专利名称：阴道毛滴虫和白色念珠菌双通道荧光pcr检测方法及其试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域的分子生物学检测方法，特别是涉及阴道毛滴虫、白色念珠菌的双重检测。
背景技术：
毛滴虫是ー种有鞭毛的原虫，目前发现寄生在人体的毛滴虫有3种，即口腔毛滴虫、人毛滴虫和阴道毛滴虫(Trichomonas vaginalis, TV)。前两种在人类病因学上无意义，而TV寄生在阴道、尿道或膀胱，能引起人的泌尿生殖道疾病，称为滴虫病。滴虫病分为滴虫性尿道炎、滴虫性阴道炎、滴虫性前列腺炎。阴道毛滴虫引起的女性阴道炎，以泡沫状阴道分泌物为典型表现。有人报道，阴道毛滴虫能吞噬精子，导致不孕，还能引起细胞发育异常及细胞核异常，因此,有滴虫女性的癌症发生率显著高于无滴虫女性。女性患者滴虫病的症 状涵盖从阴道穹窿及子宫颈轻度充血到广泛糜烂、瘀点及肛周糜烂、颗粒状易碎及潮红的子宮内膜(草莓状子宫颈)。男性患者症状轻微，有时表现为慢性前列腺炎的症状。滴虫病与某些其他性传播疾病的症状类似，故单纯以临床症状难以做出确诊，需用实验方法检出阴道毛滴虫方可确诊。TV感染是ー种十分常见的性传播疾病，该病呈全球分布，人群普遍易感。传染源是滴虫患者和滴虫携帯者，主要通过性交直接传染，亦可通过被污染的毛巾、公共浴池、游泳池、坐式马桶、浴缸等物品等间接传播。世界卫生组织将阴道毛滴虫病作为性传播疾病。据WHO报道，全球每年有I. 7亿人感染TV。除引起泌尿生殖道感染外，TV还是HIV感染和诱发宫颈癌的危险因素之一。女性妊娠中期感染TV常引起胎膜早破、早产、低体重儿等，它也是男性非淋菌性尿道炎的ー个重要病因。念珠菌是ー种内源性真菌，它可以侵犯皮肤、粘膜和内脏，表现为急性、亚急性和慢性炎症。目前发现对人体致病的念珠菌有七种，其中以白色念珠菌(Canidia Albicans, CA)在临床上最为常见，其毒力也最強。人生殖器官皮肤粘膜的念珠菌感染称为生殖器念珠菌病。白色念珠菌可引起女性的外阴及阴道炎症，主要表现为外阴及阴道瘙痒及阴道分泌物增多并呈豆渣样白帯，阴道壁粘膜红肿，有灼烧感。可通过性交传染给男性，引发男性的念珠菌性龟头炎和包皮龟头炎，表现为包皮和龟头轻度潮红，龟头部有红丘疹，包皮垢异常增多，呈白色乳酪状。白色念珠菌阴道炎的危害极大可能会造成暂时性不孕，如果患了念珠菌性阴道炎，阴道的酸碱度的改变会使精子的活动カ受到抑制，且炎性细胞可吞噬精子，并使精子活动カ减弱；可影响胎儿发育，极少数孕妇阴道中的念珠菌能经宫颈上行，穿透胎膜感染胎儿，引起早产。另外经阴道分娩时，也可能感染引起口腔念珠菌病——鹅ロ疮。有些婴儿还可能出现肛门周围念珠菌性皮炎；引起其他疾病，若念珠菌性阴道炎长期不治疗的话，易造成炎症上行，引起宫颈炎和宫颈糜烂，如果病原体进入子宮腔，则会引起输卵管卵巣炎症、盆腔炎等，最終影响怀孕。与其他性传播疾病一祥，这两种病菌引起的临床症状不典型，临床确诊常借助实验检测。常用的方法有培养法(诊断“金标准”)、涂片染色法、悬滴法、免疫学方法及核酸检测法等。这些方法在准确性、可靠性、易用性等ー个或多个方面有缺点。例如，涂片染色法阳性率低，培养法耗时需要3-7天，且不够敏感。因此，如何选择准确、可靠、方便的实验诊断方法颇为重要，合适的方法能有效减少该病带来的危害。
发明内容
本发明的第一方面提供了用于在ー个反应管中同时对阴道毛滴虫和白色念珠菌进行实时荧光PCR检测的引物和Taqman探针。在一个实施方案中，对于阴道毛滴虫检测，其上游引物序列为SEQID NO :1或13的核苷酸序列，下游引物序列为SEQ ID NO :2或14的核苷酸序列，TaqMan探针为SEQ ID NO:3或12的核苷酸序列；对于白色念珠菌检测，上游引物序列为SEQ I·D NO:4的核苷酸序列，下游引物为SEQ ID NO 5的核苷酸序列，TaqMan探针为SEQ ID NO 6的核苷酸序列。在一个实施方案中，上述TaqMan探针为经过突光标记的,其5’端标记有报告突光基团(R)，并且3’端标记有荧光淬灭基团(Q)。在一个实施方案中，上述阴道毛滴虫TaqMan探针(SEQ ID NO 3或12) 5’端的报告荧光基团为FAM，3’端的荧光淬灭基团为BHQ2。在一个实施方案中，白色念球菌TaqMan探针(SEQ ID NO 6) 5’端的报告荧光基团为HEX，3’端的荧光淬灭基团为BHQ2。本发明的第二方面提供了一种灵敏度高且同时检测阴道毛滴虫和白色念珠菌的双通道实时荧光PCR检测方法，所述检测方法包括以本发明的引物和TaqMan探针进行实时荧光定量PCR的步骤。本发明的第三方面提供了一种用于同时对阴道毛滴虫和白色念珠菌进行检测的实时荧光PCR检测试剂盒，所述试剂盒包括本发明用于检测阴道毛滴虫和白色念珠菌的引物和Taqman探针。在本发明中，在同一个反应体系同时对阴道毛滴虫和白色念珠菌进行检测的双通道实时荧光PCR检测方法以待测样品中的阴道毛滴虫RNA和白色念珠菌DNA为检测对象，准确度和精确性高。同时，本发明的方法还具有以下优点I、首次建立了针对阴道毛滴虫和白色念珠菌双通道实时荧光PCR检测的方法(SP为多重实时荧光PCR方法)，利用此检测方法可以同时对待测样本中的阴道毛滴虫和白色念珠菌进行检测。2、检测样本多祥化，如男性泌尿道分泌物、女性阴道分泌物、尿液等。同时，利用本发明的方法可以避免常规的阴道后穹窿取样，因为孕妇、儿童和青少年一般不能忍受窥阴器检查，对这些人群筛检阴道ロ取样即可。3、本检测方法与阴道毛滴虫和白色念珠菌的其它常规检测方法如湿片法、分离培养法、免疫荧光、酶免疫法和嵌套式PCR相比，灵敏度和特异性极高，检测效率得到了很大的提高，在DNA提取、PCR扩增、杂交过程是均需设立阳性和阴性对照，可避免出现假阳性有效的防止了污染。本检测方法对于生殖道常见的微生物，包括金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌、铜绿假单胞菌、沙眼衣原体、淋病奈瑟氏菌、生殖支原体和阴道加特纳菌等的检测结果均为阴性，说明了该检测方法有极高的特异性。4、本检测方法与阴道毛滴虫和白色念珠菌的其它常规检测方法如湿片法、分离培养法、免疫荧光、酶免疫法和嵌套式PCR相比，具有操作程序简单易用的特点，并可进一歩制成检测试剂盒，操作程序化，减轻患者的取样痛苦和等待时间，大大提高检测效率，适合广泛推广和应用。5、本检测方法可以同时对阴道毛滴虫和白色念珠菌进行检测，可以用于日常⑶C监测和临床常规检查，也可以在发病期间作为诊断类型的分辨。综上所述，本发明实现了一次同时对阴道毛滴虫和白色念珠菌进行快速、准确检测，对于性病的防控和监测具有很大的现实意义。本发明的检测方法及试剂盒可以用于多种临床样本男性泌尿道分泌物、女性阴道分泌物、尿液等阴道毛滴虫RNA和白色念珠菌DNA进行定性检测，用于阴道毛滴虫和白色念珠菌的辅助诊断及流行病学监控。下面对本发明做进ー步详细说明。
具体实施例方式下述实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Samtoook等人所编《分子克隆实验指南》中所述的条件，或按照制造厂商建议的条件。所用引物及TaqMan探针由宝生物工程(大连)有限公司合成，所有序列測定工作均由宝生物工程(大连)有限公司完成。实施例I、用于对阴道毛滴虫RNA和白色念珠菌DNA进行双通道检测的实时荧光PCR引物和Taqman探针以及筛选。从 GenBank 数据(http://www. ncbi. nlm. nih. gov/genomes/FLU/FLU. html)下载阴道毛滴虫亚型rRNA基因全序列，软件比对分析所有阴道毛滴虫rRNA基因序列的一致性，选择相对保守区设计引物和探针；保守区的选择原则为序列同源性分析中保守性高且适合PCR特异性扩增的区域作为靶扩增区。从GenBank 数据(http: / / www. ncbi. nlm. nih. gov/genomes/FLU/FLU. html)下载白色念珠菌的LlAl全序列进行比对选取保守区域作为靶扩增区。阴道毛滴虫和白色念珠菌的靶扩增区都选定后可以使用0LIG06. O实时荧光PCR引物探针设计软件设计合成TaqMan探针及引物。引物和探针设计中允许同一变异位点允许2个及2个以下简并碱基。将所提取的备选引物满足以下要求进行筛选①探针长度(L)在19 一 28bp之间；@Tm值在58-60°C之间； GC%在25 — 75%之间；④连续相同碱基数polyN彡4bp ;⑤发夹结构Hairpin彡4bp !⑥序列同源性>90%;⑦扩增产物长度控制在50 — 150bp之间引物Tm值比探针Tm值低10°C左右；⑨进行序列比对BLAST筛选，排除其它同属物种和检测取样时可能污染的其它种属病原菌的序列。最佳Tm值设定在60°C，最佳探针长度为20-25bp。探针的荧光标记选择FAM/HEX(5’端)作为报告发光基团，BHQ2 (3’端)为淬灭基团。引物/探针的筛选原则为在目的保守区中选择PCR扩增效率和探针结合效率较高的引物和探针作为候选引物和探针。具体筛选方法如下在引物、探针的两次筛选过程中均需选择在目的保守区中PCR扩增效率和探针结合效率较高的引物和探针(所用PCR引物和荧光探针由大连宝生物公司合成，引物要求以PAGE纯化，探针要求以HPLC纯化。到货时为引物或探针干粉，用无菌水复溶后，对干粉进行含量測定，探针配制至lOOpmol/μ 1，引物配制至lOOpmol/μ I贮存液后备用)。针对阴道毛滴虫共设计了 5组上游和下游引物以及荧光探针，序列如下TV-I上游引物(SEQID NO :7 ) : 5 ’ -TTCATCAAAAACCAAGTCTCTAA-3 ’下游引物(SEQID NO 8) :5，-TTACTTAACACATTATGCCACGT-3，Taqman 探针(SEQ ID NO :3) :5，FAM-TCTTGGCTCCTCACACGATGA_BHQ23，TV-2上游引物(SEQID NO : I) : 5 ’ -AAGTCTCTAAGCAATGGATGTCT -3 ’下游引物(SEQID NO :2 ) : 5 ’ -CAAAGATTAACCTGTCATGATGT -3 ’ Taqman 探针(SEQ ID NO :3) :5，FAM-TCTTGGCTCCTCACACGATGA_BHQ23，TV-3上游引物(SEQID NO :9) :5，-AACCAAGTCTCTAAGCAATGGAT -3，下游引物(SEQID NO 8) :5，-TTACTTAACACATTATGCCACGT-3，Taqman 探针(SEQ ID NO :3) :5’FAM-TCTTGGCTCCTCACACGATGA _BHQ23，TV-4上游引物(SEQ ID NO : 10) :5’ -TCAAAAACCAAGTCTCTAAGCA-3’下游引物(SEQID NO :11) :5’ -ACTCCGGTTACTTAACACATTAT-3’Taqman 探针(SEQ ID NO 12) :5’ FAM-CAATGGATGTCTTGGCTCCTCA_BHQ23，TV-5上游引物(SEQID NO : 13 ) : 5 ’ -ACTTCATCAAAAACCAAGTCT-3 ’下游引物(SEQID NO 14) :5，-TGCATTCAAAGATTAACCTGT-3，Taqman 探针(SEQ ID NO 12) :5’ FAM-CAATGGATGTCTTGGCTCCTCA_BHQ23，针对白色念珠菌共设计了 4组上游和下游引物以及荧光探针，序列如下CA-I上游引物(SEQID NO : 15 ) : 5 ’ -ACCGTTCATTTGCTCAACTAT-3 ’下游引物(SEQID NO 16) :5’ -TCAATAAGGAATCAATTAAAT-3’Taqman 探针(SEQ ID NO 17) :5’ HEX-TTGGAGACGTGATGCTGCTCA_BHQ2-3’CA-2上游引物(SEQID NO : 18) :5’ -AAAGATATTTTGATAACCCTGA-3’下游引物(SEQID NO :5 ) : 5，-ACCCATAATCAACTTCATCAGA-3 ’Taqman 探针(SEQ ID NO 19) :5’ HEX-TGCTGCCAAAGCTAATTCTGTT_BHQ2-3’CA-3上游引物(SEQID NO 4) :5，-TTGATAACCCTGAAGATTTTGA-3’下游引物(SEQID NO :5 ) : 5，-ACCCATAATCAACTTCATCAGA-3 ’Taqman 探针(SEQ ID NO 6) :5，HEX-TGGGATACTGCTGCTGCCAA_BHQ23，CA-4上游引物(SEQID NO :20) :5’-TGTTTACAACTTAGTATGGCAA -3’下游引物(SEQID NO :21) :5’ -TCACCATACTTTTGACGACA-3’Taqman 探针(SEQ ID NO :22) :5’HEX-TTGGATTCCTTGGTTTGGTTCT 22_BHQ23’
实验中所用样品是由辽宁省⑶C提供的阴道毛滴虫样品和白色念珠菌样品3ml，使用科骏生物有限公司的硅胶膜核酸提取试剂盒(货号KJ001)依照说明书进行阴道毛滴虫RNA和白色念珠菌DNA提取，将提取的RNA和DNA进行10倍稀释，作为实时荧光定量PCR反应体系优化用阳性模板。取10_4、10_5、10_6、10_7、10_8、10_9稀释度，编号L1-L6。分装后于-70°C保存备用。探针引物筛选在筛选实验中，阴道毛滴虫和白色念珠菌的双通道实时荧光PCR检测体系(25 μ I)如下TV 系 TaqMan 探针 O. 5μ L (IOpmol/μ L)，TV 系上游引物 I. O μ L (lOpmol/μ L),TV 系下游引物 I. O μ L (IOpmoI/ μ L)；CA 系 TaqMan 探针 O. 5 μ L (IOpmoI/ μ L)，CA 系上游引物 I. OyL (10pmol/yL)，CA 系下游引物 LOyL (IOpmol/μ L);样品 DNA/RNA 5μ L(注在具体的检测体系中，因为一般都是对未知样品进行检测 ，所以DNA/RNA模板的浓度基本上都是未知的);DNA聚合酶(5U/ μ L)0. 5 μ L ;逆转录酶(5U/ μ L)0. 5 μ L ;实时荧光PCR缓冲液2 X (用购自Takara公司IOX缓冲液，加dNTP和DEPC水配制而成)12. 5 μ L ;补充无菌水至25 μ L0与上述双通道实时荧光PCR检测体系相比，阴道毛滴虫实时荧光PCR检测体系不含CA系TaqMan探针、CA系上游引物和CA系下游引物；白色念珠菌实时荧光PCR检测体系不含TV系TaqMan探针、TV系上游引物和TV系下游引物，并且不含逆转录酶。其中的探针、引物以及其他组分的量同上，补充无菌水至25yL。在所述实验中，实时荧光定量PCR反应条件为先逆转录50°C 30min ;然后预变性95 0C 5min ;最后扩增95°C 5sec，55°C 40sec，共40个循环，在每个循环的延伸结束时收集FAM和HEX荧光信号。对于白色念珠菌实时荧光PCR检测体系，不包括逆转录步骤。本文使用的PCR仪器为荧光实时定量PCR仪(ABI公司，型号是Prism 7500)。在设置荧光PCR基线后，荧光PCR的阈值设定为刚刚超过荧光背景及阴性特异性对照的扩增曲线为准。阈值设定后，标本的Ct值(C代表反应循环数，t代表阈值，Ct的含义是每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值所经历的循环数)由仪器自动给出。如果有个别标本的扩增曲线异常，造成仪器误判，需要人为加以纠正。本试剂盒经多次试验发现，Ct值在37. O以内的模板能得到比较稳定可重复的结果，可判定为阳性，而Ct在37以上的模板，结果的重复性与人为操作、荧光PCR仪分辨能力有关，甚至出现阴性结果，本试剂盒确定Ct值在37以上的区域定为灰区，即低于检出极限区。结果在灰区的样本需重复试验取400 μ I样本重新提取核酸(核酸分离试剂盒中裂解液、助沉剂、无水こ醇的用量加倍，其他组分的用量不变)并检測。复检结果Ct < 40. O的样本为阳性，否则为阴性。用阴道毛滴虫实时荧光PCR检测体系，对上面的阴道毛滴虫的5组引物探针，用阳性模板进行筛选，实验结果如下，Ct值小于20说明灵敏度高。所有实验以生理盐水作为阴性对照，阴性对照的Ct值为O或无数值说明特异性好。最后确认TV-2、TV-3和TV-5三组的灵敏度和特异性较好。同样，用白色念珠菌实时荧光PCR检测体系，对白色念珠菌的4组引物探针，用阳性模板进行筛选，最后确认CA_1、CA-3和CA-4 ニ组的灵敏度和特异性较好。上述检测的结果如下
样品检测结果Ct值
权利要求
1.用于对阴道毛滴虫和白色念珠菌进行双通道荧光检测的引物和TaqMan探针，所述引物和TaqMan探针是根据阴道毛滴虫的保守区设计的阴道毛滴虫引物和阴道毛滴虫TaqMan探针，以及根据白色念珠菌的保守区设计的白色念珠菌引物和白色念珠菌TaqMan探针。
2.根据权利要求I所述的引物和TaqMan探针，其特征在于所述阴道毛滴虫引物是SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2，所述阴道毛滴虫TaqMan探针是SEQ ID NO :3 ;所述白色念珠菌引物是SEQID NO :4和SEQ ID NO :5，并且所述白色念珠菌TaqMan探针是SEQ ID NO :6。
3.根据权利要求I所述的引物和Ta qMan探针，其特征在于所述阴道毛滴虫引物是SEQ ID N0:13和SEQ ID NO : 14，所述阴道毛滴虫TaqMan探针是SEQ ID N0:12，所述白色念珠菌引物是SEQ ID NO :4和SEQ ID NO :5，并且所述白色念珠菌TaqMan探针是SEQ IDNO :6。
4.根据权利要求1-3任一项所述的引物和TaqMan探针，其特征在于所述阴道毛滴虫TaqMan探针为经过突光标记的,其5’端标记有第一报告突光基团，3’端标记有淬灭突光基团；所述白色念珠菌TaqMan探针为经过荧光标记的，其5’端标记有第二报告荧光基团，3’端标记有淬灭荧光基团。
5.根据权利要求4所述的引物和TaqMan探针，其特征在于所述第一报告荧光基团为FAM，所述第二报告荧光基团为HEX，所述荧光淬灭基团为BHQ2。
6.一种用于检测阴道毛滴虫和白色念珠菌的双通道荧光PCR检测方法，所述方法包括以权利要求1-5任一项所述的引物和TaqMan探针进行实时荧光定量PCR的步骤。
7.根据权利要求6所述的双通道荧光PCR检测方法，其特征在于所述实时荧光定量PCR反应条件为先逆转录50°C 30min ;然后预变性95°C 5min ;最后扩增95°C 5sec,55°C 40sec，共 40 个循环。
8.根据权利要求6所述的双通道荧光PCR检测方法，其特征在于当所述阴道毛滴虫TaqMan探针以FAM标记且所述白色念珠菌TaqMan探针以HEX标记时，在每个循环的延伸结束时收集FAM和HEX荧光信号。
9.一种用于对阴道毛滴虫和白色念珠菌进行荧光PCR检测的试剂盒，所述试剂盒包括权利要求I 一 5任一项所述的引物和TaqMan探针。
10.权利要求9的试剂盒，还包括DNA聚合酶、逆转录酶、缓冲液和无菌水。
全文摘要
本发明涉及用于对阴道毛滴虫和白色念珠菌进行双通道荧光检测的引物和TaqMan探针，所述引物和TaqMan探针是根据阴道毛滴虫的保守区设计的阴道毛滴虫引物和阴道毛滴虫TaqMan探针，以及根据白色念珠菌的保守区设计的白色念珠菌引物和白色念珠菌TaqMan探针，用以同时一次性检测待测样品中是否存在阴道毛滴虫RNA和白色念珠菌DNA。本发明还涉及使用所述引物和TaqMan探针进行检测的方法和包含所述引物和TaqMan探针的试剂盒。
文档编号C12N15/11GK102719529SQ201210136748
公开日2012年10月10日 申请日期2012年5月4日 优先权日2012年5月4日
发明者刘巨波, 张陆明, 张颖, 熊丽娟 申请人:辽宁科骏生物有限公司