专利名称：微生物发酵生产谷氨酸脱氢酶的方法
技术领域：
本发明涉及微生物学、酶工程、发酵工程、生物化学等领域，具体涉及一种谷氨酸脱氢酶微生物发酵生产方法。该发明生产的谷氨酸脱氢酶主要应用于临床肝炎、胃病、胰腺炎的诊断以及其它谷氨酸脱氢酶医用诊断行业。鉴于谷氨酸脱氢酶是一种微生物产生的蛋白质，且无毒、无副作用，可以广泛应用于医用诊断试剂盒的生产。
背景技术：
谷氨酸脱氢酶(Glutamate dehydrogenase,简写为⑶H)是一种依赖辅酶的不需氧脱氢酶，在氨基酸代谢中占有重要地位。它分为NADH依赖型(EC. I. 4. I. 2)、NAD (P) H依赖型(EC. I. 4. I. 3)和NADPH依赖型(EC. I. 4. I. 4)三种类型，广泛存在于动物、植物和微生 物中，并广泛应用于临床肝炎、胃病、胰腺炎等疾病诊断行业中(胡汉宁等，武汉大学学报，2001)，目前检测肝病的酶制剂主要是谷丙转氨酶(ALT)，但其特异性较差，不能完全反映肝细胞损坏程度(郭绍丽等，中国中西医结合消化杂志，2001)。随着GDH试剂盒在医用诊断行业的应用，以及其GDH特异性高，无毒副作用等优点，使其更适于常规肝功能测定及其他疾病检测项目，特别是慢性肝病患者肝损伤程度判断、疗效观察和病情监测的疾病监测项目(曹燕等，上海医学检验杂志，2003)。早期生产GDH的方法是从动物脏器中提取，所得酶系复杂，很难得到高纯度的酶(王燕等，生物工程学报，2003)，而通过微生物发酵法则容易制得。目前关于微生物GDH研究主要集中在菌株选育、发酵条件优化、酶学性质，酶分离纯化及基因克隆等研究阶段(王燕等，生物工程学报，2003)，而微生物发酵生产⑶H的产业化、规模化还未见报道。微生物发酵生产的⑶H纯度高，发酵生产工艺简单，提取步骤简易，酶的纯化工艺稳定，生产不受原料来源影响，更适用于批量生产，且微生物发酵生产的GDH在医用诊断、检测精密度上要高于其他方法生产的⑶H。因此，微生物发酵生产的⑶H具有非常广阔的开发潜力和应用前景。
发明内容
本发明是提供一种微生物发酵生产⑶H的方法，该发明主要是微生物经过产物定向驯化后，在24 30°C液体发酵生产⑶H的方法，这种生产方法获得的⑶H液活性可以达到145U/mL，如再经过分离和纯化，可以得到不同浓度和纯度的酶制剂。该方法生产的微生物发酵GDH操作简单、方便、快捷、成本低，可以从根本上避免动物组织提取的繁琐工艺和昂贵的设备。本发明所述的一种微生物发酵生产谷氨酸脱氢酶的方法具体包括以下步骤(I)将产生谷氨酸脱氢酶的微生物进行6 10次活化，再经过产物定向驯化4 6次，使其在24 30°C环境条件下生长良好；(2)按常规方法将产物定向驯化后的谷氨酸脱氢酶产生菌在24 30°C逐级扩大培养，制备成液体一级种子和二级种子；(3)将液体一级种子或二级种子，按发酵液体积的3 9%接种量接入液体发酵培养基中，在24 30°C培养60 114h时，即微生物发酵生产谷氨酸脱氢酶结束；(4)将(3)的发酵液在6，000 8，OOOrpm离心收集液体，用蒸馏水洗涤数次之后离心收集沉淀；(5)将沉淀悬浮于缓冲液中，加石英砂研磨破碎，10，000 14，OOOrpm离心，收集到的上清为谷氨酸脱氢酶粗酶液；
(6)根据不同需要和使用对象不同，将(5)得到的粗酶液进一步浓缩、分离纯化，制备成不同活性、纯度和剂型的酶制剂。本发明中使用的菌种来源于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，初期活化和生长条件按菌种保藏单位提供的说明进行。谷氨酸脱氢酶产生菌(CGMCC菌种编号1. 495或I. 581)，菌株先活化、定向驯化后，按本发明产酶条件发酵生产谷氨酸脱氢酶，定向驯化后的菌株在4°C环境中可保存2个月，用10 25%甘油制成的菌悬液、在零下80°C条件下可以长期保藏。
具体实施例方式实施例一(I)培养基制备①菌种活化培养基牛肉膏10. 0g，蛋白胨10. Og, NaCl 5. 0g，葡萄糖10. 0g，蒸馏水I. 0L, pH值7. 0 7. 2，121°C高压蒸汽灭菌30min。②菌种定向驯化培养基葡萄糖8. 0 12. 0g，蛋白胨18. 0 22. 0g，牛肉膏16. 0 24. 0g, NaCl 4. 0 6. 0g, pH 值自然，121°C高压蒸汽灭菌 30min。③液体种子培养基葡萄糖22. 0 26. Og,玉米浆24. 0 28. Og,尿素I. 5 3. 5g, K2HPO4 I. 0 2. 5g, MgSO4 0. 4 0. 8g, FeSO4 0. 002 0. 006g, MnSO4 0. 004
0.008g,自来水1.01，？11值自然，1211高压蒸汽灭菌30min。④发酵产酶培养基葡萄糖25. 0 45. Og,玉米衆4. 0 8. Og,尿素4. 0 6. Og,K2HPO4 0. 5 2. 5g, FeSO4 0. 001 0. 004g, MgSO4 5. 0 7. 0g, MnSO4 0. 002 0. 005g,自来水I. 0L, pH值自然，121°C高压蒸汽灭菌30min。(2)将产生谷氨酸脱氢酶的微生物按中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)提供的菌株说明进行6 10次活化，再经过产物定向驯化4 6次，使其在24 30°C环境条件下生长良好；(3)按常规方法将产物定向驯化后的谷氨酸脱氢酶产生菌在24 30°C培养36 60h而后按5%的接种量进行逐级扩大培养，制备成液体一级种子和二级种子；(4)将(3)制备的二级种子按发酵液体积的3% 5%接种量接入10L的发酵产酶培养基中，在24 26°C培养96 114h时，即微生物发酵生产谷氨酸脱氢酶结束；(5)将(4)的发酵液在6，000 8，OOOrpm离心收集液体，用蒸馏水洗涤数次之后离心收集沉淀；(6)将沉淀悬浮于缓冲液中，加石英砂研磨破碎，10，000 14，OOOrpm离心，收集到的上清即为谷氨酸脱氢酶粗酶液；(7)根据不同需要和使用对象不同，将(6)得到的粗酶液进一步浓缩、分离纯化，制备成不同活性、纯度和剂型的酶制剂。
实施例二 (I)培养基制备①菌种活化培养基牛肉膏10. 0g，蛋白胨10. Og, NaCl 5. 0g，葡萄糖10. 0g，蒸馏水I. 0L, pH值7. 0 7. 2，121°C高压蒸汽灭菌30min。②菌种定向驯化培养基葡萄糖8. 0 12. 0g，蛋白胨18. 0 22. 0g，牛肉膏16. 0 24. 0g, NaCl 4. 0 6. 0g, pH 值自然，121°C高压蒸汽灭菌 30min。③液体种子培养基葡 萄糖22. 0 26. Og,玉米浆24. 0 28. Og,尿素L 5
3.5g, K2HPO4 I. 0 2. 5g, MgSO4 0. 4 0. 8g, FeSO4 0. 002 0. 006g, MnSO4 0. 004
0.008g,自来水1.01，？11值自然，1211高压蒸汽灭菌30min。④发酵产酶培养基葡萄糖25. 0 45. Og,玉米衆4. 0 8. Og,尿素4. 0 6. Og,K2HPO4 0. 5 2. 5g, FeSO4 0. 001 0. 004g, MgSO4 5. 0 7. 0g, MnSO4 0. 002 0. 005g,自来水I. 0L, pH值自然，121°C高压蒸汽灭菌30min。(2)将产生谷氨酸脱氢酶的微生物按中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)提供的菌株说明进行6 10次活化，再经过产物定向驯化4 6次，使其在24 30°C环境条件下生长良好；(3)按常规方法将产物定向驯化后的谷氨酸脱氢酶产生菌在24 30°C培养36 60h而后按5%的接种量进行逐级扩大培养，制备成液体一级种子和二级种子；(4)将(3)制备的二级种子按发酵液体积的5% 7%接种量接入50L的发酵产酶培养基中，在26 28°C培养78 96h时，即微生物发酵生产谷氨酸脱氢酶结束；(5)将(4)的发酵液在6，000 8，OOOrpm离心收集液体，用蒸馏水洗涤数次之后离心收集沉淀；(6)将沉淀悬浮于缓冲液中，加石英砂研磨破碎，10，000 14，OOOrpm离心，收集到的上清即为谷氨酸脱氢酶粗酶液；(7)根据不同需要和使用对象不同，将(6)得到的粗酶液进一步浓缩、分离纯化，制备成不同活性、纯度和剂型的酶制剂。实施例三(I)培养基制备①菌种活化培养基牛肉膏10. 0g，蛋白胨10. 0g, NaCl 5. 0g，葡萄糖10. 0g，蒸馏水I. 0L, pH值7. 0 7. 2，121°C高压蒸汽灭菌30min。②菌种定向驯化培养基葡萄糖8. 0 12. 0g，蛋白胨18. 0 22. 0g，牛肉膏
16.0 24. 0g, NaCl 4. 0 6. 0g, pH 值自然，121°C高压蒸汽灭菌 30min。③液体种子培养基葡萄糖22. 0 26. Og,玉米浆24. 0 28. Og,尿素I. 5
3.5g, K2HPO4 I. 0 2. 5g, MgSO4 0. 4 0. 8g, FeSO4 0. 002 0. 006g, MnSO4 0. 004
0.008g,自来水1.01，？11值自然，1211高压蒸汽灭菌30min。④发酵产酶培养基葡萄糖25. 0 45. Og,玉米衆4. 0 8. Og,尿素4. 0 6. Og,K2HPO4 0. 5 2. 5g, FeSO4 0. 001 0. 004g,MgS04 5. 0 7. 0g，MnSO4 0. 002 0. 005g,自来水I. 0L, pH值自然，121°C高压蒸汽灭菌30min。(2)将产生谷氨酸脱氢酶的微生物按中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)提供的菌株说明进行6 10次活化，再经过产物定向驯化4 6次，使其在24 30°C环境条件下生长良好；(3)按常规方法将产物定向驯化后的谷氨酸脱氢酶产生菌在24 30°C培养36 60h而后按5%的接种量进行逐级扩大培养，制备成液体一级种子和二级种子；(4)将(3)制备的二级种子按发酵液体积的7% 9%接种量接入100L的发酵产酶培养基中，在28 30°C培养60 78h时，即微生物发酵生产谷氨酸脱氢酶结束；(5)将⑷的发酵液在6，000 8，OOOrpm离心收集液体，用蒸馏水洗涤数次之后离心收集沉淀；(6)将沉淀悬浮于缓冲液中，加石英砂研磨破碎，10，000 14，OOOrpm离心，收集到的上清即为谷氨酸脱氢酶粗酶液； (7)根据不同需要和使用对象不同，将(6)得到的粗酶液进一步浓缩、分离纯化，制备成不同活性、纯度和剂型的酶制剂。
权利要求
1.一种微生物发酵生产谷氨酸脱氢酶(简写为GDH)的方法，其包括以下步骤 (1)将产生⑶H的微生物进行6 10次活化，再经过产物定向驯化4 6次，使其在24 30°C环境条件下生长良好； (2)按常规方法将产物定向驯化后的GDH产生菌在24 30°C逐级扩大培养，制备成液体一级种子和二级种子； (3)将液体一级种子或二级种子，按发酵液体积的3 9%接种量接入液体发酵培养基中，在24 30°C培养60 114h时，即微生物发酵生产GHD结束； (4)将(3)的发酵液在6，000 8，OOOrpm离心收集液体，用蒸馏水洗涤数次之后离心收集沉淀； (5)将沉淀悬浮于缓冲液中，加石英砂研磨破碎，10,000 14，OOOrpm离心,收集到的上清为DGH粗酶液； (6)根据不同需要和使用对象不同，将(5)得到的粗酶液进一步浓缩、分离纯化，制备成不同活性、纯度和剂型的酶制剂。
2.根据权利要求I所述的方法，在步骤(6)之后进一步包括将步骤(6)得到的粗酶液进一步浓缩、分离纯化，制备成不同活性、纯度和剂型的酶制剂。
3.根据权利要求I或2所述的方法，其中菌种定向驯化培养基、液体种子培养基、发酵产酶培养基分别为 (1)菌种定向驯化培养基葡萄糖8.0 12.0g，蛋白胨18.0 22. 0g，牛肉膏16. 0 24. Og, NaCl 4. 0 6. Og, pH 值自然，121°C高压蒸汽灭菌 30min。
(2)液体种子培养基葡萄糖22.0 26. Og,玉米浆24. 0 28. Og,尿素I. 5 3. 5g，K2HPO4 I. 0 2. 5g, MgSO4 0. 4 0. 8g, FeSO4 0. 002 0. 006g, MnSO4 0. 004 0. 008g,自来水I. 0L, pH值自然，121°C高压蒸汽灭菌30min。
(3)发酵产酶培养基葡萄糖25.0 45. Og,玉米衆4. 0 8. Og,尿素4. 0 6. Og,K2HPO4 0. 5 2. 5g, FeSO4 0. 001 0. 004g,MgS04 5. 0 7. 0g，MnSO4 0. 002 0. 005g,自来水I. 0L, pH值自然，121°C高压蒸汽灭菌30min。
全文摘要
本发明所述的一种微生物发酵生产谷氨酸脱氢酶(简写为GDH)的方法是将产生GDH的微生物进行6～10次活化，再经过产物定向驯化4～6次，使其在24～30℃环境条件下生长良好；按常规方法将产物定向驯化后的GDH产生菌在24～30℃逐级扩大培养，制备成液体一级种子和二级种子；按发酵液体积的3～9％接种量接入液体发酵培养基中，在24～30℃培养60～114h时，即微生物发酵生产GDH结束；发酵液在6,000～8,000rpm离心收集菌体，数次洗涤后收集沉淀，悬浮于缓冲液中，并加石英砂研磨，10,000～14,000rpm收集上清即为粗酶液；根据不同需要和使用对象不同，可以将粗酶液进一步浓缩、分离纯化，制备成不同活性、纯度和剂型的酶制剂。
文档编号C12N9/06GK102653736SQ20121010672
公开日2012年9月5日 申请日期2012年4月12日 优先权日2012年4月12日
发明者于爽, 张庆芳, 王晓辉, 石淑钰, 窦少华, 迟乃玉 申请人:大连大学