专利名称：一种耐表面活性剂的内切β-1,4-葡聚糖酶基因工程菌及其构建方法
技术领域：
本发明涉及一种耐表面活性剂的内切β-1，4-葡聚糖酶基因工程菌的构建方法，属于基因工程和酶工程领域。
背景技术：
纤维素酶是指能降解纤维素的一类酶的总称，主要包括三类，分别为内切β -1，4-葡聚糖酶(EC3. 2. I. 4)、纤维二糖水解酶(EC3. 2. I. 91)和β -葡萄糖苷酶(EC3. 2. I. 21)。其中，内切β -1，4-葡聚糖酶是纤维素酶系中的重要组分，能随机水解纤维 素的β-1，4-葡萄糖苷键，产生纤维低聚糖，广泛用于纺织和洗涤等工业。内切β-1，4-葡聚糖酶的产生菌很多，主要有丝状真菌、细菌等。目前研究最多的是木霉(Trichoderma)。附着在衣物表面的污垢易被传统洗涤剂清洗，而在衣物间隙中的污垢与衣物粘黏在一起难以洗净，反复洗涤以后，衣物便会发旧泛黄。将内切β-I，4-葡聚糖酶加入洗涤剂中，改变了传统的去污机理，它使棉织物的纤维素结构膨松，利于洗涤剂成分进人纤维间隙与污垢充分接触，从而大大提高了洗涤效果，并且用添加纤维素酶的洗涤剂洗过的衣物，色泽鲜艳、柔软，对衣物损伤小。洗涤剂中通常含有大量的表面活性剂，易造成酶蛋白部分或者完全变性失活。因此要求添加到洗涤剂中的纤维素酶对表面活性剂具有一定的耐受力。Andre等从土壤中筛选到Streptomyces drozdowiczii并分离纯化出其中的内切β-1,4_葡聚糖酶,研究了其在商品化洗涤剂环境中的稳定性，室温放置一小时后酶活降低15%左右JinichiiO等从Staphylotrichum coccosporum中分离纯化出内切β-1,4-葡聚糖酶STCE1,研究发现STCEl是45家族中对表面活性剂耐受力最好的内切酶。近年来，随着洗涤工业的发展，洗涤用内切β-1，4_葡聚糖酶的需求量日益增大，因此筛选耐表面活性剂的内切β-1，4-葡聚糖酶，并且构建适合大规模发酵生产的基因工程菌显得日趋重要。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种耐表面活性剂的内切β-1，4_葡聚糖酶基因工程菌，是以携带重组质粒表达耐表面活性剂的内切β_1，4-葡聚糖酶基因的大肠杆菌Ε. coli BL21(DE3)。本发明要解决的另一个技术问题是提供一种构建所述基因工程菌的方法，通过克隆内切β-1，4-葡聚糖酶基因cel5A(NCBI编码3579455)到pET_24a载体，以E. coliBL21(DE3)为表达宿主，实现了内切β-1，4-葡聚糖酶Cel5A的高效表达。所述重组质粒为pUC系列，pET系列，pT7-7，或pGEX中的任意一种。本发明提供的重组酶在洗涤剂常用的表面活性剂中稳定性实验，包括如下步骤重组酶中分别加入终浓度为ImM的几种洗涤剂中常用的表面活性剂，25°C下，保温一小时后测定残留酶活。所述的表面活性剂为脂肪醇聚氧乙烯九醚、壬基酚聚氧乙烯醚和阴离子表面活性剂直链烷基苯磺酸钠、十二烷基硫酸钠中任一种。
图I重组内切β-1，4-葡聚糖酶Cel5A摇瓶发酵产酶曲线。图2重组内切β-1，4_葡聚糖酶Cel5A蛋白SDS-PAGE图。I、发酵液上清；2、破壁上清；3、包涵体；M、标准蛋白分子量。图3重组内切β-1，4_葡聚糖酶Cel5A分批补料发酵产酶曲线。图4重组内切β -1,4-葡聚糖酶Cel5A分离纯化SDS-PAGE图。I、纯化后样品；2、发酵液;M、标准蛋白分子量。
具体实施例方式实施例I :基因工程菌的构建I、根据NCBI上登录的cel5A的基因序列(Genbank号3579455)，以嗜热子囊菌(Thermobifidafusca)总DNA为模板,采用聚合酶链式反应方法合成内切β_1,4_葡聚糖酶Cel5A的基因序列，连接到pMD18-Tsimple载体，连接产物转化大肠杆菌JM109，转化产物涂布含100mg/L氨苄青霉素的LB平板。经37°C培养过夜，挑选菌落，接入LB液体培养基，8 IOh后提取质粒，命名为pMD18-T simple-ce15A，将此质粒进行序列测定。结果表明此基因全长1293个核苷酸，和NCBI上登录的cel5A的基因序列完全相同。2、用于构建大肠杆菌表达载体的质粒是pET_24a，带有T7启动子。将pET_24a质粒和pMD18-Tsimple-cel5A分别进行Nco I和HindIII双酶切，酶切产物割胶回收后，再用T4连接酶连接，连接产物转化E. coli JM109感受态细胞，经37°C培养8h，挑转化子在含有30 μ g/mL卡那霉素的LB中振荡培养，提取质粒，酶切验证得到表达质粒pET-24a-cel5A。3、将重组质粒pET-24a_cel5A转化Ε· coli BL21 (DE3)宿主菌，涂布含卡那霉素(30 μ g/mL)的LB平板上，37°C培养8h。挑单菌落至液体LB中，37 °C培养过夜，获得基因工程菌 E. coli BL21(DE3)/pET-24a-cel5A。实施例2 :重组内切β -1,4-葡聚糖酶Cel5A的摇瓶发酵将所述的基因工程菌在LB培养基中37°C液体培养过夜，后接入TB (甘油5g/L，蛋白胨 12g/L，酵母膏 24g/L，K2HPO412. 54g/L，KH2P042. 31g/L)发酵液体培养基，37°C培养至OD达2. O后，用终浓度为0. 4mM异丙基硫代- β -D-半乳糖苷诱导，降温至25°C培养48小时后，离心菌体，收集上清液测定酶活力，重组内切β -1，4-葡聚糖酶Cel5A摇瓶发酵活力达到46.78U/mL。重组内切β _1，4-葡聚糖酶Cel5A产酶曲线见图1，SDS-PAGE电泳图见图2。实施例3 :重组内切β -1,4-葡聚糖酶Cel5A分批补料发酵将所述的基因工程菌在工业级LB培养基中37°C培养8小时后，按10%接种量接A NBS (New Brunswick Scientif ic) 3L全自动发酵罐，发酵罐初始装入I. IL工业级复合培养基，35°C恒温发酵，维持溶氧在30%左右，利用氨水控制pH 7. O左右。分批阶段初始培养基中甘油耗尽后，溶氧以及PH快速上升，开始指数流加补料液，控制比生长速率μ =O.2h'当菌浓0D_达到50时，以2%的流速流加乳糖进行诱导，整个发酵过程由发酵罐控制系统软件进行在线控制和数据采集。重组内切β_1，4-葡聚糖酶Cel5A分批补料发酵产酶曲线见图3。实施例4 :重组内切β -1,4-葡聚糖酶Cel5A的分离纯化将发酵液于4°C, 12000rpm离心除去菌体，向上清液中加入70% (w/v)的固体硫酸铵盐析过夜。然后于41，12000印111离心去掉上清液，用201111磷酸缓冲液六( !1 7. O)将蛋白沉淀溶解并在缓冲液A中透析过夜。DEAE-Sepharose FF柱事先用缓冲液A平衡，上样后，再按顺序分别用缓冲液A (至少2个柱体积)、含缓冲液A和缓冲液B (含20mM磷酸钾、IM氯化钠)的线性梯度混合液(5个柱体积)进行洗脱。全程流速为lmL/min，紫外检测波长为280nm，在梯度洗脱过程中收集有吸收峰的洗脱液，测定酶活并进行蛋白电泳检测，活力组分经20mM磷酸缓冲液(pH 5. 5)透析后上样Superdex 200柱，收集有吸收峰的洗脱液，测定酶活并进行蛋白电泳检测。 纯化过程参数见下表，蛋白SDS-PAGE电泳图见图4。Table I. Summary of purification of the recombinant endoglucanase Cel5A
权利要求
1.一种耐表面活性剂的内切β-1，4-葡聚糖酶基因工程菌，其特征在于，该基因工程菌是以携带重组质粒表达耐表面活性剂内切β -I，4-葡聚糖酶基因的大肠杆菌。
2.构建权利要求I所述基因工程菌的方法，其特征在于克隆Cel5A编码基因(Genbank登录号3579455)到pET_24a载体，以E. coli BL21(DE3)为表达宿主，实现了耐表面活性剂的内切β-1，4-葡聚糖酶的高效表达。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述重组质粒为pUC系列，pET系列，PT7-7，或pGEX中的任意一种。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述宿主大肠杆菌为E.coli BL21(DE3)、E.coli W3110.E. coli JM109、E.coli JM109 (DE3)、E. coli DH5 α 中任意一种。
5.权利要求I所述基因工程菌生产的内切β-1，4-葡聚糖酶在洗涤剂常用的表面活性剂中稳定性良好。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的表面活性剂为脂肪醇聚氧乙烯九醚、壬基酚聚氧乙烯醚和阴离子表面活性剂直链烷基苯磺酸钠、十二烷基硫酸钠中任一种。
全文摘要
本发明涉及一种耐表面活性剂的内切β-1，4-葡聚糖酶基因工程菌的构建，属于基因工程和酶工程领域。本发明由嗜热子囊菌(Thermobifida fusca)总DNA为模板经过PCR的方法获得内切β-1，4-葡聚糖酶基因cel5A(NCBI编码3579455)，连接表达载体，转化E.coli宿主菌，实现了内切β-1，4-葡聚糖酶Cel5A的高效表达。在工业级发酵培养基中培养，经过诱导重组内切β-1，4-葡聚糖酶发酵活力达到638.51U/mL。该重组酶在洗涤剂常用的表面活性剂中稳定性良好，非常适合在洗涤工业中的应用，是洗涤剂的理想添加剂。
文档编号C12R1/19GK102676442SQ20121013586
公开日2012年9月19日 申请日期2012年4月26日 优先权日2012年4月26日
发明者吴敬, 宿玲恰, 闫鹏安, 陈坚, 陈晟 申请人:江南大学