专利名称：一种利用类波氏真眼点藻生产epa的方法
技术领域：
本发明涉及微藻领域，确切地说是指ー种利用类波氏真眼点藻生产EPA的方法。
背景技术：
二十碳五烯酸(ΕΡΑ，ω-3)是ー种多不饱和脂肪酸，它具有诸多的生物学活性，受到人们的广泛关注。最早发现EPA对人类健康有益的学者是丹麦的Bang和Dyerbery (1978)，随后，众多科学家对EPA在营养学和医学上的功能展开了深入的研究，发现EPA是前列腺素及衍生物前列环素、凝血烷、白三烯等激素类化合物的前体，具有抗血栓、降血脂、防止血小板聚结、舒张血管等功能，并对人类心脑血疾病、关节炎、肾炎等疾病有良好的防治作用，此外，EPA还能促进脑细胞的生长发育改善大脑机能，但陆生生物中EPA含量较少，天然EPA通常在海洋生物中较为丰富，如藻类、海生鱼类、某些海洋软体动物、棘皮动物等。目前，市场上的EPA产品主要来源于深海鱼油，然而其产量仅能满足世界需求量的60%，并且从鱼油中提取EPA的エ艺复杂且收率低，获得的EPA具有明显的鱼腥味，难以满足人们对产品的要求。微藻是ー类系统发生各异、个体较小、通常为单细胞或群体的、能进行光合作用的水生(或陆生、气生、共生)低等植物，是自然界起源最早、分布最广、种类和数量最多的生物质资源。在已分离的产油的微藻中，金藻纲(Chrysophyceae)、黄藻纲(Xanthophyceae)、娃藻纲(Centricae)、红藻纲(Rhodophyceae)、绿藻纲(Chlorophyceae)和隐藻纲(Cryptophyceae)中都有富含EPA的藻类，如紫球藻(Porphyridium cruentum)、三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)、球等鞭金藻(Isochrysis galbana)、眼点拟微绿球藻(Nannochloropsis oculata)、蒜头藻(Monodus subterraneus)等。目前世界上许多学者已经对微藻生产EPA进行了大量的研究工作，主要涉及藻株筛选、培养基和培养条件的优化、规模化生产等，然而目前大部分研究工作仅关注微藻是否具有较高的EPA含量，却忽略了该藻株的生物量产量，如将其用于EPA的商业化生产，很难获得成功。国内利用微生物进行EPA生产的发明专利共四项，它们分别是1)产二十碳五烯酸油脂的腐霉及该油脂的发酵制备方法(余龙江，CN101434908A)，该专利公开了ー种利用腐霉(Pythium sp.)HUST-RBB12菌种进行EPA生产的方式，其EPA产量可达2. lg/L ；2)从緑色巴夫藻制备和纯化二十碳五烯酸甲酯的方法(刘志礼，CN1544413A)，该专利主要保护由緑色巴夫藻中提取EPA的化学工艺；3) —种高产二十碳五烯酸(EPA)的希瓦氏菌基因工程菌(王风平，CN101942409A) ；4)用于高水平生产二十碳五烯酸的优化解脂耶氏酵母菌株(纳幕尔杜邦公司，CN101970638A)。国外对于微藻生产多不饱和脂肪酸(PUFAs)同样进行了大量的研究工作，目前也有几家公司已经实现了商业化生产，如Martek公司利用Nitzschia alba 进行 EPA 的生产，Omega Tech 公司利用 Thtanstochytrids sp.进行 PUFAs的生产，Nilssin Oilssin Oil mills 公司利用 Crythecodinium cohnii 进行 DHA 的生产。从深海鱼油中提取或通过微生物厌氧发酵的方式生产EPA，虽然已经实现了商业化生产，然而就技木本身而言，仍然存在下述缺点
I)鱼油的质量会受鱼的种类、捕鱼季节和地点影响；环境污染、非目的脂肪酸及鱼腥味也会影响鱼油的质量；另外，鱼油还具有加工成本高、易氧化等缺点，随着渔业资源的日益紧张，鱼油将很难满 足人们对EPA的市场需求；2)目前已分离的富含EPA的厌氧微生物种类较少，厌氧微生物生长需要丰富的培养基，且培养过程中容易受到细菌的污染，需要严格控制无菌化操作，増加了培养成本，新发现的生产EPA的厌氧微生物需要进行详细安全性评价；国外虽然有部分企业利用微藻进行EPA的生产,但其所用藻株(Nitzschia alba)需要进行异养培养，培养エ艺复杂。
发明内容
针对上述缺陷，本发明解决的技术问题在于提供ー种利用类波氏真眼点藻生产EPA的方法，可以实现EPA的高效生产。为了解决以上的技术问题，本发明提供的利用类波氏真眼点藻生产EPA的方法，其中类波氏真眼点藻的营养条件(I)NaNO3300-1500mg/L 或 NH2-CO-NH2 150-750mg/L ； (2) K2HPO4 · 3H20 20-100mg/L ； (3) MgSO4 · 7H20 50_80mg/L ； (4) CaCl2 · 2H20 30_50mg/L ； (5)NaCO3 10-30mg/L ； (6)FeCl3 · 6H20 2_6mg/L ； (7)Citric acid 4_8mg/L ； (8)EDTANa22-5mg/L ； (9) H3BO3 2_4mg/L ; (IO)MnCl2 · 4H20 ト2mg/L ; (I I) ZnSO4 · 7H20 0. 1-0. 3mg/L ；Na2MoO4 · 2H20 0. 2-0. 4mg/L ； (13) Co (NO3)2 · 6H20 0. 02-0. 05mg/L ； (H)CuSO4 · 5H200.06-0. 09mg/L ；类波氏真眼点藻的生长温度为15-30°C，光照强度为30-600yE/m2s，类波氏真眼点藻扩大培养过程如下I)由藻种保藏室获得藻种后，将获得的藻种置于500mL培养瓶中静置培养3-5天，然后转移至IOOOml的培养瓶中继续静置培养3-5天，待藻液光密度OD75tl达到I. 5后，进行第二步操作；2)转移“步骤I”中的藻株至柱状光生物反应器中通气培养，通入气体中ニ氧化碳浓度为1_5%，培养光强为150-200 μ E/m2s。3)在“步骤2”的基础上将藻株继续进行放大培养，并按接种比例20-30%，计算所
需藻液的量；4)待藻液光密度OD75tl达到2. 5后,转入室外光生物反应器中进行规模化养埴；5)规模化养殖选用尿素或硝酸盐为氮源，氮元素浓度为2_6mM，控制培养光强为100-600 μ E/m2s,培养周期 8-12 天。优选地，在“步骤I”中，由藻种保藏室获得藻种后，先利用显微镜观察藻株是否被其他微藻、原生动物或真菌污染，再进行培养。与现有技术相比，本发明提供的利用类波氏真眼点藻生产EPA的方法具有以下优点首先，类波氏真眼点藻在正常培养条件下的生物量可达8. Og/L以上，对它进行胁迫培养后，其总脂含量可占细胞干重的66% (大多为三酰甘油TAG)，脂肪酸组成分析发现，类波氏真眼点藻含有占细胞总脂肪酸含量8. 6%的EPA ；
其次，类波氏真眼点藻细胞结构简单，可以通过改变环境条件或进行相关基因的定向改造实现EPA的高产第三，利用光生物反应器可以实现类波氏真眼点藻的规模化养殖，可以减少季节和地域限制；第四，从类波氏真眼点藻中提取EPA的エ艺较鱼油中提取更为简单，并且EPA产品
无臭腥味。
图I类波氏真眼点藻的细胞形态；图2为类波氏真眼点藻的生长曲线；图3类波氏真眼点藻细胞中性脂、糖脂和磷脂含量的时相变化；图4为类波氏真眼点藻细胞中脂肪酸组成和各组分百分含量。
具体实施例方式为了本领域的技术人员能够更好地理解本发明所提供的技术方案，下面结合具体实施例进行阐述。本发明提供了ー种利用类波氏真眼点藻生产EPA的方法，该微藻拉丁名称为类波氏真眼点藻(Eustigmatoscf. polyphem),已于2011年9月13日在“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”保藏成功；地址中国科学院微生物研究所菌种保藏中心；菌种保藏号CGMCCNo. 5247。类波氏真眼点藻属于真眼点藻纲(Eustigmatophyceae)、真眼点藻目(Eustigmatales)、真眼点藻科(Eustigmataceae)、真眼点藻属(Eustigmatos),细胞为球形或近球形，大小通常在10-11 μ m,培养过程中一些细胞会达到20-35 μ m,细胞中具有一个相对较大的、近球形的液泡，其中含有能振动的颗粒物和ー个直径在3-5 μ m的色素体，它的颜色从灰黄-褐色到红褐色变化，随着培养时间的延长会变大变暗；细胞中有一周生深裂状叶绿体；繁殖方式通常形成2个D形或4个四方体的似亲孢子，或形成8到16个球形细胞，藻细胞主要色素组成为叶绿素a、堇菜黄素、无隔藻黄素、β-类胡萝卜素。图I为类波氏真眼点藻(Eustigmatoscf. polyphem)细胞形态,其中A为对数前期的营养细胞为个体较大的细胞，具分裂叶的边缘叶绿体，细胞中具明显的红色色素区及可振动的颗粒；C为个体较大的细胞，色素区变为暗红；D为个体较大的细胞，叶绿体片段化，细胞中积累较多的类胡萝卜素；E为个体较大的细胞，暗红色素分布整个细胞，并有油体形成；F为个体较大的细胞，细胞形成了许多的油体。类波氏真眼点藻在正常培养条件下的生物量可达8. Og/L以上(图2)，对其进行胁迫培养后，其总脂含量可占细胞干重的66%(大多为三酰甘油TAG)(图3)，进行脂肪酸组成分析发现细胞内EPA含量可占总脂肪酸的8.6% (图4)，是ー株非常有潜力的EPA生产藻株。通过大量的研究工作，我们提出一种通过氮源及氮浓度的调控方式，实现类波氏真眼点藻高产EPA的培养技木。类波氏真眼点藻可以利用的氮源形式有多种，如尿素、硝酸钠/硝酸钾、氯化铵等，在这些氮源形式中，尿素对类波氏真眼点藻的生长最有利，随后的尿素浓度优化试验发现，低尿素浓度可以获得较高的EPA产率，因此我们提出一种较优的类波氏真眼点藻培养方案，选用尿素或硝酸盐为氮源，氮元素浓度为2-6mM，控制培养光强为 100-600 μ E/m2s，培养周期 8-12 天。本发明提供的利用类波氏真眼点藻 生产EPA的方法，其中类波氏真眼点藻的营养条件(I)NaNO3300-1500mg/L 或 NH2-CO-NH2 150_750mg/L ； (2) K2HPO4 · 3H20 20-100mg/L ； (3) MgSO4 · 7H20 50_80mg/L ； (4) CaCl2 · 2H20 30_50mg/L ； (5)NaCO3 10-30mg/L ； (6)FeCl3 · 6H20 2_6mg/L ； (7)Citric acid 4_8mg/L ； (8)EDTANa22-5mg/L ； (9) H3BO3 2_4mg/L ; (IO)MnCl2 · 4H20 ト2mg/L ; (I I) ZnSO4 · 7H20 0. 1-0. 3mg/L ；(12) Na2MoO4 · 2H20 0. 2-0. 4mg/L ； (13) Co (NO3)2 · 6H20 0. 02-0. 05mg/L ； (H)CuSO4 · 5H200.06-0. 09mg/L ；类波氏真眼点藻的生长温度为15-30°C，光照强度为30-600yE/m2s，类波氏真眼点藻扩大培养过程如下I)由藻种保藏室获得藻种后，将获得的藻种置于500mL培养瓶中静置培养3-5天，然后转移至IOOOml的培养瓶中继续静置培养3-5天，待藻液光密度OD75tl达到I. 5后，进行第二步操作；2)转移“步骤I”中的藻株至柱状光生物反应器中通气培养，通入气体中ニ氧化碳浓度为1_5%，培养光强为150-200 μ E/m2s。3)在“步骤2”的基础上将藻株继续进行放大培养，并按接种比例20-30 %，计算所
需藻液的量；4)待藻液光密度OD75tl达到2. 5后，转入室外光生物反应器中进行规模化养殖；5)选用尿素或硝酸盐为氮源，氮元素浓度为2_6mM，控制培养光强为100-600 μ E/m2s，培养周期8-12天。在“步骤I”中，由藻种保藏室获得藻种后，先利用显微镜观察藻株是否被其他微藻、原生动物或真菌污染，再进行培养。通过优化培养体系中氮源浓度和光照強度可以实现EPA的高产，设置高、低两种光照強度和三种氮源浓度进行试验，试验结果如下表所示不同光强及氮浓度条件下类波氏真眼点藻细胞的脂肪酸组成表
权利要求
1.ー种利用类波氏真眼点藻生产EPA的方法，其特征在于，其中 类波氏真眼点藻的营养条件(I)NaNO3 300-1500mg/L 或 NH2-CO-NH2 150-750mg/L ；(2) K2HPO4 · 3H20 20-100mg/L ； (3) MgSO4 · 7H20 50_80mg/L ； (4) CaCl2 · 2H20 30_50mg/L ；(5)NaCO3 10-30mg/L ； (6)FeCl3· 6H20 2_6mg/L ； (7)Citric acid 4_8mg/L ； (8)EDTANa22-5mg/L ； (9) H3BO3 2_4mg/L ; (IO)MnCl2 · 4H20 ト2mg/L ; (I I) ZnSO4 · 7H20 0. 1-0. 3mg/L ；(12) Na2MoO4 · 2H20 0. 2-0. 4mg/L ； (13) Co (NO3)2 · 6H20 0. 02-0. 05mg/L ； (H)CuSO4 · 5H200.06-0. 09mg/L ； 类波氏真眼点藻的生长温度为15-30°C，光照强度为30-600yE/m2s，类波氏真眼点藻扩大培养过程如下 1)由藻种保藏室获得藻种后，将获得的藻种置于500mL培养瓶中静置培养3-5天，然后转移至IOOOml的培养瓶中继续静置培养3-5天，待藻液光密度OD75tl达到I. 5后，进行第二步操作； 2)转移“步骤I”中的藻株至柱状光生物反应器中通气培养，通入气体中ニ氧化碳浓度为 1_5%，培养光强为 150-200 μ E/m2s。
3)在“步骤2”的基础上将藻株继续进行放大培养，并按接种比例20-30%，计算所需藻液的量； 4)待藻液光密度OD75tl达到2.5时,转入户外光生物反应器中进行规模化养埴； 5)规模化养殖选用尿素或硝酸盐为氮源，氮元素浓度为2-6mM，控制培养光强为100-600 μ E/m2s,培养周期 8-12 天。
2.根据权利要求I所述的利用类波氏真眼点藻生产EPA的方法，其特征在于，在“步骤I”中，由藻种保藏室获得藻种后，先利用显微镜观察藻株是否被其他微藻、原生动物或真菌污染，再进行培养。
全文摘要
本发明公开一种利用类波氏真眼点藻生产EPA的方法，藻株逐步放大培养后，并按接种比例20-30％，计算所需藻液的量；待藻液光密度OD750达到2.5时，转入户外光生物反应器中进行规模化养殖；规模化养殖选用尿素或硝酸盐为氮源，氮元素浓度为2-6mM，控制培养光强为100-600μE/m2s，培养周期8-12天。与现有技术相比，本发明提供的利用类波氏真眼点藻生产EPA的方法，可以实现EPA的高效生产。
文档编号C12R1/89GK102618592SQ201210109898
公开日2012年8月1日 申请日期2012年4月13日 优先权日2012年4月13日
发明者万凌琳, 吴洪, 张成武, 李涛, 李爱芬 申请人:暨南大学