCR扩增出卡那霉素抗性基因，同时合成大范围核酸内切酶I-SceI酶切位点。上述引物序列如下I-SceI ApaI sen GTGAGGGCCCATAGGGATAACAGGGTAATATGAATGTCAGCTACTGGKm BamHI ant CTGGATCCGAGCTCTAGACTAGTCGACAATCGAAATCTCGTGATGG16.将14和15中得到的PCR产物纯化后，BamHI和ApaI双酶切。17.酶切液纯化后利用T4DNA连接酶16°C过夜连接。18.连接液转入E. coliDH5a感受态细胞中，吸取50 μ L涂布在含卡那霉素和氨苄青霉素的LB琼脂培养基上，37°C培养24h。19.挑取筛选平板上的菌落，溶于10 μ L无菌水中，菌落PCR筛选转化子，转化子菌悬液接种于20mL LB培养基中，37°C过夜培养，提取转化子质粒，酶切验证，并测序确认，该质粒即为自杀型质粒载体pSDUDI，所述质粒pSDUDI的核苷酸序列如SEQ IDNo. I所示。20. PCR扩增soxYZ上下游同源臂利用引物2520up Sail sen 和 2520up XbaI ant，以 A. caldus 染色体为模板，PCR 扩增 soxYZ 上游同源臂；利用引物 2520down Hind III sen 和 2520 down NotI ant,以 A. caldus染色体为模板，PCR扩增soxYZ下游同源臂。上述引物序列如下2520 up Sail sen TCAACGGTCGACCTATGGCGTGCTGAGTTATC2520 up XbaI ant CTAGTCTAGATATCCGTAGGGAACCACTC2520 down Hind III sen TCCCAAGCTTTTAGAACAGGAGTGTAGCCG2520 down NotI ant CAAAGCGGCCGCGACACGCAGGTCTGTGATAC21.质粒pSDUDI和soxYZ上游同源臂Sail和XbaI双酶切，酶切液纯化后利用 T4DNA连接酶过夜连接。22.连接液转入E. coliDH5a感受态细胞中，吸取50 μ L涂布在含卡那霉素和氨苄青霉素的LB琼脂培养基上，37°C培养24h。23.挑取筛选平板上的菌落，溶于10 μ L无菌水中，菌落PCR筛选转化子，转化子菌悬液接种于20mL LB培养基中，37°C过夜培养，提取转化子质粒，酶切验证，该质粒为中间质粒 pSDUDI-ΛsoxYZ(UP)。24.质粒 pSDUDI-Λ soxYZ (UP)和 soxYZ 下游同源臂 Hind III 和 NotI 双酶切，酶切液纯化后利用T4DNA连接酶过夜连接。25.连接液转入E. coliDH5a感受态细胞中，吸取50 μ L涂布在含卡那霉素和氨苄青霉素的LB琼脂培养基上，37°C培养24h。26.挑取筛选平板上的菌落，溶于10 μ L无菌水中，菌落PCR筛选转化子，转化子菌悬液接种于20mL LB培养基中，37°C过夜培养，提取转化子质粒，酶切验证，并测序确认，该质粒即为同源重组质粒pSDUDI-AsoxYZ027.制备 E.coli SMlO 感受态细胞，将质粒 pSDUDI-Λ soxYZ 转入 Ε· coliSMlO 感受态细胞中(I)将E. coli SMlO接种 20mL LB培养基，卡那霉素浓度80 μ g/mL，37°C，200r/min 培养16h，取200 μ L活化的菌株转入20mL LB培养基中，37°C，200r/min培养I 2h (使OD
达到0. 4左右，空培养基作对照)；(2)菌液冰浴 20min,取 I. 5mL 于 I. 5mLEppendorf 管中,4°C，10000r/min 离心 30s, 吸出上清，倒置Imin (残留液流尽)；(3)用预冷的800yL100mmol/L CaCl2溶液重悬细胞，冰浴lOmin，离心(4 °C, 10000r/min 30s)吸出上清,倒置Imin (残留液流尽)；(4)用预冷的100 μ LIOOmmoI/L CaCl2溶液重悬细胞，冰浴4h左右；(5)向100 μ L细胞悬液中加入5-10 μ L的DNA质粒，轻轻混匀，冰浴30min ；(6)混合液42°C水浴90s，不要摇动，再冰浴2min，立即加入500 μ L LB培养液， 37°C,200r/min培养lh，吸取50 μ L涂布在含氨苄青霉素的LB琼脂培养基上，37°C培养 24h。28.挑取筛选平板上的菌落，溶于10 μ L无菌水中，菌落PCR筛选转化子，转化子菌悬液接种于20mL LB培养基中，37°C过夜培养，提取转化子质粒，酶切验证，证实质粒 pSDUDI-AsoxYZ 已转入 Ε· coliSMlO 中。29.将嗜酸性喜温硫杆菌MTH-04 (本实验室从云南腾冲温泉酸性水样分离得到， 保藏编号为CGMCC NO. 1742 ;刘缨，齐放军，林建群等；一株中度嗜热嗜酸硫氧化杆菌的分离和系统发育分析；微生物学报；2004 ；44(3) =382-385)接种于Starky_S°液体培养基中， 39°C, 125r/min培养5. 5天后,4°C, 800 X g,离心IOmin去除细胞悬液中Starky-Sci培养基带入的硫粉，取上清12000r/min,离心5min收集细胞,无机盐洗漆液重悬细胞，12，000r/min, 离心5min，收集细胞，再重复洗涤两次，最后用无机盐洗涤液重悬细胞，使OD6tltl达到20。30.将转入质粒pSDUDI-Λ soxYZ的E. coliSMlO菌株接种于20mL含氨苄青霉素 80 μ g/mL的LB液体培养基中，37°C，200r/min过夜培养后，取200 μ L活化的菌株转入20mL 含氨苄青霉素80 μ g/mL的LB培养基中，37°C，200r/min培养至指数生长中期，12000r/min, 离心5min收集细胞,无机盐洗漆液重悬细胞，12，000r/min,离心5min,收集细胞,再重复洗涤两次，最后用无机盐洗涤液重悬细胞，使0D_达到20。
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31.将孔径O. 22 μ m的滤膜正面朝上放置在E. coli和A. caldus的接合培养基上， 将收集到的E. coliSMlO和A. caldus菌液按照I : 3的比例混合后，取50 μ L滴到滤菌膜上，轻轻涂均匀，37°C放置48h后，用5mL洗涤液洗涤滤膜，得到的细胞悬液梯度稀释后涂布含卡那霉素80 μ g/mL的Starky-Na2S2O3固体培养基上，37 °C，培养7 10天。32.挑取筛选平板上的菌落,溶于10μ L无菌水中，取2μ L菌液为模板，使用引物 oriT EcoR sen和oriT Sal ant菌落PCR，并以野生型菌株染色体为模板作为阴性对照，以质粒pSDUDI-Λ soxYZ为模板作为阳性对照，琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，正对照所在的泳道会产生740bp的PCR产物条带；负对照在相应的区域则无PCR产物条带；挑取的验证样品中，若在相应区域产生与正对照相似的条带，说明为单交换子，若无条带产生与负对照相似，说明为假阳性；上述引物序列是oriT EcoR sen ATTCCGGAATTCGCTCGTCCTGCTTCTCTTCGoriT Sal ant TCACGCGTCGACCGGGATTCAACCCACTCG。33.将单交换子菌悬液接到20mL Starky-S0液体培养基中39°C，125r/min培养 6-9天，再全部转接到150mLStarky-S°液体培养基中39°C 125r/min培养6d后，提取染色体使用TIANamp Bacteria DNA Kit(购自 TIANGEN BIOTECH, Code :DP302)，具体操作如下(I)取细菌培养液601^，41，800\8，离心IOmin去除细胞悬液中Starky-Sci培养基带入的硫粉，取上清12000r/min,离心5min收集细胞,尽量吸尽上清。(2)向菌体沉淀中加入200 μ L缓冲液GA，振荡至菌体彻底悬浮。(3)向管中加入20 μ L蛋白酶K溶液，混匀。(4)加入220 μ L缓冲液GB，振荡15s，70°C放置lOmin，溶液应变清亮，简短离心以
去除管内壁的水珠。(5)加入220 μ L无水乙醇，充分振荡混匀15s，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心去除管内壁的水珠。(6)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)，12，000r/min离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。(7)向吸附柱CB3中加入500 μ L缓冲液GD, 12，000r/min离心30s,倒掉废液，将吸附柱放入收集管中。(8)向吸附柱CB3中加入600 μ L漂洗液Pff, 12，000r/min离心30s,倒掉废液，将
吸附柱放入收集管中。(9)重复操作步骤8。(10)将吸附柱CB3放回收集管中，12，000r/min离心2min，倒掉废液。将吸附柱 CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。(11)将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加 50 μ L洗脱缓冲液TE，12，000r/min离心2min，将溶液收集到离心管中。
34.在soxYZ同源臂外侧设计引物2520YANZH sen和2520YANZH ant PCR扩增验证，并以野生型菌株染色体为阴性对照，琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，阴性对照所在的泳道会产生4. 8Kb的PCR产物条带，挑取的验证样品所在的泳道若产生12. 5Kb的PCR产物条带，说明为单交换子，若无，说明为假阳性。上述引物序列是2520YANZH sen CCGGGTTCCTGGTAAGTC2520YANZH ant GCTTACTGGCACTGCGATTA35.以质粒pACBSR上氯霉素抗性基因开放阅读框为基础，通过两轮PCR，将原来的启动子替换为可以在A. caldusMTH-04中使用的质粒pBR322 (购自TAKARA公司)上的四环素抗性基因启动子P2:第一轮PCR 以质粒pACBSR为模板，引物Cm Slsen, Cm ant扩增氯霉素抗性基因开放阅读框；第二轮PCR :以第一轮扩增的PCR产物切胶回收后作为模板，使用引物CmS2Sen、Cm ant进行PCR扩增，扩增产物816bp，获得了含有启动子P2的氯霉素抗性基因。上述引物序列是Cm Slsen GCGGTAGTTTATCACAGTTAAATTGCTAACGCAGTCAGGCACCGTGTATGGAGAAAAAAATCACTGGCmS2sen CTGAGAATTCATGCATTCATGTTTGACAGCTTATCATCCATAAGGTTTAATGCGGTAGTTTATCACAGCm ant CTTCGTGCACATTCATCCGCTTATTATCACTT36.扩增 pJRD215 的 oriV> mob 及 rep 部分以质粒pJRD215 为模板，引物 P215sen、P215ant 扩增 pJRD215 的 oriV、mob 及 r印部分。上述引物序列是P215sen CTTCGTGCACTCCTTGCAATACTGTGTTP215ant CTTCATGCATCCCAAGCTTAGAGCATACATCTGGAAGCA37.将获得的PJRD215扩增部分与优化启动子的氯霉素抗性基因部分，分别用 Alw44I、EcoT22I双酶切后，用T4DNA连接酶连接，转化E. coli DH 5 α，利用氯霉素筛选转化子，提取质粒并进行验证，，该质粒即为中间质粒pSDU。38.扩增oriV, mob, rep及氯霉素抗性部分以质粒pSDU 为模板，引物 pSDU-EcoT sen 和 pSDU-XhoI ant 扩增 oriV, mob, rep 及氯霉素抗性部分。上述引物序列是pSDU-EcoT sen CTTCATGCATTCATGTTTGACAGCTTATCpSDU-XhoI ant ACTCCTCGAGAGAGCATACATCTGGAAGCA
39. PCR扩增tac启动子部分
部分。以质粒载体pMMB6为模板，引物tac-XhoI sen和tac_EcoT ant扩增tac启动子
tac-XhoI sen ACTCCTCGAGATCGACTGCACGGTG
tac-EcoT ant CTTCATGCATTGTTTCCTGTGTGAAATTG
40.将38和39中两次PCR得到的产物使用EcoT22I和XhoI双酶切，纯化后，用T4DNA连接酶连接，转化E. coliDH 5 α，利用氯霉素筛选转化子，提取质粒并进行验证，该质粒即为中间质粒pSDUl-tac。
41. PCR扩增质粒载体和启动子部分pSDUl-tac
使用引物pSDUlEcoT-Xba sen 和 tac Bam-Pst ant,以质粒 pSDUl-tac 为模板,PCR扩增出质粒载体和启动子部分pSDUl-tac。
上述引物序列是
pSDUlEcoT-Xba sen
CTTCATGCATTCTAGATCATGTTTGACAGCTTATC
tac Bam-Pst I ant
TCGCGGATCCTCCTGCAGTGTTTCCTGTGTGAAATTG
42. PCR扩增I-SceI表达基因
使用引物0F131Bam sen和0F132XbaI ant,以质粒pACBSR为模板，PCR扩增出I-SceI表达基因。
上述引物序列是
OFl3IBam sen
TTACGCGGATCCAGGAGGGTACCTATATGCATATGAAAAACATCAAAAAAAACC
0F132XbaI ant
TTCTTCTCTAGAACGTCGGGCCCTTATTTCAGGAAAGTTTCGGAGGAG
43.将29和30中得到的PCR产物纯化后，BamHI和XbaI双酶切。
44.酶切液纯化后利用T4DNA连接酶16°C过夜连接。
45.连接液转入E. coliDH5a感受态细胞中，吸取50 μ L涂布在含氯霉素30 μ g/
mL的LB琼脂培养基上，37°C培养24h。46.挑取筛选平板上的菌落，溶于10 μ L无菌水中，菌落PCR筛选转化子，转化子菌悬液接种于20mL LB培养基中，37°C过夜培养，提取转化子质粒，酶切验证，并测序确认，该质粒即为pSDUl-1-SceI，所述质粒pSDUl-1-SceI的核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示。47.将单交换子接种于Starky-S0液体培养基中，120r/min，39°C振荡培养5. 5d， 12，000r/min, lOmin, 4°C离心收集细胞；无机盐洗漆液重悬细胞，2，000r/min, 5min, 4°C离心除去细胞悬液中Starky-Sci培养基带入的硫粉；取上清,5，000r/min, 5min, 4°C收集细胞； 无机盐洗涤液再次重悬细胞，5，000r/min，5min，4°C收集细胞；高pH磷酸缓冲液重悬细胞， 4，000r/min, 5min,4°C收集细胞；冰浴的超纯水重悬清洗细胞，4，000r/min, 5min,4°C收集细胞；冰浴的超纯水再次重悬清洗细胞，3，000r/min，5min，4°C收集细胞，最后用冰浴的超纯水稀释细胞，使0D_达到I. O。48.取8 μ I质粒pSDUl-1-SceI与400 μ I菌体混合，冰上放置lOmin，然后加入
17到O. 2cm冰浴的电转化杯中，使用Bio-Rad MicroPulser 型电击仪，设置电转化参数电压10，500V/cm ;电阻400 Ω ;电容25 μ F，将冰浴的电转化杯放到电转化槽中，按照设置的电转化参数，进行电击。49.取出电转化杯，吸出菌悬液，加入到ZOmLStarky-Sc^f体培养基中，37°C，60r/ min过夜培养后加入氯霉素使其终浓度达30 μ g/ml，提高转速至120r/min，再培养48h。50.取50 μ L培养液，涂布于含有氯霉素30 μ g/mL的Starky-Na2S2O3固体筛选平板。37°C倒置培养10 15d。51.在 soxYZ 上下游 150_250bp 处设计引物 2520test sen 和 2520test ant，挑取筛选平板上的菌落，溶于10 μ L无菌水中，取2 μ L菌液为模板菌落PCR筛选，并以野生型菌株染色体为阴性对照，以单交换子染色体为阳性对照，琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，阴性对照所在的泳道会产生I. 2Kb的PCR产物条带，阳性对照所在的泳道会产生I. 2Kb和320bp 两条PCR产物条带，挑取的样品所在的泳道若只有一条PCR产物条带，且为320bp，说明为双交换子，若无，说明为假阳性。上述引物序列是2520 test sen AAATTGCGGAAAGTCTCG2520 test ant TGGGTATCGGTGATGTGC52.将筛选到的双交换子菌悬液接到20mL Starky-S0液体培养基中39°C，125r/ min培养6-9d，再全部转接到150mL Starky-Sci液体培养基中39°C 125r/min培养6d后，提取染色体。53.使用引物2520YANZH sen和2520YANZH ant PCR扩增验证，并以野生型菌株染色体为阴性对照，琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，阴性对照所在的泳道会产生4. 8Kb的PCR 产物条带，挑取的验证样品所在的泳道若产生3. 9Kb的PCR产物条带，说明为双交换子，若无，说明为假阳性。上述LB培养基配方蛋白胨10g,酵母粉5g,NaCl :10g,用2N NaOH溶液调pH至7. O 7. 5,加蒸懼水至IOOOmL,固体培养基加I. 8%琼脂粉，15磅/cm2高压蒸汽灭菌20min。 上述喜温硫杆菌Starky_S°液体培养基配方(NH4)2SO4 2g ；KH2PO4 3g ；MgS04 · 7H20 :0. 5g ；FeS04 · 7H20 :0. Olg ；CaCl2 · 2H20 0.25g;加800mL自来水溶解，用浓H2SO4调pH 2. 5 3. 5，用自来水补足体积至1000mL。15 磅/cm2，蒸汽灭菌20min。硫磺粉放于干燥的三角瓶中，用塑料膜将瓶口封紧，常压蒸煮灭菌 2h以上。临用前，用灭菌的药匙取一定量的硫磺粉加入Starky无机盐培养基中，至终浓度 20g/L。上述喜温硫杆菌Starky-Na2S2O3固体培养基配方A (NH4)2SO4 0. 6g ；KH2PO4 :0. 6g ；MgS04 ·7Η20 :0. Ig ；CaCl2 ·2Η20 :0. 05g ;加蒸馏水至 10OmT,η 自然 pH 4. 8,15 磅/cm2,灭菌 20min。B :琼脂粉2g ;蒸懼水IOOmL ；15 磅 /cm2,灭菌 20min。C =Na2S2O3 2g ；FeS04 · 7H20 :0. 006g ;蒸馏水 10ml，过滤除菌。
A和B分别煮沸后冷却至80°C混合，然后加入C混匀，制备固体平板。上述大肠杆菌和喜温硫杆菌的接合固体培养基配方在喜温硫杆菌 Starky-Na2S2O3固体培养基的A液中加入O. 05%酵母粉。上述无机盐洗涤液配方(NH4) 2S04 0. 6g ；KH2PO4 :0. 6g ；MgS04 · 7H20 :0. Ig ；CaCl2 · 2H20 :0. 05g ;加蒸馏水至 200mL,自然 pH, 15 磅 /cm2,灭菌 2Omin0 上述高pH磷酸缓冲溶液配方 NaCl 8g, KCl O. 2g, Na2HPO4 :1. 44g, KH2PO4 :0. 24g，溶于 800ml 高纯水中，HCl 调 pH至7. 4，用纯水定容至IL ;高压灭菌，4°C保存。
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权利要求
1.一种无痕敲除嗜酸性喜温硫杆菌染色体基因或将外源基因插入嗜酸性喜温硫杆菌染色体的方法，步骤包括构建同源重组的自杀型质粒载体，在载体的多克隆位点处插入同源臂得到同源重组质粒，将构建的同源重组质粒通过化学转化法转入大肠杆菌SMlO菌株， 通过接合转移法将同源重组质粒从E. coli SMlO菌转入嗜酸性喜温硫杆菌中，平板筛选单交换子并进一步鉴定，构建大范围核酸内切酶I-SceI的表达质粒并用电转化法转入单交换子中，平板筛选双交换子并进一步鉴定；其中所述自杀型质粒载体是pSDUDI，质粒pSDUDI的核苷酸序列如SEQ ID No. I所示； 所述同源重组质粒是pSDUDI- Δ soxYZ,将其从E. coli SMlO菌转入嗜酸性喜温硫杆菌中的方法是将收集到的E. coli SMlO和嗜酸性喜温硫杆菌菌液按照I : 3的比例混合后， 取50ul滴到接合平板上的滤菌膜上，37°C放置48h后，用5mL洗涤液洗涤滤膜，得到的细胞悬液梯度稀释后涂布加入卡那霉素的Starky-Na2S2O3固体培养基上，37 °C，培养7 10天； 所述平板筛选单交换子并进一步鉴定的方法是挑取筛选平板上的菌落，溶于无菌水中，取菌液为模板，使用引物oriT EcoR sen和oriT Sal ant特异性扩增自杀型质粒载体上接合转移基因oriT，并以野生型菌株染色体为模板作为阴性对照，以质粒pSDUDI-Λ soxYZ 为模板作为阳性对照，琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，正对照所在的泳道会产生740bp的 PCR产物条带；负对照在相应的区域则无PCR产物条带；挑取的验证样品中，若在相应区域产生与正对照相似的条带，为单交换子，若无条带产生与负对照相似，为假阳性；对单交换子进一步鉴定方法是提取单交换子染色体，在被敲除基因的同源臂外侧设计引物 2520YANZH sen和2520YANZH ant用PCR扩增，并以野生型菌株染色体为阴性对照，如果琼脂糖凝胶电泳检测显示以单交换子染色体为模板PCR扩增得到的条带比阴性对照大7 8Kb，则进一步确定是单交换子，若无，则为假阳性；上述引物序列是oriT EcoR sen ATTCCGGAATTCGCTCGTCCTGCTTCTCTTCG oriT Sal ant TCACGCGTCGACCGGGATTCAACCCACTCG 2520YANZH sen CCGGGTTCCTGGTAAGTC 2520YANZH ant GCTTACTGGCACTGCGATTA所述大范围核酸内切酶I-SceI的表达质粒是pSDUl-I-Scel，质粒pSDUl-I-Sce I的核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示；所述表达质粒电转化法转入单交换子中的电转化参数是电压10，500V/cm ;电阻 400 Ω ;电容25μ F ；所述平板筛选双交换子方法是电转化后将菌悬液加入到Starky-Sci液体培养基中， 37°C，50 60rpm过夜培养后加入氯霉素，转速提高到100 120r/min再培养36_60h后， 梯度稀释涂布于加入氯霉素的筛选平板上，37°C倒置培养10 15天；在筛选平板上挑取菌落，在被敲除基因上下游150 250bp处设计引物2520test sen和2520test ant,用菌落 PCR扩增，如果琼脂糖凝胶电泳检测显示只在300 500bp处有目的条带，则初步判断是双交换子；上述引物序列是2520test sen AAATTGCGGAAAGTCTCG2520test ant TGGGTATCGGTGATGTGC所述双交换子的进一步鉴定方法是将筛选到的双交换子菌落培养后提取染色体，在被敲除基因同源臂的外侧设计引物2520YANZH sen和2520YANZH ant PCR扩增验证被敲除基因上下游区域，以双交换子染色体为模板用PCR扩增，并以野生型菌株染色体为阴性对照，如果琼脂糖凝胶电泳检测显示以双交换子染色体为模板扩增得到的产物比阴性对照小，且差值是被敲除基因的大小，则进一步确定是双交换子。
2.一种应用于嗜酸性喜温硫杆菌染色体基因无痕敲除和整合的同源重组自杀型质粒载体，其特征在于，所述质粒载体命名为pSDUDI，质粒pSDUDI的核苷酸序列如SEQ IDNo. I 所示；其中所述质粒载体必须包含接合转移基因oriT，大范围核酸内切酶I-SceI酶切位点，用于筛选的卡那霉素抗性基因Km和氨苄青霉素抗性基因Amp，以及适于同源臂插入的多克隆位点MCS。
3.如权利要求2所述的应用于嗜酸性喜温硫杆菌染色体基因无痕敲除和整合的同源重组自杀型质粒载体，其特征在于，所述插入的同源臂核苷酸片段必须大于IKb。
4.如权利要求3所述的应用于嗜酸性喜温硫杆菌染色体基因无痕敲除和整合的同源重组自杀型质粒载体，其特征在于，所述插入的同源臂核苷酸片段为I. 5Kb。
5.一种应用于嗜酸性喜温硫杆菌中表达大范围核酸内切酶的表达质粒，其特征在于， 所述质粒命名为pSDUl-1-SceI，质粒pSDUl-1-Sce I的核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示; 其中所述质粒pSDUl-1-SceI由质粒载体pSDUl，启动子tac，大范围核酸内切酶表达基因 I-SceI 构成。
全文摘要
本发明公开了一种无痕敲除嗜酸性喜温硫杆菌染色体基因或将外源基因插入染色体的方法，是将含有大范围核酸内切酶I-SceI酶切位点的同源重组质粒采用接合转移的方式转入喜温硫杆菌中，同时利用细胞自身的同源重组系统，将同源重组质粒定向插入到喜温硫杆菌染色体中，筛选到的单交换子用电转化法转入I-SceI表达质粒，在I-SceI酶切断染色体的压力下，单交换子染色体发生第二次同源重组，优化筛选到双交换菌株，实现了基因的敲除或插入。本发明同时构建了用于同源重组的自杀型质粒载体pSDUDI，和有效表达I-SceI酶的质粒pSDU1-I-SceI，为喜温硫杆菌中染色体基因的无痕敲除或整合提供了便利。本发明方法为喜温硫杆菌的深入研究和改造提供了新的途径。
文档编号C12N15/09GK102604929SQ201210089108
公开日2012年7月25日 申请日期2012年3月29日 优先权日2012年3月29日
发明者吴燕, 张成家, 林建强, 林建群 申请人:山东大学