专利名称：一种降血压菜籽肽及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及涉及生物技术领域，具体涉及降血压菜籽肽及其制备方法和应用。
背景技术：
我国是世界上油菜籽产量最大的国家，年产量已近1200万吨，菜籽柏是菜籽油加エ的主要副产物，占菜籽总量的65%，其中含蛋白35% 42%。菜籽蛋白氨基酸组成合理，赖氨酸、胱氨酸和蛋氨酸的含量较高，是ー种优良的植物蛋白。开发利用菜籽蛋白质资源对有效利用我国的植物蛋白资源，提高我国人民的营养水平，具有重大的社会意义和良好的经济效益。
目前，我国约有2亿高血压患者，每年仍然新增1000万人，开发新型降血压药剂和营养素，有利于解决这一日益严峻的社会公共问题。一方面，现有降血压药物长期服用会对身体造成很多的副反应，尤其是对消化道系统有很大的伤害；另外一方面，目前大多数降血压肽研究的靶标都是血管紧张素转移酶(ACE)，但是，长期服用降血压药物ACE抑制剂，会激活血管紧张素系统(RAS)的旁路途径，从而影响高血压的临床治疗。而肾素抑制剂可以从源头阻断RAS系统，具有比ACE抑制剂更多的潜在获益、更少的不良反应和更好的耐受性，并且在大型中间终点事件的研究中显示出具有靶器官保护的作用。但是，基于肾素抑制剂的降血压药物较少。
发明内容
本发明的目的在于提供ー种酶法制备具有肾素抑制活性和ACE抑制活性的降血压菜籽肽的方法，该方法对环境友好，反应条件温和，能充分发挥蛋白酶对菜籽蛋水解作用，是ー种低成本、适合エ业化大批量制备菜籽降血压肽的方法。本发明的另一目的在于提供降血压菜籽肽，不仅能够抑制血管紧张素转移酶(ACE)，而且能够抑制肾素，可以阻断由于长期服用降血压药物ACE抑制剂激活的血管紧张素系统(RAS)的旁路途径。本发明的另一目的在于提供降血压菜籽肽在制备治疗降血压药物方面的应用。本发明提供一种制备降血压菜籽肽的方法，包括如下步骤
(O以粉碎后的菜籽柏为原料，将所述原料与水混合，调节PH值至6. 5 9，温度35°C 50で，搅拌分散O. 5 2 h，获得菜籽蛋白水溶液；
(2)向步骤(I)所述菜籽蛋白水溶液中，加入蛋白酶，在35°C 50で下水解I 4h,灭活其中的蛋白酶，离心取上清液，得降血压菜籽肽粗提液；
(3)将步骤(2)所述降血压菜籽肽粗提液精制后获得降血压菜籽肽。步骤(I)所述菜籽柏的原料是普通油菜籽或双低油菜籽，粉碎后的菜籽柏的粒径为 10 200 μ m。步骤(I)所述菜籽蛋白水溶液的原料是从菜子柏中分离的蛋白质。步骤(2)所述蛋白酶为蛋白酶K、嗜热菌蛋白酶、复合蛋白酶或木瓜蛋白酶，优先蛋白酶K。步骤⑵所述加入的蛋白酶与菜籽蛋白水溶液中蛋白质的质量比为I 10:100。步骤(3)所述精制方法为降血压菜籽肽粗提液经截留分子量为3kDa的超滤膜超滤，取透过液透析脱盐，冷冻干燥得降血压菜籽肽。步骤(3)所述精制方法也可以为将降血压菜籽肽粗提液经反相高效液相色谱分离，分别取有机溶剂体积浓度为10°/Γ15%，359Γ40%和55%飞0%的三部分洗脱液，将所述三部分洗脱液分别冷冻干燥，即得降血压菜籽肽；所述反相高效液相色谱分离的条件为色谱柱为碳12或碳18硅胶柱；流动相为水和有机溶剂，所述有机溶剂为甲醇或こ腈，所述水和有机溶剂中均含有质量浓度为O. 05 O. 10%三氟こ酸；洗脱条件为线性洗脱，流动相中的有机溶剂体积浓度从5%变化到80%。本发明还提供采用上述方法制备的降血压菜籽肽。本发明还提供采用所述降血压菜籽肽在制备降血压药物方面的应用。本发明的有益效果
(I)本发明制备降血压菜籽肽方法与现有的技术相比，直接以菜籽柏或者菜籽分离蛋白质为原料，通过酶法水解，获得降血压菜籽肽，原料来源广泛，生产エ艺简单、成本低，而且变废为宝，有利于环境保护。(2)采用两种精制方法获得的降血压菜籽肽，不仅能够抑制血管紧张素转移酶(ACE)，而且能够抑制肾素，可以阻断由于长期服用降血压药物ACE抑制剂激活的血管紧张素系统(RAS)的旁路途径，在降血压方面有很大的开发前景。(3)本发明降血压菜籽肽源于天然动、植物及微生物的降血压肽，除了具有降血压功能外，还有抗氧化、免疫促进、抗凝血、易消化吸收、对靶细胞无毒害作用等功能，是为降血压药物和营养素的首选原料。
具体实施例方式本发明中使用的蛋白酶K (Proteinase K)购于Fisher公司，货号39450-01-6 ;嗜热菌蛋白酶(Thermolysin)购于sigma公司，货号232_973_4 ,产品编号P1512 ;复合蛋白酶(Protamex)购于sigma,产品编号P0029 ;木瓜蛋白酶(Papain)购于sigma ,货号是232-627-2，产品编号 P4762。实施例I采用蛋白酶K制备降血压菜籽肽
(I)将菜籽柏粉碎，通过100目筛，制成粉碎后的菜子柏。以粉碎后的菜籽柏为原料，将所述原料按固液比1:20，将与水混合，调节pH值至7. 5，温度37 V，搅拌分散Ih，获得菜籽蛋白水溶液。所述菜籽柏的原料是普通油菜籽或双低油菜籽，粉碎后的菜籽柏的粒径为10 200 μ m。所述菜籽蛋白水溶液的原料还可以为从菜子柏中分离的蛋白质。(2)按蛋白酶与菜籽蛋白水溶液中蛋白质的质量比为5:100，向步骤(I)所述菜籽蛋白水溶液中，加入蛋白酶K，控制温度和pH值不变，水解I 3 h。反应结束后，将水解液 加热至90 100で，保持10 min，灭活其中的蛋白酶K，冷却至室温，10000 g离心カ离心I h取上清液，得降血压菜籽肽粗提液。(3)将降血压菜籽肽粗提液经反相高效液相色谱(RP-HPLC)分离，洗脱时，分别取有机溶剂体积浓度为10°/Γ15%，359Γ40%和55% 60%的三部分洗脱液，将所述三部分洗脱液分别冷冻干燥，即得降血压菜籽肽；所述反相高效液相色谱分离的条件为色谱柱为碳12或碳18硅胶柱；流动相为水和有机溶剂，所述有机溶剂为甲醇或こ腈，所述水和有机溶剂中均含有质量浓度为O. 05 O. 10% TFA (三氟こ酸)；洗脱条件为线性洗脱，流动相中的有机溶剂体积浓度从5%变化到80%。反相高效液相色谱(RP-HPLC)分离时，采用紫外检测器(检测波长215 nm)。其中，组分2 (洗脱时，有机溶剂体剂浓度为35°/Γ40%) ACE抑制活性达到91. 81%，肾素抑制活性达到49. 40% ;组分5(洗脱时，有机该溶剂体剂浓度为45% 50%) ACE抑制活性达到87. 89%，肾素抑制活性达到54. 97% ;组分9 (洗脱时，有机溶剂体剂浓度为559T60%)ACE抑制活性达到86. 89%，肾素抑制活性达到58. 19%。可以看出采用该方法分离到的组分2、5和9均具有 很高的ACE抑制活性和肾素抑制活性，在降血压方面有着很好的应用前景。ACE抑制活性检测方法如下在比色杯中加入I mL 0.5 mM FAPGG ( FAPGG全称N-[3-(2-Furyl)acryloyl]-L-phenylalanyl-glycyl_glycine,溶解在含 O. 3 M NaCl 浓度为 50 mM 的 Tris-HCl 缓冲液，pH 7.5) ,20 μ L ACE (lU/mL,最终活力 20 mU)，200μ L降血压菜籽肽溶液(蛋白浓度为lmg/mL，溶剂为50 mM Tris-HCl缓冲液，含0.3 MNaCl, pH 7. 5)，混匀室温下，2 min内测定345 nm下吸光值的降低速率·空白以Tris-HCl缓冲液代替样品.根据以下公式计算ACE抑制活性
ACE 抑制活性(％)=1-[ AA.mirT1(样品)/ Λ A. mirT1(空白)]X 100%，
，其中，ΛΑ. HiirT1ws)和ΛΑ. HiirT1isw)分别是表示样品和空白的ACE活性抑制速率。肾素抑制活性的检测方法如下降血压菜籽肽抑制血管紧张素活性的体外測定根据肾素活性试剂盒(购买于Cayman Chemical，编号10006270)提供方法，按以下步骤测定96-孔板中依次加入(I)空白20 μ L底物，160 μ L测试用缓冲液，10 μ L纯水；
(2)空白对照20 UL底物，150 UL测试用缓冲液，和10 μ L纯水；(3)样品20 μ L底物，150 UL测试用缓冲液，和10 μ L样品。之后分别在每个孔(除空白外)中加入10 UL肾素启动反应。96-孔板室温下震荡10 S，在37 °C下预热15 min，在IOmin内测定样品的荧光强度，激发波长340nm，发射波长490nm，根据以下公式计算样品的肾素抑制活性
权利要求
1.一种制备降血压菜籽肽的方法，包括如下步骤 (O以粉碎后的菜籽柏为原料，将所述原料与水混合，调节PH值至6. 5 9，温度35°C 50で，搅拌分散O. 5 2 h，获得菜籽蛋白水溶液； (2)向步骤(I)所述菜籽蛋白水溶液中，加入蛋白酶，在35°C 50で下水解I 4h,灭活其中的蛋白酶，离心取上清液，得降血压菜籽肽粗提液； (3)将步骤(2)所述降血压菜籽肽粗提液精制后获得降血压菜籽肽。
2.根据权利要求I所述制备降血压菜籽肽的方法，其特征在于步骤(I)所述菜籽柏的原料是普通油菜籽或双低油菜籽，粉碎后的菜籽柏的粒径为10 200 μ m。
3.根据权利要求2所述制备降血压菜籽活性肽的方法，其特征在于步骤(I)所述菜籽蛋白水溶液的原料是从菜子柏中分离的蛋白质。
4.根据权利要求2所述制备降血压菜籽肽方法，其特征在于步骤(2)所述蛋白酶为蛋白酶K、嗜热菌蛋白酶、复合蛋白酶或木瓜蛋白酶。
5.根据权利要求4所述制备降血压菜籽肽方法，其特征在于步骤(2)所述蛋白酶为蛋白酶K。
6.根据权利要求4或5所述制备降血压菜籽肽的方法，其特征在于步骤(2)所述加入的蛋白酶与菜籽蛋白水溶液中蛋白质的质量比为I 10:100。
7.根据权利要求6所述制备降血压菜籽肽方法，其特征在于步骤(3)所述精制方法为降血压菜籽肽粗提液经截留分子量为3kDa的超滤膜超滤，取透过液透析脱盐，冷冻干燥得降血压菜籽肽。
8.根据权利要求6所述制备降血压菜籽肽的方法，其特征在于步骤(3)所述精制方法为将降血压菜籽肽粗提液经反相高效液相色谱分离，分别取有机溶剂体积浓度为10% 15%，35% 40%和55% 60%的三部分洗脱液，将所述三部分洗脱液分别冷冻干燥，即得降血压菜籽肽；所述反相高效液相色谱分离的条件为色谱柱为碳12或碳18硅胶柱；流动相为水和有机溶剤，所述有机溶剂为甲醇或こ腈，所述水和有机溶剂中均含有质量浓度为O.05 O. 10%三氟こ酸；洗脱条件为线性洗脱，流动相中的有机溶剂体积浓度从5%变化到 80%ο
9.ー种采用权利要求8之一方法制备的降血压菜籽肽。
10.一种权利要求9所述降血压菜籽肽在制备降血压药物方面的应用。
全文摘要
本发明提供一种降血压菜籽肽及其制备方法和应用。所述制备降血压菜籽肽的方法采用蛋白酶水解菜籽蛋白水溶液，然后精制获得降血压菜籽肽。本发明制备降血压菜籽肽方法与现有的技术相比，直接以菜籽粕或者菜籽分离蛋白质为原料，通过酶法水解，获得降血压菜子肽，原料来源广泛，生产工艺简单、成本低，而且变废为宝，有利于环境保护。该降血压菜籽肽，不仅能够抑制(血管紧张素转化酶)ACE活性，而且能够抑制肾素活性，可以阻断由于长期服用降血压药物ACE抑制剂激活的血管紧张素系统(RAS)的旁路途径，在降血压方面有很大的开发前景。
文档编号C12P21/06GK102676621SQ20121013008
公开日2012年9月19日 申请日期2012年4月28日 优先权日2012年4月28日
发明者何荣, 周建新, 王立峰, 王雪峰, 石嘉怿, 袁建, 都立辉, 陈银基, 鞠兴荣, 高瑀珑 申请人:南京财经大学