专利名称：生产3-羟基丙酸和4-羟基丁酸的共聚物的重组菌及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种生产3-羟基丙酸和4-羟基丁酸的共聚物(P(3HP-CO-4HB))的重组菌及其应用。
背景技术：
利用代谢工程技术改造微生物已成为一种行之有效的方法来生产化学产品以及新型的生物材料。聚轻基脂肪酸酯(Polyhydroxyalkanoates或PHA)是ー类在微生 Fuchtenbusch, B. ,1998. Bacterial and other biological systems for polyesterproduction. Trends Biotechnol. 16,419-427.)。随着对其深入的研究,聚轻基脂肪酸酯在环保材料、生物医学和生物能源方面将极具应用价值。根据单体的结构组成，PHA可分为短链和中长链两类前者的単体组成为C3到C5，后者的単体组成为C6到C14。3-羟基丙酸和4-羟基丁酸的共聚物(P(3HP-co-4HB))是ー种新型的生物可降解高分子聚合物，属于短链共聚物的ー种，之前报道的利用生物技术生产出的此聚合物中4-羟基丁酸的含量均低于 2mol% (Zhou, Q.，Shi，Z. Y.，Meng, D. C.，Wu, Q.，Chen, J. C.，Chen, G. Q. ,2011.Production of 3-hydroxypropionate homopolymer and poly(3-hydroxypropionate-co-4-hydroxybutyrate)copolymer by recombinant Escherichia coli.Metab. Eng. 13, 777-785.) 除本申请之外，至今国际上还没有关于P (3HP-co_4HB)热力学性质的报道。
发明内容
本发明的目的本发明的ー个目的是提供产3-羟基丙酸和4-羟基丁酸的共聚物(P (3HP-co-4HB))的重组菌的构建方法并用这个重组菌生产3-羟基丙酸和4-羟基丁酸的共聚物。本发明提供的方法，包括如下步骤将1，3-丙ニ醇脱氢酶编码基因(dhaT)、醛脱氢酶编码基因(aldD)、3-羟基丙酸辅酶A连接酶编码基因(pcs’)、4_羟基丁酸辅酶A转移酶编码基因(orfz)和PHA聚合酶编码基因(phaC)导入出发菌，得到重组菌。所述1，3-丙ニ醇脱氢酶的氨基酸序列为序列表中序列8 ;所述醛脱氢酶的氨基酸序列为序列表中序列9 ;所述3-羟基丙酸辅酶A连接酶的氨基酸序列为序列表中序列10 ；所述PHA聚合酶的氨基酸序列为序列表中序列11 ;所述4-羟基丁酸辅酶A转移酶的氨基酸序列为序列表中序列12。所述1，3-丙ニ醇脱氢酶基因的核苷酸序列为序列表中序列I ;自序列I的5'端第1-1185位核苷酸为编码序列。所述醛脱氢酶基因的核苷酸序列为序列表中序列2 ；自序列2的5'端第1-1521位核苷酸为编码序列。所述3-羟基丙酸辅酶A连接酶基因的核苷酸序列为序列表中序列3 ；自序列3的5'端第1-2571位核苷酸为编码序列。所述PHA聚合酶基因的核苷酸序列为序列表中序列4;自序列41的5'端第1-1770位核苷酸为编码序列。所述4-羟基丁酸辅酶A转移酶的核苷酸序列为序列表中序列5 ;自序列5的5'端第1-1290位核苷酸为编码序列。所述出发菌为大肠杆菌，优选为Escherichia coli S17-1。但不限于大肠杆菌(Eschericnia coliノ。
所述1，3-丙ニ醇脱氢酶编码基因和所述醛脱氢酶编码基因通过重组载体A导入所述出发菌中；所述3-羟基丙酸辅酶A连接酶编码基因、所述4-羟基丁酸辅酶A转移酶基因和所述PHA聚合酶编码基因通过重组载体B导入所述出发菌中；所述重组载体A 为 pZQOl (Zhou, Q.，Shi，Z. Y.，Meng, D. C.，Wu, Q.，Chen, J. C.，Chen, G. Q. ,2011.Production of 3-hydroxypropionate homopolymer and poly(3-hydroxypropionate-co-4-hydroxybutyrate)copolymer by recombinant Escherichia coli.Metab. Eng. 13,777-785.公众可从清华大学获得)；所述重组载体B为将4-羟基丁酸辅酶A转移酶编码基因反向插入到pZQ03 (Zhou,Q. , Shi, Z. Y. , Meng, D. C. , ffu, Q. , Chen, J. C. , Chen, G. Q. , 2011. Production of3-hydroxypropionate homopolymer and poly(3-hydroxypropionate-co-4-hydroxybutyrate) copolymer by recombinant Escherichia coli. Metab. Eng. 13, 777-785.公众可从清华大学获得)的BamH I识别位点间得到的载体。由上述的方法构建的重组菌也属于本发明的保护范围本发明的另ー个目的是提供生产不同単体比例的3-羟基丙酸和4-羟基丁酸的共聚物的方法。本发明提供的方法，包括如下步骤摇瓶培养所述的重组菌，收集产物，即得到3-羟基丙酸和4-羟基丁酸的共聚物。所述生产温度为30°C -40°C，所述生产培养基的pH为6-8 ；所述生产温度具体为37°C，所述生产培养基的pH具体为7。所述生产过程中，在所述摇瓶接种前，向所述摇瓶中添加1，3_丙ニ醇和/或1，4_ 丁ニ醇，使摇瓶中培养基中的1，3_丙ニ醇或1，4_ 丁ニ醇含量均不高于20g/L。所述培养基中的I，3-丙ニ醇或I，4-丁ニ醇浓度均为lg/L_20g/L ;所述培养基中的 I，3-丙ニ醇和 I，4-丁ニ醇浓度具体为 lg/L 和 10g/L，5g/L 和 15g/L，5g/L 和 10g/L，IOg/L 和 10g/L，10g/L 和 5g/L。所述培养时间具体为48h ;所述共聚物为3-羟基丙酸和4-羟基丁酸的共聚物。可采用生物工程领域中常用的方法将含有1，3_丙ニ醇脱氢酶、醛脱氢酶、3-羟基丙酸辅酶A连接酶、4-羟基丁酸辅酶A转移酶及PHA聚合酶基因的表达载体转化大肠杆菌宿主菌，如电击转化法、化学转化法或氯化锂转化法，优选为电击转化法。可采用大肠杆菌的常规培养条件对重组大肠杆菌进行培养。
在摇瓶中，可采用如下的TB培养基进行生产，培养基成分含有24g/L酵母提取物，12g/L 蛋白胨，4mL/L 甘油，0.017mol/L KH2PO4,0. 072mol/L K2HPO4，余量为水。溶液先在15psi高压下蒸汽灭菌20min，当冷至60°C或60°C以下时加入无菌的KH2PO4和K2HPO4的水溶液。在实际的培养过程中，可向上述培养基中再添加一定浓度的抗生素以维持质粒的稳定性，如100 V- g/mL氨节青霉素和50 μ g/mL硫酸卡那霉素。本发明的第三个目的是提供一种生产3-羟基丙酸和4-羟基丁酸的共聚物的两种载体组合。本发明提供的组合物，由所述的方法中的重组载体A和重组载体B组成。上述方法制备的3-羟基丙酸和4-羟基丁酸的共聚物也属于本发明的保护范围。本发明提供的3-羟基丙酸和4-羟基丁酸的共聚物这种新型生物材料具有优良的热力学性质，以供应用开发之用。
本发明的实验证明，本发明提供了ー种含有1，3_丙ニ醇脱氢酶基因，醛脱氢酶基因，3-羟基丙酸辅酶A连接酶基因，4-羟基丁酸辅酶A转移酶基因及PHA聚合酶基因的专用表达工程菌，该工程菌可高效表达I，3-丙ニ醇脱氢酶及醛脱氢酶基因，在脱氢酶的作用下转化底物I，3丙ニ醇或I，4- 丁ニ醇为3-羟基丙酸或4-羟基丁酸，同时该工程菌也高效表达3-羟基丙酸辅酶A连接酶和4-羟基丁酸辅酶A转移酶基因，使3-羟基丙酸或4-羟基丁酸转化为3-羟基丙酸辅酶A或4-羟基丁酸辅酶A，该工程菌同时也高效表达PHA聚合酶基因，使3-羟基丙酸辅酶A和4-羟基丁酸辅酶A聚合为3-羟基丙酸和4-羟基丁酸的共聚物P(3HP-co-4HB)。摇瓶实验表明将本发明的工程菌在500mL容积摇瓶中生产后，P (3HP-co-4HB)的产量最高可达6. 2g/L，P (3HP-co_4HB)最高可达细胞干重的63%。本发明生产エ艺简单，开生产的聚合物其热力学性能可以通过调节3HP和4HB的比例实现变化；应用前景广阔。
图I为1，3_丙ニ醇、1，4-丁ニ醇、3-羟基丙酸和4_羟基丁酸的共聚物的转化关系不意图。图2为P (3HP)，5种不同単体比例的P (3HP-co_4HB)，P (4HB)的实物3A 和 3B、图 4 为 P (3HP-co_37· 89mol % 4HB)的核磁图谱。图5为pZQOl (图5中A)和pZQ03_orfz (图5中B)的质粒图谱。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明作进ー步说明，但本发明并不限于以下实施例。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。所用酶试剂均购自MBI Fermentas公司，提取质粒所用的试剂盒购自北京博迈德科技发展公司，回收DNA片段所用的试剂盒购自美国omega公司，相应的操作步骤按照产品说明书进行；所有培养基如无特别说明均用去离子水配制。培养基配方I)种子液摇瓶培养基
LB培养基5g/L酵母提取物(购自英国OXID公司，产品目录号LP0021)，IOg/L蛋白胨(购自英国OXID公司，产品目录号LP0042)，10g/L NaCl，其余为水。调pH值至7. 0-7. 2,高压蒸汽灭菌。2)生产摇瓶培养基TB培养基配置方法将下列组分溶解在O. 9L水中蛋白胨(购自英国OXID公司，产品目录号LP0042) 12g，酵母提取物(购自英国OXID公司，产品目录号LP0021) 24g，甘油4mL0各组分溶解后高压灭菌。冷却到60°C,再加IOOmL灭菌的170mmol/L KH2PO4,0. 72mol/L K2HPO4的溶液(2. 31g的KH2PO4和12. 54gK2HP04溶在足量的水中，使 终体积为100mL。高压灭菌或用O. 22um的滤膜过滤除菌)。K2HPO4, KH2PO4均购自国药集团化学试剂有限公司，目录号分别为10017528,1017628。以上生产培养基补料成分1，3-丙ニ醇和1，4_ 丁ニ醇。在实际培养过程中，可向上述培养基中再添加一定浓度的抗生素以维持质粒的稳定性，如100 μ g/mL氨节青霉素和50 μ g/mL硫酸卡那霉素。1,3-丙ニ醇、1，4- 丁ニ醇、3-羟基丙酸、4_羟基丁酸、3_羟基丙酸和4_羟基丁酸的共聚物的结构式及转化关系见图I所示，图I中的I表示I，3-丙ニ醇脱氢酶，2表示醛脱氢酶，3表示3-羟基丙酸辅酶A连接酶，4表示4-羟基丁酸辅酶A转移酶，5表示聚羟基脂肪酸聚合酶。实施例I、表达工程菌的构建一、表达载体pZQ03_orfz的构建I)以质粒 pKSSE5. 3 (Song, S. S.，Hein, S.，Steinbiichel, A.，1999. Productionof poly (4-hydroxybutyric acid)by fed-batch cultures of recombinant strains ofEscherichia coli. Biotechnol. Lett. 21,193-197 ;该 pKSSE5. 3 质粒是目前熟知的质粒，公众可从清华大学获得)为模板，以orfz Sense和orfz Antisense为引物,用pfu酶进行PCR反应扩增目的基因4-羟基丁酸辅酶A转移酶基因(orfz)，并在片段两端设计引入酶切位点。orfz Sense :5’ CGGTGTGGATCCCAAGGTGATG3’(序列 6)BamH Iorfz Ant i sense :5’ ATATAGGATCCCCGACTGGAAAGCG 3，(序列 7) BamH IPCR反应条件先94°C预变性 IOmin ;再 94°C变性 30 秒，58°C退火 30 秒，72°C延伸 lmin20 秒，30次循环；然后72°C后延伸10分钟。PCR扩增目的片断(20 μ L体系)模版DNA 0. 4 μ L (0. 05ug),引物 orfz Sense O. 5 μ L (0. 5ug),引物orfz Antisense 0. 5 μ L (0. 5ug) , pfu buffer 2. 0 μ L, pfu 酶 0.2yL(lU), dNTPI. 5 μ L (0. 0002mol)，ddH20 14. 9 μ しPCR扩增体系配制时，DNA聚合酶最后加入。得到的PCR产物，经过测序，该PCR产物具有序列表中的序列5的核苷酸序列，序列5由1290个核苷酸组成，即为4-羟基丁酸辅酶A转移酶基因(orfz)核苷酸序列，自序列5的5'端第1-1290位核苷酸为编码序列，编码氨基酸残基序列为序列表中序列12的蛋白。用BamH I 单酶切质粒 pZQ03 (Zhou, Q.，Shi，Ζ· Y.，Meng, D. C.，Wu，Q.，Chen, J. C.，Chen, G. Q. ,2011.Production of 3-hydroxypropionate homopolymer and poly(3-hydroxypropionate-co-4-hydroxybutyrate)copolymer by recombinant Escherichia coli.Metab.Eng. 13,777-785.公众可从清华大学获得)得到线性酶切片段，与经BamH I酶切上述PCR产物得到的片段连接，得到连接产物，转化到大肠杆菌E. coli Transl-Tl (北京全式金生物技术有限公司，CD501-01)中，得到转化子，提取转化子的质粒，测序，结果为该质粒为将序列表中的序列5反向插入到pZQ03的BamH I酶切位点得到的载体，该质粒记作pZQ03-orfz (质粒图谱如图5中B所示，orfz为4-羟基丁酸辅酶A转移酶编码基因，pcs’为3-羟基丙酸辅酶A连接酶编码基因，phaC为聚羟基脂肪酸聚合酶编码基因，Amp为氨苄青霉素抗性基因，Re promoter表示来自于真氧产碱杆菌(Ralstonia eutropha)的启动子序列，BamHI表示orfz两端的BamHI酶切位点)。上述质粒pZQ03的序列中含有3-羟基丙酸辅酶A连接酶编码基因和PHA聚合酶编码基因；3_羟基丙酸辅酶A连接酶基因的核苷酸序列为序列表中序列3，自序列3的5'端第1-2571位核苷酸为编码序列，其编码的蛋白为3-羟基丙酸辅酶A连接酶；3_羟基丙酸辅酶A连接酶的氨基酸序列为序列表中序列10 ;PHA聚合酶基因的核苷酸序列为序列表中序列4，自序列41的5'端第1-1770位核苷酸为编码序列，其编码的蛋白为PHA聚合酶，PHA聚合酶的氨基酸序列为序列表中序列11。ニ、重组工程菌 E. coli S17-l(pZQ01, pZQ03-orfz)的构建将步骤一构建的表达载体pZQ03_orfz和pZQOl (质粒图谱如图5中A所示，dhaT为1，3_丙ニ醇脱氢酶编码基因，aldD为醛脱氢酶编码基因，Km为卡那霉素抗性基因，Repromoter表示来自于真氧产碱杆菌(Ralstonia eutropha)的启动子序列,rep为复制起始子序列)。用电击转化法同时转入到E. coii S17-1(ATCC编号47055，可购自美国菌种保藏中心 American Type Culture Collection)中，得到重组菌 I ；pZQ01 (Zhou, Q.，Shi, Z. Y.，Meng, D. C.，Wu, Q.，Chen, J. C.，Chen, G. Q. , 2011. Production of 3-hydroxypropionatehomopolymer and poly(3-hydroxypropionate-co-4-hydroxybutyrate)copolymer byrecombinant Escherichia coli. Metab. Eng. 13, 777-785.公众可从清华大学获得)的序列中含有1，3_丙ニ醇脱氢酶编码基因和醛脱氢酶编码基因，1，3_丙ニ醇脱氢酶基因的核苷酸序列为序列表中序列1，自序列I的5'端第1-1185位核苷酸为编码序列，编码的蛋白为1，3-丙ニ醇脱氢酶，其氨基酸序列为序列表中序列8。将重组菌I涂布于添加100 μ g/mL氨节青霉素和50 μ g/mL硫酸卡那霉素的LB固体培养平板上，在37°C静置培养12小时，挑取在固体平板上长出的单克隆，将其接种到添加100 μ g/mL氨苄青霉素和50 μ g/mL硫酸卡那霉素的LB液体培养基中，在37°C、200rpm下摇床培养12小吋。从重组菌I中提取质粒，用引物orfz Sense和orfz Antisense进行PCR验 证，可以扩增得到1290个核苷酸的片段的即为阳性重组菌，将获得的阳性重组菌命名为E.coliS17-l(pZQOl, pZQ03-orfz)。
实施例2、用重组工程菌生产3-羟基丙酸和4-羟基丁酸的共聚物P (3HP-CO-4HB)的实验—、摇瓶培养摸索试验‘I、以TB为培养基生产3-羟基丙酸和4-羟基丁酸的共聚物P (3HP-co_4HB)重组工程菌Ε· coliS17-l(pZQ01, pZQ03-orfz)用 LB 培养基，在 37°C，200rpm 过夜培养；然后按5%接种量(v/v，10nCfu/ml)，分别接种至50mL含1，3_丙ニ醇(PDO)、1，4_ 丁ニ醇的TB培养基(BDO) (1，3_丙ニ醇、1，4_ 丁ニ醇的添加量如表I所述)中，于37°C，200rpm，摇瓶培养48小时，得到菌液。每个实验处理设置三组平行实验。运用气相色谱仪(GC，GC-2014, SHIMADZU)验证细胞中聚合物进行初步定性和定量分析(Kato，Μ.，Bao, H. J.，Kang, C. K.，Fukui，T.，Doi，Y.，1996. Production of a novel copolyesterof 3-hydroxybutyric acid and medium chain length3-hydroxyalkanaic acids byPseudomonas sp 61-3 from sugars. Appl. Microbiol. Biotechnol. 45，363-370.)。气相检测3-羟基丙酸和4-羟基丁酸的共聚物的方法设定炉温为80°C，进样器温度为200°C，检测器温度为220 °C，柱头压カ为
O.25Mpa，程序升温条件为80°C停留I. 5分钟，以30°C /min的速度升温至140°C，接着以400C /min的速度升温至220°C并在此温度保持O. 5分钟。样品的进样量为I μ 1，使用岛津公司生产的自动进样器。气相样品准备取40-60mg待测样品的干细胞(菌液lOOOOrpm，10分钟条件下离心，所得细胞沉淀水洗一次之后，冰干(真空度< lOPa，冷阱温度为-50°C，处理10小吋)，得到冰干细胞，聚合物产于细胞中)，加2mL氯仿，2mL酯化液(纯甲醇中含3% (v/v)的浓硫酸及2g/L苯甲酸作内标)于酯化管中，加盖密封后于100°C下加热4小吋。冷却后加入ImL蒸馏水，充分振荡后静置，待氯仿相与水相完全分层后，取下层氯仿于进样瓶中，运用气相色谱仪(GC，GC-2014, SHIMADZU)进行定量和定性分析。标准样品准备取30 μ I左右的30%浓度(体积浓度)3-羟基丙酸3ΗΡ(日本东京化成エ业株式会社(TCI)，产品目录号Η0297)水溶液于酯化管中，加2mL氯仿，2mL酷化液，加盖密封后在100°C进行酯化。在本实施例中的气相检测条件下，标准样品在第2. 7分钟有明显出峰，表征酯化样品中的3-羟基丙酸。取ΙΟμΙ的99%浓度的Y-丁内酯(美国Sigma-Aldrich公司,目录号cat. B10, 360-8)于酯化管中，加2mL氯仿,2mL酉旨化液,加盖密封后在100°C进行酯化。经气相检测，标准样品在第3. Omin有明显出峰，表征酯化样品中的4-羟基丁酸。Y - 丁内酯是4-羟基丁酸的内酯结构，可替代市面上少见的4-羟基丁酸作为气相检测的标准样品。以标准样品为对照，如果待测细胞的酯化样品(待测样品)在2. 7分钟有明显的出峰，在第3. O分钟也有明显出峰，且无其它特异峰出现，说明待测细胞的酯化样品存在3-羟基丙酸(3HP)单体和4-羟基丁酸(4HB)单体。因为在冰干细胞中3HP和4HB只能以聚合物的形式存在(因为单体3HP和4HB会从细胞里分泌到细胞外，所以细胞内检测到的应该是聚合物)，所以可以证明有P(3HP-co-4HB)的积累。结果为E. coli S17-l(pZQ01,pZQ03-orfz)在2. 7分钟有明显的出峰，在第3. O分钟也有明显出峰，说明产生P (3HP-co-4HB)共聚物。通过分析气相检测得到的出峰面积和样品量，可得到干细胞中含有共聚物的比重(wt%，重量百分含量)，以及培养体系中能够生产的共聚物的浓度(g/L)。在含有1，3-丙ニ醇和/或1，4-丁ニ醇的TB培养基中培养E. coli S17_l(pZQ01，pZQ03-orfz)，48h后将菌液离心、水洗、冰干后得到干细胞待测样品，并通过气相色谱检測，结果如表I所示。该结果证实了细胞中3-羟基丙酸和4-羟基丁酸的共聚物的产生。结果如表I所示。表ITB培养及不同条件下摇瓶培养的共聚物检测结果
权利要求
1.产3-羟基丙酸和4-羟基丁酸的共聚物的重组菌的构建方法，包括如下步骤将1，3_丙ニ醇脱氢酶编码基因、醛脱氢酶编码基因、3-羟基丙酸辅酶A连接酶编码基因、4-羟基丁酸辅酶A转移酶编码基因和PHA聚合酶编码基因导入出发菌，得到重组菌。
2.根据权利要求I所述的方法，其特征在于所述1，3-丙ニ醇脱氢酶的氨基酸序列为序列表中序列8 ;所述醛脱氢酶的氨基酸序列为序列表中序列9 ;所述3-羟基丙酸辅酶A连接酶的氨基酸序列为序列表中序列10 ;所述PHA聚合酶的氨基酸序列为序列表中序列11 ；所述4-羟基丁酸辅酶A转移酶的氨基酸序列为序列表中序列12。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述1，3-丙ニ醇脱氢酶基因的核苷酸序列为序列表中序列I ;所述醛脱氢酶基因的核苷酸序列为序列表中序列2 ;所述3-羟基丙酸辅酶A连接酶编码基因的核苷酸序列为序列表中序列3 ;所述PHA聚合酶编码基因的核苷酸序列为序列表中序列4 ;所述4-羟基丁酸辅酶A转移酶编码基因的核苷酸序列为序列表中序列5 ;所述出发菌为大肠杆菌,优选为Escherichia coliS17_l。
4.根据权利要求I或2或3所述的方法，其特征在于 所述1，3_丙ニ醇脱氢酶编码基因和所述醛脱氢酶编码基因通过重组载体A导入所述出发菌中； 所述3-羟基丙酸辅酶A连接酶编码基因、4-羟基丁酸辅酶A转移酶编码基因和所述PHA聚合酶编码基因通过重组载体B导入所述出发菌中； 所述重组载体A为pZQOl ； 所述重组载体B为将4-羟基丁酸辅酶A转移酶的编码基因插入到PZQ03的多克隆识别位点得到的重组载体。
5.由权利要求1-4中任一所述的方法构建的重组菌。
6.一种生产3-羟基丙酸和4-羟基丁酸的共聚物的方法，包括如下步骤将权利要求4所述的重组菌用添加了 1，3_丙ニ醇和1，4_ 丁ニ醇的培养基培养，收集菌体，提取聚合物，即得到3-羟基丙酸和4-羟基丁酸的共聚物。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在干所述培养温度为30°C-40°C，优选37°C；所述培养基的PH为6-8，优选为7。
8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在干所述培养基中的1，3_丙ニ醇或1，4_ 丁ニ醇含量均不高于20g/L;所述1，3_丙ニ醇、1，4_ 丁ニ醇在培养基中的浓度均优选为lg/L-20g/L ;所述培养时间为24-72小时，优选48小时；所述培养基为大肠杆菌培养基，优选为TB培养基，所述TB培养基含有24g/L酵母提取物，12g/L蛋白胨，4ml/L甘油，O. 017mol/L KH2PO4,0. 072mol/L Κ2ΗΡ04。
9.ー种产3-羟基丙酸和4-羟基丁酸的共聚物的重组载体组合，重组载体A和重组载体B组成；所述重组载体A为pZQOl ;所述重组载体B为将4-羟基丁酸辅酶A转移酶的编码基因插入到PZQ03的多克隆识别位点得到的载体。
10.权利要求6-9中任意一项所述方法制备的3-羟基丙酸和4-羟基丁酸的共聚物。
全文摘要
本发明公开了一种产3-羟基丙酸和4-羟基丁酸的共聚物的重组菌及其应用。该重组菌的构建方法，是将1，3-丙二醇脱氢酶编码基因、醛脱氢酶编码基因、3-羟基丙酸辅酶A连接酶编码基因、4-羟基丁酸辅酶A转移酶编码基因和PHA聚合酶编码基因导入出发菌，得到重组菌。本发明的工程菌在500mL容积摇瓶中生产后，P(3HP-co-4HB)的产量最高可达6.2g/L，P(3HP-co-4HB)最高可达细胞干重的63％。本发明生产工艺简单，开生产的聚合物其热力学性能可以通过调节3HP和4HB的比例实现变化；应用前景广阔。
文档编号C12N1/21GK102676567SQ201210132778
公开日2012年9月19日 申请日期2012年4月28日 优先权日2012年4月28日
发明者吴琼, 周琴, 孟德川, 石振宇, 陈国强 申请人:清华大学