专利名称：来自辣椒疫霉菌的果胶裂解酶pcpel20及其编码基因与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种果胶裂解酶及其编码基因与应用，特别涉及来自辣椒疫霉菌的果胶裂解酶及其编码基因与应用。
背景技术：
辣椒疫病(Pepper Phytophthora Blight)是在世界范围内普遍发生的一种毁灭性病害。引起该病的病原为Phytophthora capsici Leonian,属卵菌门(Oomycetes),霜霉目(Peronosporales),腐霉科(Pythiaceae),疫霉属(Phytophthora)。病原菌通常以菌丝体、厚垣孢子及卵孢子在病株残体、土壤内越冬，也可以在其它寄主植物上越冬，成为第二年初侵染源。条件适宜时，越冬后的病原随灌水、气流等传到寄主各部位，引起发病，进行再 侵染。在发病季节，一般病株率为20%左右，严重的达到80%以上。近年来，随着辣椒在各主产区的连茬种植，病害有逐渐加重的趋势，危害较为显著。该病原菌除危害辣椒外，也可侵染番茄、茄子、黄瓜、西瓜、南瓜等作物，对生产威胁极大。植物病原卵菌与寄主互作过程中分泌多种重要的细胞壁降解酶或致病酶，其中比较重要的三类细胞壁降解酶为以下三种(I)聚半乳糖醒酸酶(polygalacturonase, PG)能分解半乳糖醒酸中的a_l, 4糖苷键。(2)果胶甲基酯酶(pectin methylesterase, PME)可促使果胶脱酯,生成果胶酸。(3)果胶裂解酶(pectate lyase, PL)由β消去反应裂解a_l，4糖苷键，在反应产物的非还原端残基C-4和C-5之间产生一个双键。可裂解高度酯化的果胶，能迅速降低粘度。上述三类细胞壁降解酶均属于果胶酶。果胶酶是指能够分解果胶物质的多种酶的总称。果胶物质在自然界中分布非常广泛，它是植物体中一类复杂的，胶体性质糖类，是天然的高分子化合物，分子量约50000-300000。它是植物细胞壁的重要组成成分，主要存在于细胞壁的中间层，初生壁也有一部分，而次生壁则很少有果胶物质存在。在世界范围内，植物病原卵菌易导致多种植物的病害，给农业生产造成了严重的损失。辣椒疫霉病是一种重要的卵菌病害，能导致多种植物发生严重病害，深入开展辣椒疫霉菌(Phytophthora capsici)果胶裂解酶基因分离及祀标基因编码的蛋白制作和功能分析具重要的实践意义，可以实现对于植物病原卵菌所导致的多种植物病害的防治与研究。而且，果胶裂解酶可用于食品加工，如在果汁和酒的生产中，果胶裂解酶可用于增加果汁的产量，便于加压和过滤，而且可以提高果汁和酒的透明度。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种果胶裂解酶。本发明所提供的果胶裂解酶，名称为PCPEL20，来源于辣椒疫霉菌(Phytophthoracapsici) SD33,是如下 a)或 b)或 c)的蛋白质a)由序列表中序列2第22-297位所示的氨基酸序列组成的蛋白质；b)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；c)将序列表中序列2所示的氨基酸序列或序列2第22-297位所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有果胶裂解酶活性的由a)衍生的蛋白质。其中，序列表中序列2由297个氨基酸残基组成，第1-21位氨基酸组成信号肽。a)所述的蛋白质是果胶裂解酶的成熟蛋白，b)所述的蛋白质是果胶裂解酶的前体蛋白。为了使上述(a)中的蛋白便于纯化，可在由序列表中序列2所示的氨基酸序成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表I所示的标签。表I标签的序列
权利要求
1.ー种蛋白，是如下a)或b)或c)的蛋白质 a)由序列表中序列2第22-297位所示的氨基酸序列组成的蛋白质； b)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质； c)将序列表中序列2所示的氨基酸序列或序列2第22-297位所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有果胶裂解酶活性的由a)衍生的蛋白质。
2.编码权利要求I所述蛋白的核酸分子。
3.根据权利要求2所述的核酸分子，其特征在于所述核酸分子为如下I)或2)或3)或4)所示的基因 1)其编码序列是序列表中序列I的第64-894位核苷酸的DNA分子； 2)其编码序列是序列表中序列I的第1-894位核苷酸的DNA分子； 3)在严格条件下与I)或2)限定的DNA分子杂交且编码权利要求I所述蛋白的DNA分子; 4)与I)或2)限定的DNA分子具有90%以上的同源性且编码权利要求I所述蛋白的DNA分子。
4.下述I)-4)中的任ー种生物材料 1)含有权利要求2或3所述核酸分子的表达盒； 2)含有权利要求2或3所述核酸分子的重组表达载体； 3)含有权利要求2或3所述核酸分子的重组微生物； 4)含有权利要求2或3所述核酸分子的转基因细胞系。
5.制备权利要求I所述蛋白质的方法，包括将权利要求I所述的蛋白质的编码基因在生物细胞中进行表达得到权利要求I所述蛋白质的步骤；所述生物细胞为微生物细胞、植物细胞或非人动物细胞。
6.制备表达权利要求I所述蛋白质的重组微生物的方法，包括将权利要求I所述的蛋白质的编码基因导入宿主微生物细胞，得到表达权利要求I所述蛋白质的重组微生物的步骤。
7.权利要求I所述的蛋白质在作为果胶裂解酶中的应用。
8.权利要求2或3所述的核酸分子或权利要求4所述的生物材料在制备果胶裂解酶中的应用。
9.权利要求I所述的蛋白质在降解植物细胞壁中的应用。
10.权利要求I所述的蛋白质在降解果胶中的应用。
全文摘要
本发明公开了来自辣椒疫霉菌的果胶裂解酶PCPEL20及其编码基因与应用。本发明所提供的果胶裂解酶PCPEL20，是如下a)或b)或c)的蛋白质a)由序列表中序列2第22-297位所示的氨基酸序列组成的蛋白质；b)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；c)将序列表中序列2所示的氨基酸序列或序列2第22-297位所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有果胶裂解酶活性的由a)衍生的蛋白质。果胶裂解酶PCPEL20具有较高的酶活性，其比活力达29±0.2U/mg蛋白，可用于食品加工，如在果汁和酒的生产中。
文档编号C12N9/88GK102676488SQ20121014054
公开日2012年9月19日 申请日期2012年5月8日 优先权日2012年5月8日
发明者张修国 申请人:山东农业大学