专利名称：一种疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶的制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种脂肪酶，尤其涉及一种疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶；另外，本发明还涉及该疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶的制备方法和应用。
背景技术：
脂肪酶广泛地存在于动植物和微生物中。植物中含脂肪酶较多的是油料作物的种子，如蓖麻子、油菜子，当油料种子发芽时，脂肪酶能与其他的酶协同发挥作用催化分解油脂类物质，提供种子生根发芽所必需的养料和能量；动物体内含脂肪酶较多的是高等动物的胰脏和脂肪组织，在肠液中含有少量的脂肪酶，用于补充胰脂肪酶对脂肪消化的不足，在肉食动物的胃液中含有少量的丁酸甘油酯酶。在动物体内，各类脂肪酶控制着消化、吸收、 脂肪重建和脂蛋白代谢等过程；细菌、真菌和酵母中的脂肪酶含量更为丰富。由于微生物种类多、繁殖快，具有比动植物更广的作用PH值、作用温度范围以及底物专一性，且微生物来源的脂肪酶一般都是分泌性的胞外酶，适合于工业化大生产和获得高纯度样品，因此微生物脂肪酶是工业用脂肪酶的重要来源。脂肪酶是一类具有多种催化能力的酶，在脂质代谢中发挥着重要的作用。在油水界面上，脂肪酶催化三酰甘油的酯键水解，释放更少酯键的甘油酯或甘油及脂肪酸。也可以催化其他一些水不溶性酯类的水解、醇解、酯化、转酯化及酯类的逆向合成反应，除此之外还表现出其他一些酶的活性，如磷脂酶、溶血磷脂酶、胆固醇酯酶、酰肽水解酶活性等。脂肪酶不同活性的发挥依赖于反应体系的特点，如在油水界面促进酯水解，而在有机相中可以酶促合成和酯交换。脂肪酶反应条件温和，具有优良的立体选择性，并且不会造成环境污染，因此，在食品、皮革、医药、饲料、洗涤剂和造纸等许多工业领域中均有广泛的应用。一、脂肪酶在食品工业中的应用I.脂肪酶在面类食品加工中的应用面类制品的口感主要与小麦粉中的蛋白质、淀粉、脂肪等有关，特别是通过蛋白质的定向和形成网眼结构产生弹性，增加面的黏弹性。在面类食品加工中，以手工方式沿着压延方向进行多方面揉压，或是以机械方式沿着单一方向进行长时间的压延，都会增加面的弹性、提高面类食品的质量，但采用上述两种方法比较耗时。在面类食品生产时，可以将溶解有脂肪酶的水直接加入面粉中，然后在常温下放置一段时间进行压延处理，添加脂肪酶后产品品质会得到大幅度提高。脂肪酶能催化面粉中甘油三酯水解生成甘油二酯，甘油一酯或甘油。它对面团有强筋作用，能够提高面包的入炉急胀，增大面包体积，且对面包芯有二次增白作用。2.脂肪酶在食用油脂工业上的应用2. I酶促油脂水解将油脂与水一起在催化剂作用下生成脂肪酸和甘油的反应叫油脂水解反应，它在脂肪酸与肥皂工业上被广泛应用。传统的油脂水解反应使用无机酸、碱及金属氧化物等化学物质作为催化剂，需要高温、中高压、长时间及设备耐腐蚀的条件，其成本高、能耗大、操作安全性差，而且产物脂肪酸颜色深或生热聚合，不适用于热敏性油脂，如含共轭酸的油脂、易发生共轭化的油脂、易发生脱水的含油脂鱼油等。脂肪酶水解法可以克服以上缺点， 防止常规法中极易出现的副反应，可为食品工业提供优质的原料。2. 2酶促酯交换将一种酯与另一种脂肪酸或醇或酯混合并伴随酰基交换生成新酯的反应叫酯交换反应。这是油脂工业常用来进行油脂改性的一种重要手段。传统的酯交换工艺采用的是化学方法，但会产生许多副产品。如果用非特异性脂肪酶来催化甘三酯的酯交换，也会得到与化学法酯交换类似的结果。可以改善食用油的质量，开发新食用油的品种，提高食用油的
营养价值。3.脂肪酶在乳品工业中的应用脂肪酶应用于乳酯水解，包括奶酪和奶粉风味的增强、奶酪的熟化、代用奶制品的生产、奶油及冰淇淋的酯解改性等。脂肪酶作用于乳酯并产生脂肪酸，能赋予奶制品独特的风味。脂肪酶释放的短碳链脂肪酸(C4-C6)使产品具有一种独特强烈的奶风味，而释放的中碳脂肪酸(C10-C14)使产品具有皂似的风味。同时，由于脂肪酸参与到类似微生物反应的过程中，增加了一些新风味物质，如甲基酮类、风味酯类和乳酯类等。4.脂类的合成脂肪酶还可以催化甘油脂的合成，合成食用香料脂。在有机溶剂中催化合成低分子量羧酸酯系列香精酯、萜烯醇酯、中长链脂肪酸短链醇酯及长链脂肪酸长链脂肪醇酯等系列产品为食品工业提供新型的天然食品添加剂。多聚甘油和碳水化合物脂肪酸酯可以作为工厂的洗涤剂和各种食品配方(低脂肪的酱料、沙司、冰激凌和蛋黄酱等)的乳化剂而被广泛使用，用脂肪酶在适当的条件下可以合成功能相似的表面活性剂单酯和二酯。二、脂肪酶在皮革工业中的应用在皮革上主要是用于猪，牛和羊皮的脱脂，动物皮中的脂肪含量较高，如不进行完全脱脂处理，得不到优质的产品。用脂肪酶脱脂比碱法脱脂效果好，不伤害胶原纤维，皮革柔软、易于染色。也可以配合蛋白酶一起脱毛，比单独使用蛋白酶的效果要好。在鞣制软化的工序中，同蛋白酶、胰酶一起使用，能够缩短媒染的时间，而且皮革柔软性、透气性、丝光感均比较好，皮品无油腻感、丰满、弹性好，使用中无副作用。三、脂肪酶在纺织工业上的应用生丝中除了含有丝胶外，还含有油脂和蜡质等杂质，在织造的过程中，也会沾染上油脂，影响了丝纤维的光泽、手感以及染色等方面的性能。常用的方法有皂碱法和腐化法。 前一种方法效果不理想且会污染环境，后一种方法劳动强度大且周期长。用脂肪酶和蛋白酶同时除蜡和脱胶处理后，丝纤维的失重率、润湿性、染料上染率、显微结构、手感和光泽等性能均得到改善，丝纤维其纵向表面更加干净，吸水性更好。在羊毛纤维表面上有一层鳞片层，是导致毡缩、染色和手感不好的一个关键因素，传统的方法是用有机氯法去除，但对环境带来很大的危害。用脂肪酶来去除这些脂类物质，羊毛的毡缩性可以得到改善。在棉纤维上用脂肪酶、淀粉酶和蛋白酶一起精练，纤维的白度增加，染色上染率提高，染色瑕疵减少， 变得更加柔软。四、脂肪酶在饲料工业中的应用脂肪在畜禽体内的作用主要是氧化供能，它含有的能量是碳水化合物的2. 25倍，可满足动物体对较高能量浓度的要求；脂肪是脂溶性维生素和某些激素的溶剂，促进对这些物质的吸收和利用，同时为畜禽提供必需的不饱和脂肪酸，保证畜禽的健康生长；添加脂肪还可减少饲料加工过程中的粉尘，改善饲料外观，在高温条件下，还有利于提高能量摄入量，降低畜禽的体热增耗，减缓热应激。此外，添加脂肪可有效地提高饲料的适口性。因此， 在猪、鸡和奶牛饲养中，在饲料中添加脂肪是比较普遍的。脂肪酶是脂肪代谢最基本的酶，若缺乏将会危及机体健康。单胃动物自身能够分泌淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶等内源性消化酶。但幼禽幼畜消化机能尚未发育健全，内源性消化酶分泌量不足。在现代养猪生产中，为了缩短母猪繁殖周期和使仔猪尽早适应植物蛋白日粮，早期断奶甚至超早期断奶在养猪生产中普遍实施，但早期断奶产生明显应激，对消化系统发育和消化酶分泌产生不良影响，消化酶分泌急剧减少，断奶2周后才又逐渐恢复与上升。断奶后两周内消化酶分泌不足是断奶仔猪生长阻滞的主要因素之一；雏鸡大多数消化酶在2周龄左右才发育到高峰，个别的(如脂肪酶)还要到21日龄左右。因此，消化酶分泌不足是雏鸡对饲料利用的主要限制因素之一。在幼禽幼畜日粮中添加外源性脂肪酶、 淀粉酶、蛋白酶等，能补充体内内源酶的不足，并能减轻断奶仔猪的断奶应激，提高动物的生产性能。五、脂肪酶在造纸行业中的应用造纸木材除纤维素、木质素和半纤维素这三种主要成分外，在某些原料中还含有少量的树脂。树脂包括树脂酸、脂肪酸及其酯，还含有非皂化物如萜烯、高碳醇等。在洗选漂工段，树脂沉积在筛浆机筛板等，这些沉积物可能脱落并堵塞筛板和锥形除碴器，从而大大降低筛选、净化效率和影响浆的质量。在抄造工段，树脂沉积在毛毯，吸水箱，浆池、筛板、 流浆箱、造纸网、伏辊、压榨辊、烘缸，压光辊上等。降低脱水效率及纸页的匀度和强度，或形成树脂斑点和孔洞，甚至还引起的断头，降低纸质量。同时增加设备的清洗和维修时间，导致产量下降。而且制浆造纸废水中的树脂是非漂白废水毒性的主要来源。传统的树脂控制主要应用化学反应方法进行控制，使树脂附着在纤维表面或稳定地分散在纸浆系统中，从而避免树脂在制浆造纸设备上的沉积。但对树脂的消除效率相对较低，用量大，容易造成设备磨损等不利影响。用脂肪酶去除纸浆中的树脂，包括三酸甘油酯及蜡，避免造纸过程中树脂沉积在设备上，影响设备的运转，防止纸品断头、严重破裂的情形。疏棉状嗜热丝孢菌是一种分布广泛、生长上限温度较高的真菌，它能够产生热稳定的具有重要工业价值的脂肪酶，即疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶，但是野生菌产酶存在培养温度高等较多不利因素，因而近年来主要研究方向集中于采用基因工程方法构建重组菌， 进而表达获得脂肪酶。目前尚未有采用里氏木霉来表达疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶的相关报道。
发明内容
本发明要解决的技术问题之一是提供一种疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶的制备方法。本发明要解决的技术问题之二是提供采用上述方法制得的疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶。本发明要解决的技术问题之三是提供该疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶的应用。为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案
5
在本发明的一方面，提供一种疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶的制备方法，该方法包括如下步骤I)疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶基因的合成；2)疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶表达质粒的构建；3)里氏木霉的转化与疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶高产菌株的筛选；4)疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶的分离与提纯。步骤I)中，合成的疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶基因的序列如SEQ ID NO. I所示，合成的基因编码更加符合里氏木霉高效表达的基因编码。步骤2)具体为将步骤I)所得的产物由SpeI和XhoI限制性内切酶降解后，用琼脂糖凝胶分离，纯化回收连接，然后通过T4 DNA连接酶连接，转化大肠杆菌DH5ci通透细胞，通过分析筛选提取质粒，完成疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶表达质粒的构建。步骤3)具体为首先，用EcoRI降解步骤2)构建的质粒形成质粒片段，采用化学转化方法将该质粒片段转入里氏木霉RUT C-30宿主细胞；然后在含有潮霉素B的PDA培养基上培养，再将生长旺盛的菌落接种置PDA培养基上，通过生长和发芽，将孢子再转移到新鲜PDA培养基上，以分离纯化转代稳定的转化子，将这些转化子的孢子接种在木霉纤维素酶诱导培养液(所述木霉纤维素酶诱导培养液的PH值为4. 8，用乳糖作为诱导物)，培养后，采样离心，取上清液进行SDS-PAGE电泳分析。步骤4)完成后，得到的疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶的氨基酸序列如SEQ ID NO. 2或 SEQ ID NO. 3 所示。在本发明的另一方面，提供采用上述制备方法制得的疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶。在本发明的另一方面，提供一种上述疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶在制备面制食品中的应用。例如，所述面制食品为慢头。本发明采用化学方法人工合成疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶基因，然后进行疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶表达质粒的构建，再进行里氏木霉的转化与疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶高产菌株的筛选(本发明是首次采用里氏木霉来表达疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶)，由此得到的疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶经实验验证在制备馒头中对馒头白度改进效果明显。
图I是本发明实施例I中用于疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶在里氏木霉表达质粒 pTrTLL的示意图。图2是本发明实施例I中SDS-PAGE分析里氏木霉表达疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶 TLL的示意图,其中，1-12表示转化子的编号，M表示标准蛋白。图3是本发明实施例I中异源表达疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶TLL的纯化结果示意图，其中，M道表示标准蛋白；1，2，3道分别为5，10和4微克纯化后的TLL蛋白。图4是本发明实施例I中疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶TLL的pH曲线示意图。图5是本发明实施例I中疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶TLL的温度曲线示意图。
具体实施例方式以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人,分子克隆实验室手册(New York Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例I疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶的制备I.微生物和质粒材料用于克隆的大肠杆菌DH5 a由Invitrogen公司提供。用于提供脂肪酶基因资源和高效表达宿主为里氏木霉 RUT C-30,从 American Type Culture Collection(ATCC)购买，起始质粒pBluescipt KS( 一 )从Stratagene公司购买。2.疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶(TTL)基因的人工合成及表达质粒的构建委托Life Technologies Corporation采用本领域常规的化学方法人工合成了编码疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶(LipA)基因(SEQ ID NO. I)，合成的基因编码更加符合里氏木霉高效表达的基因编码。为了克隆的方便，5’端增加了 SpeI酶切位点而3’端增加了 XhoI 酶切位点。LipA DNA片段和里氏木霉表达质粒pT3C(编码号，EF127533，Li et al.， 2007. Appl. Microbiol. Biotechnol. 74 :1264-1275)由 SpeI 和 XhoI 限制性内切酶降解后， 用琼脂糖凝胶电泳分离，LipA降解后的条带及pT3C降解后的10. Okb和0. 7kb的两条带。 将LipA的0. 9kb和pT3C的10. Okb条带从胶中切割并提纯，然后将它们用T4DNA连接酶连接，转化大肠杆菌DH5 a通透细胞，通过分析八个转化子中的质粒，然后通过顺序测定获得了编码LipA的里氏木霉表达质粒。需要说明的是在原始pT3C质粒中3’端为PstI位点， 通过突变转换成了 XhoI位点，这里构建的质粒为pTrTLL(见图I)。3.里氏木霉的转化与脂肪酶高产菌株的筛选本发明使用了里氏木霉RUT C-30为宿主细胞，采用化学转化的方法(Penttila et al. ,1987 Gene 61 =155-164)将用EcoRI限制内切酶降解后的pTrTLL质粒片段转入宿主细胞，然后在含有潮霉素B的土豆葡萄糖琼脂(PDA)培养基上培养，潮霉素B从Roche公司购买，5天后将生长旺盛的菌落接种置PDA培养基上，通过6天生长和发芽，将孢子再转移到新鲜PDA培养基上，以分离纯化传代稳定的转化子。通过此方法，得到12个传代稳定的转化子，将这些转化子的孢子接种在木霉纤维素酶诱导培养液，此培养液PH 4. 8，用乳糖作为诱导物，在三角瓶中培养6天后，采样离心，取上清液，用聚丙酰胺凝胶电泳(SDS-PA6E)加考马斯蓝染色，通过此分析，发现12个转化子中，第二和八号转化子产生一条大约30，000 道尔顿的蛋白条带(见图2)。而且采用中国脂肪酶国家标准分析方法(GB/T 23535-2009) 测得的脂肪酶活力如表一所示。可以看出，SDS-PAGE胶上30，000道尔顿条带的深浅与酶活水平高度相关。进一步证明30，000道尔顿的蛋白为本发明的脂肪酶。表一里氏木霉表达疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶TLL基因转化子培养液中脂肪酶活力
编号活力(U/ml)I2. 53216权利要求
1.一种疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶的制备方法，其特征在于，该方法包括如下步骤1)疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶基因的合成；2)疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶表达质粒的构建；3)里氏木霉的转化与疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶高产菌株的筛选；4)疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶的分离与提纯。
2.如权利要求I所述的疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶的制备方法，其特征在于，步骤I)中， 合成的疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶基因的序列如SEQ ID NO. I所示，合成的基因编码更加符合里氏木霉高效表达的基因编码。
3.如权利要求I所述的疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶的制备方法，其特征在于，步骤2)具体为将步骤I)所得的产物由SpeI和XhoI限制性内切酶降解后，用琼脂糖凝胶分离，纯化回收连接，然后通过T4 DNA连接酶连接，转化大肠杆菌DH5ci通透细胞，通过分析筛选提取质粒，完成疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶表达质粒的构建。
4.如权利要求I所述的疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶的制备方法，其特征在于，步骤3)具体为首先，用EcoRI降解步骤2)构建的质粒形成质粒片段，采用化学转化方法将该质粒片段转入里氏木霉RUT C-30宿主细胞；然后在含有潮霉素B的PDA培养基上培养，再将生长旺盛的菌落接种置PDA培养基上，通过生长和发芽，将孢子再转移到新鲜PDA培养基上，以分离纯化转代稳定的转化子，将这些转化子的孢子接种在木霉纤维素酶诱导培养液，培养后，采样离心，取上清液进行SDS-PAGE电泳分析。
5.如权利要求4所述的疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶的制备方法，其特征在于，所述木霉纤维素酶诱导培养液的PH值为4. 8，用乳糖作为诱导物。
6.如权利要求I所述的疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶的制备方法，其特征在于，步骤4)完成后，得到的疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶的氨基酸序列如SEQ ID NO. 2或SEQ ID NO. 3所示。
7.一种采用权利要求1-6任一项所述的制备方法制得的疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶。
8.—种如权利要求7所述的疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶在制备面制食品中的应用。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述面制食品为馒头。
全文摘要
本发明公开了一种疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶的制备方法，包括如下步骤1)疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶基因的合成；2)疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶表达质粒的构建；3)里氏木霉的转化与疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶高产菌株的筛选；4)疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶的分离与提纯。本发明还公开了上述疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶在制备面制食品中的应用。
文档编号C12N15/80GK102604913SQ20121009746
公开日2012年7月25日 申请日期2012年4月5日 优先权日2012年4月5日
发明者唐鹏, 张民, 张珊嘉, 李新良, 段园园, 王锡珍, 马天画 申请人:上海尤特尔生化有限公司, 湖南尤特尔生化有限公司