专利名称：辣椒疫霉的pcr检测引物、含有该引物的试剂盒及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及辣椒疫霉的检测，具体地说，涉及辣椒疫霉的PCR检测引物、含有该引物的试剂盒及应用。
背景技术：
植物病原卵菌是一类重要的植物病原菌，可侵染危害多种植物，导致多种植物的毁灭性病害，如致病疫霉(Phytophthora infestans)、辣椒疫霉(P. capsici)、大豆疫霉 (P. sojae)、寄生疫霉(P. parasitic)、樟疫霉(P. cinnamomi)及冬生疫霉(P. hibemalis)分别引起马铃薯、辣椒、大豆、烟草、樟树及柑橘的重要疫病，严重年份乃至绝产。该类病菌主要以菌丝体或卵孢子在病残体或土壤中渡过不良环境而作为初侵染源，在适宜条件下，菌丝体或卵孢子均可萌发产生孢子囊-释放游动孢子，再借助雨水或气流进行传播、侵染而导致植物病害。因此，对该类病菌的初侵源或侵染寄主早期进行适时监控，利于控制病害的发生，传统的病害防控策略主要依靠品种、栽培、化防和生态调控等防治措施，这些防控措施主要在病害爆发乃至产生明显危害时才实施，忽视了对初侵染源或侵染寄主早期适时采取综合防控和高效治理措施，因而事倍功半，防效甚微，最终很难控制病害的发生与流行。辣椒疫霉(P. capsici)是我国常见辣椒病害种类，多在高温高湿的环境下侵染辣椒，如朝天椒(Capsicum annnuum)、小米辣(C. frutescens),造成疫病,而使作物大幅度减产甚至绝收。辣椒疫霉在国内也有侵染香蕉树(Hevea brasiliensis)、木瓜(Chaenomelessinensis)、胡椒(Piper nigrum)、扁叶香果兰(Vanilla planifolia)等作物的报道，因此开发辣椒疫霉的早期快速检测技术，对相关作物生产中的病害防控和无公害化具有重要的意义。近年来，PCR技术及其相关分子检测技术已广泛用于植物病原菌消长动态的分子检测与预警，主要利用核糖体rDNA/ITS序列设计特异性引物来对植物致病菌进行快速检测。然而针对大豆疫霉、致病疫霉、辣椒疫霉、寄生疫霉、冬生疫霉的分子检测技术研究结果表明，部分疫霉种间ITS序列差异很小，分辨度不高。Enl基因是烯醇化酶(enolase)编码基因，它广泛存在于真核生物中，目前尚无针对该靶基因设计的特异性辣椒疫霉检测引物的相关报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种可快速、准确地检测辣椒疫霉的特异性引物及含有该引物的试剂盒。本发明的另一目的是提供上述引物及试剂盒在检测辣椒疫霉中的应用。为了实现本发明目的，本发明的一种辣椒疫霉(Phytophthora capsici)的PCR检测引物，其包括正向引物Enl4s :5’ -TGAAGTTCACGGCCAAGGTG-3’ 和反向引物Enlla :5’ -TGAACGTGTCCTCCGTCTCA-3’。
本发明还提供含有上述PCR引物的用于检测辣椒疫霉的试剂盒，其中所述试剂盒包括引物ENL4s和ENLlS。前述试剂盒中还包括dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg2+、PCR反应缓冲液中的一种或多种。更优选地，前述试剂盒还包括标准阳性模板。本发明进一步提供上述PCR引物或试剂盒在检测辣椒疫霉中的应用，包括步骤I)提取样品中的DNA ；2)以步骤I)中提取的DNA为模板，进行PCR扩增反应；3)分析PCR产物，即对上述扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据电泳检测结果判定样品中是否含有辣椒疫霉。其中，PCR反应体系以50 ill计为
模板 DNA2^ilIOmMdNTPs4^il10|iiM 引物 ENL4s1.5^il
10|iiM$*ENLla1.5^il
5U/|iil Taq DNA聚合酶0.5pl 10 x PCR反应缓冲液50
0. IM Mg2+I^il
ddH20补足至500。PCR反应条件为95°C 3分钟；94°C 40秒，54°C 50秒，72°C I分钟，共35个循环；72 0C 10 分钟。扩增反应结束后，若电泳检测结果出现约200bp的DNA条带，则该样品含有辣椒疫
霉病菌。本发明分析了辣椒疫霉和其他疫霉菌在Enl和Ypt基因序列上的差异，发现了数个高度特异且只存在于辣椒疫霉中的位点，共设计出四对辣椒疫霉特异性引物Enl2s/Enl3a、Enl4s/Enlla、Ypt2s/Ypt3a和 Ypt2s/Ypt5a,从中选定灵敏性最强的 Enl4s/Enlla 引物对，并在此基础上建立了检测辣椒疫霉的PCR体系。四对辣椒疫霉特异性引物的碱基序列如表I所示表I本发明涉及的辣椒疫霉特异性引物序列
权利要求
1.辣椒疫霉(Phytophthoracapsici)的PCR检测引物,其特征在于,其包括 正向引物 Enl4s :5’ -TGAAGTTCACGGCCAAGGTG-3’ 和反向引物 En I I a : 5 ’ -TGAACGTGTCCTCCGTCTCA-3，。
2.含有权利要求I所述引物的用于检测辣椒疫霉的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括引物ENL4s和ENLlS。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括dNTPs、TaqDNA聚合酶、Mg2+、PCR反应缓冲液中的一种或多种。
4.根据权利要求2或3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括标准阳性模板。
5.权利要求I所述引物或权利要求2-4任一项所述试剂盒在检测辣椒疫霉中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，包括以下步骤 1)提取样品中的DNA； 2)以步骤I)中提取的DNA为模板，进行PCR扩增反应； 3)分析PCR产物。
7.根据权利要求5或6所述的应用，其特征在于，PCR反应体系以50计为模板 DNA2^il IOmMdNTPs4^il10|iiM 引物 ENL4s1.5^il 10|iiM$*ENLla1.5^il 5U/|iil Taq DNA聚合酶0.5pl 10 x PCR反应缓冲液50 0. IM Mg2+I^ilddH20补足至500。
8.根据权利要求5或6所述的应用，其特征在于，PCR反应条件为95°C3分钟；94°C40秒，54°C 50秒，72°C I分钟，共35个循环；72°C 10分钟。
全文摘要
本发明提供辣椒疫霉的PCR检测引物，所述引物包括ENL4s和ENL1a(如Seq ID No.1和2所示)。本发明基于辣椒疫霉和其他疫霉菌的Enl和Ypt基因的序列差异，共获得四对可快速检测辣椒疫霉病菌的特异性引物Enl2s/Enl3a、Enl4s/Enl1a、Ypt2s/Ypt3a和Ypt2s/Ypt5a，其中Enl4s/Enl1a灵敏度最高。在此基础上建立PCR检测体系，可从发病植物组织及土壤中复杂的病原菌环境快速、准确地检测出辣椒疫霉。根据该方法构建的检测试剂盒操作简便，特异性好，灵敏度高，可对辣椒疫霉的各种形态的繁殖体如菌丝、卵孢子和游动孢子等进行检测，对辣椒疫霉疫情的早期预警、疫区的病原监测等方面具有重要意义。
文档编号C12Q1/04GK102643903SQ20121009349
公开日2012年8月22日 申请日期2012年3月31日 优先权日2012年3月31日
发明者孙翔, 郭良栋 申请人:中国科学院微生物研究所