专利名称：检测绵羊无浆体的试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种用于检测动物血液病原菌的试剂盒。确切讲本发明涉及一种用于检测绵羊无浆体的试剂盒。
背景技术：
绵羊无衆体(A naplasma ovis)是立克次体目(Rickettsiales)、无衆体科(Anaplasmataceac)中的无衆体属(Anaplasma)的一个重要成员，Schellase等人于1912年首先报道在东非发现了绵羊无浆体，绵羊无浆体有广泛的宿主，已经证明它能寄生于绵羊、山羊、马鹿、白尾鹿、羚羊和大角羊等反刍动物的体内，绵羊无浆体经节肢动物-蜱传播后寄生于宿主动物的红细胞内，引起以发热、贫血、黄疸、衰弱和渐进性消瘦为特征的一类血液细菌疾病，即羊无浆体病，急性发病时也可造成动物死亡。该病在世界各地广泛流行，在我国许多地区也时有发生，尤其是在某些牧区，严重阻碍了畜牧业的发展。因此，建立快速、灵敏、准确又操作方便的检测方法十分必要。目前常用的诊断方法为血涂片染色法，但在感染率很低或在感染早期时很难在显微镜下检查出病原，而且操作熟练程度将直接影响诊断结果的准确性。还有很多血清学方法，但都存在一定的假阳性或假阴性以及交叉反应。分子生物学诊断方法有套式PCR检测方法，参见李树清，王贵强，陈志飞等，利用套式PCR检测牛羊乏质体，畜牧兽医学报，2011. 42 (12) : 1768-1775，但套式PCR检测过程中容易造成环境污染。
发明内容
本发明提供一种检测绵羊无浆体的试剂盒，应用这种检测试剂盒进行检测可克服现有技术不足。本发明的检测绵羊无浆体的试剂盒内至少有如下的三条引物探针序列正向引物SEQ Ns 1，反向引物SEQ No 2和探针SEQ Na 3，其中的探针序列的5端结合有荧光发光基团FAM，3端结合有荧光猝灭基团BHQl。为方便使用，在本发明的检测绵羊无浆体的试剂盒中还包括有如下成分荧光定量PCR反应液、标准阳性质粒模板pGEM-Teasy-gltA、阴性质控标准品。其中的荧光定量PCR反应液可以是由Premix Ex Taq (2X) 12. 5 μ L，10 μ M的正向引物SEQ Ns I和
10μ M 的反向引物 SEQ Ns 2 各 0.5 μ L，荧光探针溶液(5 μ Μ) 1.0 μ L，ROX Reference Dye
11(50X)0.5yL，灭菌蒸馏水8.0yL组成。另外，本发明检测绵羊无浆体的试剂盒中的标准阳性质粒模板pGEM-Teasy-gltA为由正向引物SEQ Ns 4和反向引物SEQ Na 5扩增的DNA片段构建的PGEM-Teasy重组质粒；而阴性质控标准品可以是灭菌蒸馏水。本发明实际上是一种利用gltA基因检测绵羊无浆体的实时荧光定量PCR方法。实时突光定量 PCR(real-time fluorescent quantitative polymerasechain reaction,real-time FQ-PCR)技术于1996年由美国Applied Biosystems公司推出，由于该技术不仅实现了 PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR技术相比它所具有的特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、自动化程度高、速度快、全封闭反应等优点，使其很快成为科研、临床诊断的热点技术。目前，国内外均 未有检测绵羊无浆体实时荧光定量PCR方法的报道，本发明利用绵羊无浆体gltA基因作为实时荧光定量PCR检测靶基因，设计针对绵羊无浆体gltA基因的特异性引物和探针，从而提供了一种快速、灵敏、准确又操作方便的检测绵羊无浆体的方法，填补了技术空白。本发明中，通过对实时荧光定量PCR反应条条件的优化，使本发明具有良好的敏感性、特异性、重复性，其敏感性比常规PCR高100倍，可以用于绵羊无浆体的快速定量检测。
图I实时荧光定量PCR扩增动力学曲线。图2实时荧光定量PCR标准曲线。图3实时荧光定量PCR灵敏度试验。图4普通PCR检测方法电泳图。其中M 为 DNA 分子量标准 DL2000 ;1、2、3、4、5、6、7、8 分别为 I. O X IO7-L O X IO0 拷贝/μ L的质粒标准品；9为阳性对照；10为正常羊全血基因组；11为空白对照。图5实时荧光定量PCR特异性试验。图6实时荧光定量PCR批内重复性试验。图7实时荧光定量PCR批间重复性试验。
具体实施例方式本发明以下结合附图和实施例作详细说明。本发明的试剂盒中最主要的是如下的三条引物探针序列，即gltA-rtFl (正向引物)5，-AGGTACCGGGTATCGTTGCA-3，SEQ Na IgltA-rtRl (反向引物)5，-AGGTTTGGATCTGCCTCTGTGA-3，SEQ Na 2gltA-rtPb (荧光探针)5’ (FAM) -ACATTTACAGGCACACCTCTGGCATGC- (BHQl) 3，SEQNa 3其中的的荧光探针SEQ Ns 3的5端结合有荧光发光基团FAM，3端结合有荧光猝灭基团BHQ1。目的片段大小为73bp，这些引物和探针由生工生物工程(上海)有限公司合成。在具体应用时还需要有突光定量PCR反应液、标准阳性质粒模板pGEM-Teasy-gltA、阴性质控标准品。在本实施例中荧光定量PCR反应液由Premix ExTaqTM(2X)12·5μL，10μM的正向引物SEQN2 I 和 10 μ M 的反向引物 SEQ Ns 2 各 O. 5 μ L，荧光探针 SEQ Na 3 溶液(5 μ Μ) I. O μ L，荧光校正液 ROXReference Dye II (50 X) O. 5 μ L，灭菌蒸馏水8. 0μ L。本发明的试剂盒应用实例I.构建重组质粒标准品。(I)根据绵羊无衆体gltA基因序列，使用Primer premier 6.0和Oligo 7设计引物，目的片段大小为481bp，由生工生物工程(上海)有限公司合成。引物对序列为AOgltA-FlK 正向引物)5，-ATAGATGGCGATGAGGGTG-3，SEQ Na 4AOgltA-Rl2 (反向引物)5，-ATTCTGCTCGTGGTCTGC-3，SEQ Na 5
(2)以实验室保存的绵羊无浆体菌株DNA为模板进行扩增，采用50 μ L的PCR反应体系，反应条件为94°C预变性3min，然后94°C 30s,53°C 30s,72°C 30s，35个循环，72°C延伸5min。取5yL扩增产物用琼脂糖凝胶电泳鉴定。鉴定为阳性的PCR产物用琼脂糖凝胶回收纯化试剂盒(TaKaRa,大连)进行纯化回收,将回收产物连接到pGEM_Teasy载体(Promega,America)后转化到大肠杆菌感受态细胞JM-109 (TaKaRa，大连)中，进行蓝白斑筛选，挑取阳性克隆(白班)进行PCR和测序鉴定。(3)对鉴定为阳性的克隆提取质粒，使用NanoDrop 2000/2000C(ThermoScientific, America)超微量分光光度计测定质粒浓度,并将其换算成拷贝/ μ L,以此作为质粒标准品。将构建好的质粒标准品，系列稀释为终 浓度为I. OXlO8-L 0X10°拷贝/yL，再进行定量PCR扩增，定量PCR反应体系为25 μ L :Premix Ex Taq (2X) 12. 5 μ L，正向引物 SEQ Ns I 和反向引物 SEQNs 2(10μΜ)各 O. 5 μ L，荧光探针 SEQ Ns 3 (5 μ Μ) I. O μ L，ROXReference Dye II (50 X) 0. 5 μ L，DNA 模板 2 μ L，灭菌蒸馏水 8. 0 μ L。反应条件为95°C预变性30s，然后95°C 5s,58°C 15s、72°C 20s，40个循环。在每一循环的延伸温度结束时设定荧光信号采集点进行实时检测，每个模板浓度做3个重复，取平均值计算变异系数，实验均设阴性对照。所建立的实时荧光定量PCR动力学曲线和标准曲线参见图I和图2，模板量与对应的Ct值呈线性相关，相关系数为O. 999，扩增效率为98. 7%，标准曲线方程为y=-3. 351X+41. 83。实时荧光定量PCR方法特性分析。(I)敏感性分析取浓度I. OX IO7-L OX 10°拷贝/ μ L的质粒标准品进行灵敏度试验，结果显示实时荧光定量PCR方法最低检出限为IO1拷贝/ μ L (图3)，而普通PCR的最低检出限为IO3拷贝/ μ L (图4)，比普通PCR检测方法灵敏度高100倍。(2)特异性分析利用本文所建立实时荧光定量PCR方法，分别检测了绵羊无浆体、边缘无浆体、牛无浆体、嗜吞噬细胞无浆体、支原体、衣原体、螺旋体、羊巴贝斯虫、羊泰勒虫，结果显示只有绵羊无浆体呈阳性反应，其他病原体均呈阴性(图5)。(3)稳定性分析取浓度为1.0Χ IO6-L O X IO1拷贝/ μ L的5个浓度的标准品进行稳定性分析。先进行批内重复性试验(图6)，对同一批次稀释的标准品，每个浓度重复检测四次，经分析Ct值变异系数在O. 26% -O. 97%，小于5%。然后进行批间重复性试验(图7)，对3个不同批次的稀释的标准品进行检测，经分析Ct值变异系数在O. 42%-I. 5%,小于10%。由此说明本发明具有较好的稳定性。表一批内重复性试验结果
权利要求
1.检测绵羊无浆体的试剂盒，其特征在于试剂盒至少有如下的三条引物探针序列正向引物SEQ Ns 1，反向引物SEQ Ns 2和探针SEQ Na 3，其中的探针序列的5’端结合有荧光发光基团FAM，3’端结合有荧光猝灭基团BHQl。
2.权利要求I所述的检测绵羊无浆体的试剂盒，其特征在于试剂盒中还包括有如下成分荧光定量PCR反应液、标准阳性质粒模板pGEM-Teasy-gltA、阴性质控标准品。
3.权利要求2所述的检测绵羊无浆体的试剂盒，其特征在于荧光定量PCR反应液由Premix Ex Taq (2 X) 12. 5 μ L，10 μ M 的正向引物 SEQ Ns I 和 10 μ M 的反向引物 SEQ Ns 2 各O. 5 μ L，5 μ M 的荧光探针 SEQ Na 3 溶液 l.OyL，ROX Reference Dye II (50 X) O. 5 μ L，灭菌蒸馏水8. OyL组成。
4.权利要求3所述的检测绵羊无浆体的试剂盒，其特征在于所述标准阳性质粒模板pGEM-Teasy-gltA为由正向引物SEQ Ns 4和反向引物SEQ Ns 5扩增的DNA片段构建的pGEM-Teasy重组质粒。
5.权利要求4所述的检测绵羊无浆体的试剂盒，其特征在于阴性质控标准品为灭菌蒸馏水。
全文摘要
本发明公开一种用于检测绵羊无浆体的试剂盒。本发明的检测绵羊无浆体的试剂盒内至少有如下的三条引得物探针序列正向引物SEQ№1，反向引物SEQ№2和探针SEQ№3，其中的探针序列的5端结合有荧光发光基团FAM，3端结合有荧光猝灭基团BHQ1。本发明应用是一种利用gltA基因检测绵羊无浆体的实时荧光定量PCR方法。
文档编号C12Q1/06GK102634597SQ20121013723
公开日2012年8月15日 申请日期2012年5月4日 优先权日2012年5月4日
发明者刘志杰, 李有全, 杨吉飞, 殷宏, 罗建勋, 迟庆安, 马米玲 申请人:中国农业科学院兰州兽医研究所