专利名称：一种纤维素酶系的选择性失活方法
技术领域：
本发明涉及纤维素酶，具体涉及ー种纤维素酶系的选择性失活方法
背景技术：
里氏木霉(Trichoderma reesei)是研究和制备纤维素酶最常用的经典菌株之一，通过底物的诱导和发酵调控作用它可以分泌出多种不同类型的聚糖水解酶蛋白组分，进而组成不同的酶系或复合酶系；其中，纤维素酶系主要包括内切葡聚糖酶(endo-1, 4-β-D-glucanase, EC 3. 2. I. 4,简称EG)、外切葡苷聚糖酶(exo-1, 4_β-D-glucanase, EC 3. 2. I. 91,又称 CBH)和纤维 ニ糖酶(3-l，4-D-glucosidase，EC 3. 2. I. 21，又称β -葡萄糖苷酶，简称β-G或BG)三大酶系，目前已经发现了 8 个 EG (EGI EGVIII)、2 个 CBH (CBHI 和 CBHII)和 7 个 BG (BGI BGVII)酶家族。在木质纤维原料聚糖类的酶水解过程中，通过上述三大酶系的协同作用可以催化纤维素或半纤维素为聚糖最終水解生成单糖。随着功能性多糖和低聚糖类在细胞生物合成和调控领域、食品、保健品、医药和饲料等领域的基础研究和应用的快速发展，聚糖定向酶水解技术的研究和开发备受关注，对具有单一功能或催化活性的酶家族或酶组分的需求日益增长。目前采用的主要技术途径一是通过外源単一内切酶或外切酶基因的重组表达，ニ是对天然酶制剂进行蛋白质拆分以控制和除去纤维素系中的BG酶组分，它们在大規模エ业化生产中存在着技术复杂、研发周期长、设备及操作要求高、前期投入和运行成本高等不足，因此寻求简单低廉的酶组分活力的定向控制技术和方法显得尤其重要，具有重要的理论和实用价值。
发明内容
发明目的针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种纤维素酶系的选择性失活方法，以里氏木霉产天然纤维素酶及其他相关的复合酶系为材料，通过采用简单的PH值处理的方法对其三大酶系进行选择性失活处理，实现对纤维素酶系的简单、快速和选择性失活。技术方案为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下
一种纤维素酶系的选择性失活方法控温5 40で，调节纤维酶液的pH不小于8，静置处理l(T80min，即可选择性失活纤维素酶系；其中，CMCase和CBH选择性保留，BG选择性失活。所述的纤维素酶系为里氏木霉产的天然纤维素酶复合酶系及其他相关的复合酶系O用含有Na+的碱液或缓冲液,或用含有K+的碱液或缓冲液,调节纤维酶液pH。所述的ρΗ=8· 8 9. 2。有益效果本发明的纤维素酶系的选择性失活方法，简单，快速，容易操作，仅需通过采用简单的pH值处理的方法就可以实现对纤维素酶系中的三大酶系进行选择性失活处理，是ー种简单低廉的酶组分活力的定向控制技术和方法，具有重要的实用价值，有很好的实用性，能够产生较好的经济效益和社会效应。
图I是纤维素酶系碱性失活的酶活力測定结果 图2是处理温度对纤维素酶系碱性失活的影响结果 图3是处理时间对纤维素酶系碱性失活的影响结果 图4是碱性条件下处理前后纤维素酶水解动力学的比较结果图；
图5是碱处理纤维素酶定向水解纸浆的糖组成测定结果图。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明做进ー步的说明。以下实施例是使用的纤维素酶系采用发酵制备，所使用的菌种为里氏木霉(Trichoderma reesei Rut C_30),方法为采用Mandels营养盐添加12 g/L纸衆和蒸汽瀑破玉米秸杆混合底物为碳源，在250 mL玻璃摇瓶中装液45 mL并接入5 mL活化后的里氏木霉菌丝体,于30°C和170 r/min振荡发酵产酶96h得发酵液,经4000 r/min离心10 min后取上清液即得到纤维素酶系原液，分装后冷冻保藏备用。酶活力測定方法为采用双平行实验，控制平行误差< 5%。滤纸酶活力、内切葡聚糖酶活力(CMCase)和外切葡聚糖酶活力(CBH)均采用DNS法測定，β -葡萄糖苷酶(BG)采用对硝基苯酚葡萄糖苷法測定。上述各种酶活力測定均采用O. 05 mol/L柠檬酸ー氢氧化钠缓冲液体系(PH4.80)和50°C ±1。纤维素酶原液中上述各种酶活力值依次为5.81 FPIU/mL、38.01 IU/mL、3.60 IU/mI^P1.13 IU/mL。实施例I
在恒温水浴和温和搅拌的条件下，向纤维素原酶液中缓慢滴加少量NaOH溶液调节pH值至稳定值，密封静置处理后得处理后的酶液，再采用酶活力測定方法重新测定处理后酶液的三种酶组分的酶活力。采用双平行实验进行酶系选择性失活，控制平行误差<5%。残余酶活力的计算方法以处理前后酶液的各种酶活力測定值相对百分比来表示。碱性处理后纤维素酶液离心分离条件8000 r/min离心碱性处理后的纤维素酶液IOmin后完全倾出离心上清液，以10% (v/v)体积的柠檬酸缓冲液(pH4. 80)清洗离心管壁得离心沉淀物。在25°C的恒温条件下直接添加4. 0% NaOH或KOH试剂或对应的缓冲液(w/w)调节纤维酶系的PH值并静置处理60min后，測定三大酶组分的酶活力。结果如图I所示，在不同PH值的碱性处理条件下三大酶类的酶活力呈现出两种不同类型的变化特征。以pH8.00以分界点，CMCase为两段阶梯式变化，而CBH和BG则为线性衰减。pH5. 00 7. 00的范围内，CMCase和CBH的酶活力相对较为稳定,可保留90%以上，而BG酶类的酶活力稳定性略低,继续提高PH值导致CBH和BG的酶活力快速线性下降。在高于pH8. 00的环境中CMCase的酶活力相对较为稳定。当PH值增至9. 00吋，BG的残余酶活力仅为5. 6%，而CMCase和CBH仍然可残留57. 0%和52. 1%, CMCaseXBH与β -G的残留酶活力的相对比率分别为10. 3和
9.4 ;至pH10. 00时，可以基本上消除BG和90%以上的CBH酶活力，但仍然可以保留48. 4%的CMCase酶活力，即可以得到几乎不含BG酶活力的纤维素酶制剂。实施例2
在pH9. 00的条件下，将纤维素酶原液分别置于5 40°C ±1的恒温水浴条件下同步静置处理60min，測定三大酶组分的酶活力。结果如图2所示，在pH9. 00的碱条件下，低于10°C的处理温度对BG酶组分存在一定的保护作用，在15 30°C的温度范围内碱性pH对纤维素酶液都起到较好的选择性失活作用，但是超过30°C的温度也会导致CMCase和CBH的残余酶活呈现出下降的趋势。这有利于纤维素酶在常温下进行碱处理操作。图3显示不同处理时间(l(T80min)的结果，在pH9. 00和25°C ±1的条件下处理30min后，三种酶类的残余酶活力就可以达到稳定状态，其中CMCase、CBH和BG的残余酶活力分别为58. 8%,56. 6%和5. 7%，相对比例达到10. 3和9. 9，可实现选择性失活的效果。碱处理时间超过70min后，CMCase和CBH的酶活力会表现出下降的趋势，显然，优选使用2(T60min，更优选使用30 60mino
实施例3
分别采用PH9. 00 土 O. 20和ρΗΙΟ. O ± O. 20的两种碱性条件在25°C ± I处理纤维素酶液30min后得到处理后的酶液(方法同实施例1)，以纤维素酶原液为对照，在10 g/L纸浆的酶解体系中分别加入O. 1% (v/v)用量的三种酶液，进行酶水解反应
酶水解性能的检测采用双平行实验，控制平行误差< 5%。在100 mL螺ロ玻璃三角瓶中进行，加入O. 05mol/L朽1檬酸缓冲液(pH 4. 80)配制而成的10 g/L Whatman滤纸纸衆粉(20目)溶液25 mL作为酶解底物，再加入适量酶液并密封，于50°C ±1和100 r/mim振荡反应。定时取样O. 5mL加入10 μ L的1% (v/v) H2S04终止酶反应得酶水解产物，经适当稀释后进行色谱分析。酶解得率计算以水解反应体系中所測定的产物糖的物质浓度除以纸浆的初始物质浓度再乘以转换系数O. 9。比较3种酶液的酶水解反应历程，结果如图4所示，在低底物和较少酶用量的反应条件下，与原酶液相比，经过PH9. 00碱处理后的酶制剂仍然可保存50%以上的CMCase和CBH酶活力，二者对纸浆酶水解反应的动力学和总糖得率基本上相近。由于碱处理可选择性地抑制酶系中BG酶活力(残余酶活力5%左右)，因而可以有效地保护纸浆酶水解过程中生成的纤维低聚糖组分。O. 1%(ν/ν)用量的碱处理酶催化水解10g/L纸浆反应24h后，反应体系中各种酶解产物组成基本趋于稳定，对应的总糖酶解得率为8. 60%，其中纤维低聚糖的酶解得率为6. 73%，低聚糖占总糖的比例由原酶液的50. 9%增长到78. 2%，提高幅度达到53. 0%。这说明，碱性理对天然纤维素酶系的选择性失活作用可显著提高定向水解纤维素制备纤维低聚糖的生产性能，可用于纤维低聚糖的酶法生产。提高酶液碱度至ρΗΙΟ. O会导致三大酶类进ー步失活，尤其是CBH显著失活，造成酶水解性能和低聚糖的得率大幅度下降，但对酶解产品品质即低聚糖比例的贡献较小。酶水解产物的色谱分析葡萄糖的測定依照NREL方法采用高效液相色谱法(色谱仪Agilent 1200),以Bio-Rad HPX -87H色谱柱(7. 8mm X 300mm)测定。纤维低聚糖的分析测定采用高效液相离子交换色谱一脉冲安培法(色谱仪Dionex ICS-3000)，以CarboPacTMPA200阴离子交换色谱柱(3mmX 250mm)测定。葡萄糖和纤维低聚糖的标准品来自Magazyme公司。采用高效离子液相色谱对酶解产物糖组成进行分析，结果如图5所示，采用碱失活纤维素酶水解纸浆只生成纤维ニ糖和少量的纤维三 糖，不会生成其它聚合度的纤维低聚糖，两种糖分别约占总低聚糖类的90%和10%。
权利要求
1.一种纤维素酶系的选择性失活方法，其特征在于控温5 40°C，调节纤维酶液的pH不小于8，静置处理l(T80min，即可选择性失活纤维素酶系；其中，CMCase和CBH选择性保留，BG选择性失活。
2.根据权利要求I所述的纤维素酶系的选择性失活方法，其特征在于所述的纤维素酶系为里氏木霉产的天然纤维素酶。
3.根据权利要求I所述的纤维素酶系的选择性失活方法，其特征在于用含有Na+的碱*液或缓冲液，或用含有K+的碱液或缓冲液，调节纤维酶液pH。
4.根据权利要求I所述的纤维素酶系的选择性失活方法，其特征在于pH=8.8^9. 2。
5.根据权利要求I所述的纤维素酶系的选择性失活方法，其特征在于所述的温度为15 30°C。
6.根据权利要求I所述的纤维素酶系的选择性失活方法，其特征在于所述的处理时间为30 60min。
全文摘要
本发明公开了一种纤维素酶系的选择性失活方法，控温5~40℃，调节纤维酶液pH不小于8，静置处理10~80min，即可选择性失活纤维素酶系；其中，CMCase和CBH选择性保留，BG选择性失活。本发明的纤维素酶系的选择性失活方法，简单，快速，容易操作，仅需通过采用简单的pH值处理的方法就可以实现对纤维素酶系中的三大酶系进行选择性失活处理，是一种简单低廉的酶组分活力的定向控制技术和方法，具有重要的实用价值，有很好的实用性，能够产生较好的经济效益和社会效应。
文档编号C12N9/99GK102653752SQ20121012710
公开日2012年9月5日 申请日期2012年4月27日 优先权日2012年4月27日
发明者余世袁, 勇强, 徐勇, 杭琪, 范丽, 蔡鹏 申请人:南京林业大学