专利名称：一种食甲醇芽孢杆菌及其烟用升麻浸膏的制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及烟用香料技术领域，具体是指一种食甲醇芽孢杆菌及其烟用升麻浸膏的制备方法和应用。
背景技术：
在烟草制品中，烟草的香气和吸味至关重要，添加香料是卷烟工艺中的关键环节，也是完善产品风格和提高卷烟香气质量的有效手段。烟用香料有化学合成香料和天然香料之分。近年来，天然植物香料，因其具有中国特色，天然无害，原料易得等原因，成分研发重点和热点。植物提取香料的开发由于可用植物资源的有限而存在局限性，将微生物发酵工程应用于香精香料的生物合成中，以工农业废料为原料，利用微生物可以生产各种天然香料，是一种很好的解决途径。升麻,拉丁名为Rhizoma cimicifugae,—种毛苜科棺物中草药。呈不规则的长形块状，多分枝，呈结节状，长10 20cm，直径2 4cm。表厘黑褐色或棕褐色，粗糙不平，有坚硬的细须根残留，上面有数个圆形空洞的茎基痕，洞内壁显网状沟纹；下面凹凸不平，具须根痕。体轻，质坚硬，不易折断，断面不平坦，有裂隙，赶Il性，黄绿色或淡黄白色。气微，味微苦而涩。升麻一药，主要有升举透发及清热解毒等―。升麻提取物浸膏添加到卷烟中存在与烟气不协调、刺激性大、杂气重的重大缺陷，无法烟用。微生物在增殖过程中可产生庞大的高活性酶系，如多糖水解酶类、蛋白酶类、酯化酶类、氧化还原酶类及裂合酶类等，在酶促作用、化学作用及微生物体内复杂代谢的协同作用下，以升麻为原料发生分解、降解、氧化、还原、聚合、偶联、转化等作用，形成复杂的低分子化合物，其中包括各种香味化合物，如醇类、醛类、酮类、酸类、脂类、酚类、吡喃类、吡啶类和萜烯类等，这些香气物质无疑也是烟草或用于烟草的添加剂的香气组分。目前化学合成烟用浸膏提取步骤复杂，环境污染严重，烟用浸膏的香气味道单一且香气强度尚显不足。升麻及其发酵物浸膏进行烟用还未见报道。
发明内容
针对目前化学合成烟用浸膏提取步骤复杂，环境污染严重，烟用浸膏的香气味道单一且香气强度尚显不足的缺陷，本发明提供了一种食甲醇芽孢杆菌，该菌株名为Bacillus methylotrophicus VJ4-1,于2012年I月11日保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO :M2012004，其生物学特征是是革兰氏阳性菌，能在10%NaCl中生长，有精氨酸双水解酶、鸟氨酸脱羧酶活性，能产酸、使牛奶液化；能以N-乙酰葡萄糖胺、甘露醇、葡萄糖、水杨素、D-蜜二糖、D-核糖、肌醇、蔗糖、麦芽糖、D-山梨醇、L-阿拉伯糖、DL-乳酸盐、L-丙氨酸糖原、L-脯氨酸组氨酸、柠檬酸盐为碳源的培养基上生长，其16SrRNA 序列与 Bacillus methylotrophicus 的 16S rRNA 序列比对相似性达到 100%。本发明提供一种利用食甲醇芽抱杆菌Bacillus methylotrophicus VJ4-1CCTCCNO M 2012004生物转化烟用谷壳浸膏的制备方法，包括以下步骤
1)将升麻粉碎至10 200目，与水按质量比I : 20 40回流提取I 3小时后过滤，将滤液灭菌；2)斜面培养将食甲醇芽抱杆菌 Bacillus methylotrophicus VJ4-1CCTCC NO M2012004接种到马铃薯葡萄糖琼脂斜面培养基上，在25 35°C、pH5 10条件下，静置培养24 72小时后置于冰箱中；3)制备种子培养液用上述步骤2)中所得的斜面培养物，接种到种子培养基，在25 35°C，转速100 150rpm条件下振荡培养12 36h，连续转接I 4次后制得种子培养液；4)发酵将种子培养液按体积比5 20%接种到上述步骤I)中的升麻滤液中形成发酵液，上述发酵液的装罐量为20 40%，在pH4 10，温度25 40°C，转速100 200rpm,不避光条件下发酵7 14天；5)将步骤4)中所得的发酵液和95%乙醇按体积比I : 3 4，沉淀过夜后抽滤，将滤液减压浓缩除去溶剂，制得相对密度为I. 20 I. 36的烟用升麻浸膏。优先地，所述斜面培养基为马铃薯浸液200mL/L，葡萄糖20g/L，琼脂13g/L。优先地，所述种子液培养基组成为麦芽糖50g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠5g/L。本发明提供了一种所得烟用升麻浸膏的应用，其特征在于所述烟用升麻浸膏加入卷烟中，用于协调烟气、烟气协调、增加淡甜花香、丰富香气、柔和舒适、余味好、改善吸味，加入卷烟中烟用升麻浸膏的质量比为O. 01 O. 05%。米用GC/MS对利用食甲醇芽抱杆菌Bacillusmethylotrophicus VJ4-1CCTCC NO:M 2012004生物转化烟用升麻浸膏与未利用食甲醇芽孢杆菌经历相同发酵步骤的升麻提取液相同条件下浓缩制成的浸膏(以下简称升麻提取物浸膏)进行挥发性致香成分进行对比。(I)同时蒸馏萃取将5g升麻发酵型烟用浸膏装入圆底烧瓶中，加入400mL水，用电热套加热至沸腾，另一侧的圆底烧瓶中加入200mL的二氯甲烷，60°C水浴沸腾，待中间分液管处液面出现分层后计时萃取2h。萃取结束后，向二氯甲烷萃取液中加入无水硫酸钠，过夜，过滤并浓缩至lmL，浓缩液用于进行GC/MS分析。升麻提取物浸膏同样进行同时蒸馏萃取，其萃取浓缩液用于进行GC/MS分析。(2)GC/MS 分析HP-5MS(50mX0. 25mmX0. 25 μ m)毛细管柱；进样温度250°C ;分流比 20 : I ;载气He, lmL/min ;升温程序:从 50°C (Imin)以 5°C /min 升到 250°C (5min)；传输线温度250°C;离子源EI源；电子能量70eV ;扫描范围50 550amu ;使用WILEY和MINILAB谱库进行检索。(3)挥发性成分对比分析 通过GC/MS对本发明的烟用升麻浸膏进行香气成分分析，从表I中可以看出，一共鉴定出46种香气成分，其中酯类11种，酮类7种，醛类3种，醇类4种，以及烷烃、甲基香兰素、二氢丁香酚、β -异甲基-紫罗兰酮、嘌呤、喹啉、脂肪酸等21种香气物质。对比升麻提取物浸膏，烟用升麻浸膏新增加了 23种香气物质，消失了 8种。新增加的香气物质包括己醛，低浓度时有水果样的特有香气；3_糠醛，有焦糖味，属于天然等同香料；苯乙醛，有浓郁的玉簪花香气；3_甲氧基苯乙酮，具有浓郁的山楂香气；二氢肉桂酸甲酯，呈强烈果酒香和甜的花香气，天然品存在于辣椒、大黄和罗勒等中；二氢丁香酚，I %的溶液，具有甜香、辛香、丁香、青香和花香香气，并带有油脂和木香香韵，属天然等同香料；甲基香兰素，呈甜香的木香和香水草香气，有很浓的香子兰似甜味，天然品存在于爪哇香茅油和胡苍耳刺芹油等中；β-异甲基-紫罗兰酮，具有柔和的紫罗兰香气，自然存在于鸢尾根。相对百分含量有变化的香气物质包括苯乙烯，有特殊香气，存在于苏合香脂(一种天然香料)中；正辛醇，有强烈的芳香气味；对乙烯基愈创木酚，呈强烈香辛料、丁香和发酵似香气，有炒花生气息；硬脂酸，有微弱的特殊香气；油酸乙酯，呈鲜花香气。所有这些香气糅合在一起赋予烟气协调、淡甜花香、丰富香气、柔和舒适、余味好。
微生物在增殖过程中可产生庞大的高活性酶系，如多糖水解酶类、蛋白酶类、酯化酶类、氧化还原酶类及裂合酶类等，在酶促作用、化学作用及微生物体内复杂代谢的协同作用下，以升麻为原料发生分解、降解、氧化、还原、聚合、偶联、转化等作用，形成复杂的低分子化合物，其中包括各种香味化合物，如醇类、醛类、酮类、酸类、脂类、酚类、吡喃类、吲哚类和喹啉类等，这些香气物质无疑也是烟草或用于烟草的添加剂的香气组分。表I.烟用升麻浸膏与对照-升麻提取物浸膏的挥发性香气成分对比
权利要求
1.一种食甲醇芽孢杆菌，该菌株名为Bacillus methylotrophicus VJ4-1,保藏编号CCTCC NO M 2012004，食甲醇芽孢杆菌Bacillus methylotrophicus CCTCC NO M 2012004的生物学特征是是革兰氏阳性菌，能在10% NaCl中生长，有精氨酸双水解酶、鸟氨酸脱羧酶活性，能产酸、使牛奶液化；能以N-乙酰葡萄糖胺、甘露醇、葡萄糖、水杨素、D-蜜二糖、D-核糖、肌醇、蔗糖、麦芽糖、D-山梨醇、L-阿拉伯糖、DL-乳酸盐、L-丙氨酸糖原、L-脯氨酸组氨酸、朽1檬酸盐为碳源的培养基上生长，其16S成應序列与1^0；[11118 methylotrophicus的16S rRNA序列比对相似性达到100%。
2.一种利用食甲醇芽孢杆菌生物转化烟用升麻浸膏的制备方法，其特征在于，包括以下步骤 1)将升麻粉碎至10 200目，与水按质量比I: 20 40回流提取I 3小时后过滤，将滤液灭菌； 2)斜面培养将食甲醇芽孢杆菌接种到马铃薯葡萄糖琼脂斜面培养基上，在25 35°C、pH5 10条件下，静置培养24 72小时后置于冰箱中； 3)制备种子培养液用上述步骤2)中所得的斜面培养物，接种到种子培养基，在25 350C，转速100 150rpm条件下振荡培养12 36h，连续转接I 4次后制得种子培养液； 4)发酵将种子培养液按体积比5 20%接种到上述步骤I)中的升麻滤液中形成发酵液，上述发酵液的装罐量为20 40%，在pH4 10，温度25 40°C，转速100 200rpm，不避光条件下发酵7 14天； 5)将步骤4)中所得的发酵液和95%乙醇按体积比I: 3 4，沉淀过夜后抽滤，将滤液减压浓缩除去溶剂，制得相对密度为I. 20 I. 36的烟用升麻浸膏。
3.根据权利要求2所述的一种利用食甲醇芽孢杆菌生物转化烟用升麻浸膏的制备方法，其特征在于，所述斜面培养基为马铃薯浸液200mL/L，葡萄糖20g/L，琼脂13g/L。
4.根据权利要求2所述的一种利用食甲醇芽孢杆菌生物转化烟用升麻浸膏的制备方法，其特征在于，所述种子液培养基组成为麦芽糖50g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠5g/L。
5.一种根据权利要求2所得烟用升麻浸膏的应用，其特征在于所述烟用升麻浸膏加入卷烟中，用于协调烟气、增加淡甜花香、丰富香气、使烟气柔和舒适、余味好，加入卷烟中烟用升麻浸膏的质量比为0. 01 0. 05%。
全文摘要
本发明公开了一种食甲醇芽孢杆菌，该菌株名为Bacillus methylotrophicus VJ4-1，保藏编号CCTCC NOM 2012004。本发明提供利用微生物食甲醇芽孢杆菌生物转化烟用升麻浸膏以及烟用升麻浸膏在烟草中的应用。本发明升麻经微生物菌株发酵能生产天然烟用香料，方法工艺简单，原料来源广泛，生产过程环保无害，有工业化使用前景；所得天然香料浸膏能直接用于卷烟的加香，具有能与烟气协调、淡甜花香、丰富香气、柔和舒适、余味好、改善吸味的优点，能与其它烟用香精香料混合调配使用。
文档编号C12N1/20GK102618475SQ201210114009
公开日2012年8月1日 申请日期2012年4月18日 优先权日2012年4月18日
发明者宋旭艳, 李冉, 罗诚浩, 陈义坤, 魏敏 申请人:湖北中烟工业有限责任公司